Informație

Care este viața circuitelor genetice fără celule?

Care este viața circuitelor genetice fără celule?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Pot fi testate circuitele genetice într-un mediu fără celule? Care ar fi viața lor dacă le ținem la temperatura camerei?

Circuitele care sunt compuse din componente bazate pe ADN sunt denumite în mod obișnuit circuite genetice. Prin testare, am vrut să spun să-i testez comportamentul, adică aplicarea semnalelor de intrare (poate proteine) pentru a vedea dacă generează un semnal de ieșire (o altă proteină, poate fi o proteină fluorescentă).

Prin viață, am vrut să spun, cât de mult poate supraviețui un astfel de circuit (conținând șiruri de ADN) la temperatura normală a camerei.


Biologie sintetică fără celule: Inginerie într-o lume deschisă

Biologia sintetică fără celule apare ca o tehnologie puternică și flexibilă care poate crea părți și sisteme biologice pentru aplicații în știința vieții fără a utiliza celule vii. Oferă soluții de inginerie mai simple și mai rapide, cu o libertate de proiectare fără precedent într-un mediu deschis decât sistemul celular. Această revizuire se concentrează pe evoluțiile recente ale biologiei sintetice fără celule în domeniile ingineriei biologice la nivel molecular și celular, inclusiv ingineria proteinelor, ingineria metabolică și ingineria celulară artificială. În ingineria proteinelor fără celule, controlul direct al condițiilor de reacție în sistemul fără celule permite sinteza ușoară a proteinelor complexe, proteinelor toxice, proteinelor membranare și proteinelor noi cu aminoacizi nenaturali. Sistemele fără celule oferă capacitatea de a proiecta căi metabolice către producerea produselor dorite. Acumularea de celule artificiale bazate pe sisteme fără celule ne va îmbunătăți înțelegerea vieții și le va folosi pentru aplicații de mediu și biomedicale.


De când s-a descoperit că nivelul ionilor de calciu din interiorul unei celule poate oscila (Woods et al., 1986), biologii au fost intrigați de natura periodică a multor semnale celulare. În timp ce începem încet să înțelegem numeroasele și variatele roluri pe care le joacă aceste oscilații periodice în comunicarea celulară, rămâne o întrebare deschisă: cum sunt rețelele de gene capabile să genereze oscilații susținute? Acum, în eLife, Sebastian Maerkl și colegii de muncă – inclusiv Henrike Niederholtmeyer și Zachary Sun ca primi autori comuni – raportează că au folosit o abordare de biologie sintetică pentru a dezvălui modul în care circuitele genice simple pot produce oscilații robuste în celule (Niederholtmeyer et al., 2015).

Inițial, s-a susținut că oscilațiile periodice ale nivelului ionilor de calciu și ale altor componente celulare nu au avut niciun rol în semnalizare, dar zeci de ani de cercetare au arătat că semnalele periodice sunt mai bune la transmiterea informațiilor decât semnalele neperiodice (Rapp, 1987 Behar și Hoffman). , 2010 Purvis și Lahav, 2013 Levine și colab., 2013). Ambele tipuri de semnal pot codifica informații în dimensiunea (amplitudinea) semnalului, dar frecvența și faza semnalelor periodice pot codifica și informații. Ca rezultat, semnalele periodice pot fi capabile să regleze procesele celulare complexe mai precis decât semnalele neperiodice. Este important că progresele recente în analiza unicelulară și optogenetică au dus la numeroase studii aprofundate care dezvăluie modul în care evenimentele critice, cum ar fi determinarea destinului celular și comunicarea multicelulară, sunt controlate de semnale periodice (revizuirea lui Sonnen și Auleha, 2014). descrie alte exemple).

Analiza matematică arată că un element esențial al unui circuit oscilant este o buclă de feedback inhibitor: dacă activitatea unei gene într-o astfel de buclă de feedback crește, se activează alte gene din circuit care, în cele din urmă, o inhibă (Rapp, 1987 Novak și Tyson, 2008). Purcell și colab., 2010). Această buclă de feedback trebuie să aibă o întârziere încorporată pentru a permite activităților genelor din circuit să fluctueze în cicluri regulate.

Creșterea biologiei sintetice a făcut posibilă proiectarea și construirea de rețele sintetice în celulele vii care îndeplinesc un rol specific. Într-un exemplu timpuriu al acestui lucru, cercetătorii de la Princeton au raportat că au construit o rețea de gene oscilatorii în E coli bazat pe o rețea ciclică de trei gene numită represilator (Elowitz și Leibler, 2000 Figura 1). Teoria prezice că represilatorul și alte oscilatoare inelare care au un număr impar de gene (noduri) ar trebui să fie capabile să producă oscilații susținute. Cu toate acestea, deoarece proiectarea, construirea și testarea noilor rețele de gene în celulele vii este un proces îndelungat, oscilatorii inelari cu mai mult de trei noduri nu au fost raportați.

Rețele de gene sintetice care conțin trei, patru și cinci gene.

Genele din fiecare circuit (sus) sunt traduse în produse proteice, fiecare produs proteic reprimând activitatea unei alte gene din rețea (așa cum este indicat de săgeți). Teoria prezice că rețelele ciclice de gene prezintă un comportament oscilator atunci când numărul de noduri din rețea este impar. Niederholtmeyer și colab. a descoperit că un circuit format din trei gene a dat naștere la oscilații bine definite cu o perioadă de până la 8 ore și că un circuit care conține cinci gene a oscilat cu o perioadă de 19 ore. În contrast, și în conformitate cu predicțiile teoretice, o rețea formată din patru noduri nu a oscilat: în schimb, a atins o stare de echilibru în care activitatea tuturor genelor a fost constantă în timp.

Acum, Maerkl și colegii – care au sediul la École Polytechnique Fédérale de Lausanne și la Institutul de Tehnologie din California – au realizat arhitecturi inelare care conțin trei, patru și cinci gene (Figura 1). Ei și-au construit circuitele genetice prototip într-un sistem fără celule, combinând reactoare cu flux microfluidic cu extracte din bacterii E. coli (Niederholtmeyer și colab., 2013 Noireaux și colab., 2003). Avantajul major al acestei abordări este că scade semnificativ timpul necesar pentru fiecare ciclu de proiectare-construcție-test, deoarece elimină nevoia de diverse sarcini laborioase, cum ar fi clonarea moleculară și colectarea măsurătorilor de la celule individuale.

Folosind această strategie Niederholtmeyer, Sun și colab. au putut confirma predicția că oscilatorii cu trei sau cinci noduri sunt capabili să genereze oscilații, în timp ce oscilatorii cu patru noduri nu sunt. Perioada oscilatorului cu cinci noduri este de aproximativ două ori mai lungă decât a oscilatorului cu trei noduri, ceea ce indică faptul că celulele pot regla periodicitatea semnalelor prin creșterea complexității circuitelor lor genetice. Apoi, cercetătorii și-au transferat modelele lor prototipuri în living E coli celule și a arătat că perioada de oscilație în celule se potrivea cu perioada de oscilație în sistemele fără celule. Acesta este un rezultat important, deoarece arată că sistemele fără celule pot fi utilizate pentru a surprinde cu exactitate comportamentul celulelor, ceea ce deschide calea pentru ca cercetătorii să utilizeze abordări de biologie sintetică în sistemele fără celule pentru a explora mecanismele complexe de reglementare care funcționează în interiorul celulelor. (van Roekel et al., 2015). Cele mai recente lucrări ar trebui, de asemenea, să accelereze foarte mult construirea de noi rețele complexe de gene în bacterii, care ar putea avea aplicații în producția de biocombustibili, diagnosticare medicală și experimente pentru a explora modalitățile prin care celulele procesează informațiile.


Vizualizarea circuitelor genetice în spațiu și timp, cu traducere fără celule pe hârtie

Suntem o pereche de oameni de știință de la Laboratorul de Biologie Moleculară a Consiliului de Cercetare Medicală (MRC LMB), care sunt pasionați de a ajuta studenții să învețe despre știința modernă.

Biologia sintetică este deosebit de interesantă pentru noi, deoarece lucrăm amândoi în fruntea acestui domeniu și apreciem modul în care biologia s-a transformat într-o disciplină inginerească, în care învățăm despre viață prin construirea de sisteme biologice. Același principiu, adică învățarea biologiei făcând-o, este foarte eficient pentru studierea conceptelor complexe în școli. Cu toate acestea, efectuarea de experimente moderne de biologie sintetică în sala de clasă este o activitate costisitoare, din cauza reactivilor, mediilor, bacteriilor și instrumentelor de laborator necesare, ca să nu mai vorbim de sarcina de documente a confruntării cu organismele modificate genetic.

Credem că predarea științei moderne poate fi accesibilă, ieftină și simplă. Nu suntem singuri în asta și există dezvoltări semnificative care au fost realizate de Amino Labs, Cell-free tech și Biobits, care urmăresc același obiectiv ca și noi: să facă știința de ultimă oră accesibilă și accesibilă. Am ales să lucrăm cu sistemul de transcripție-traducere fără celule (TXTL), deoarece este ieftin de făcut, nu este nevoie de reglementări de siguranță și sunt foarte personalizabile: singurul lucru de care aveți nevoie este un construct genetic.

Scopul nostru este de a preda studenților principiile controlului genetic, fundamentul biologiei sintetice. Primul lucru care ne-a frapat a fost ușurința cu care copiii studiază circuitele electrice conectând direct piesele electrice în lanțuri și experimentând cu ele. Am vrut să reiterăm această logică pentru biologie. Din fericire, principiile majore ale reglării genetice au fost deja stabilite, având în vedere inginerie electrică singura piesă de puzzle care lipsește: conectarea lor fizică pe o placă.

Figura A: Sistem de transcriere-traducere fără celule (TXTL) folosind hârtie de filtru

TXTL este menit să fie un amestec magic care produce practic orice parte genetică (cum ar fi proteina fluorescentă verde sau ARN polimeraza T7). Ca suport material în care este conținută reacția, am ales o hârtie de filtru. Ideea a fost de a transforma aceste bucăți de hârtie în module funcționale prin exprimarea proteinelor în ele. Prin urmare, conectarea ulterioară a bucăților de hârtie va permite proteinelor exprimate să se deplaseze de la o bucată de hârtie la alta cu fluxul de apă (Fig.A).

În cele din urmă, o proteină exprimată într-un modul poate afecta reacția în celălalt. Această configurație experimentală simplifică studierea circuitelor genelor, deoarece declanșatorii și produsele circuitului sunt separate fizic și, prin urmare, teoretic ar trebui să fie mai ușor să se ocupe de acest tip de sistem, spre deosebire de un amestec de cutie neagră în tub. De asemenea, posibilitățile sunt practic nelimitate, deoarece acest sistem este extrem de personalizabil și piesele pot fi conectate în orice mod care ar trebui să-i ajute pe copii să experimenteze cu materialul într-un mod neconstrâns.

Figura B: comparație a activității dintre amestecul comercial (Promega T7 high yield S30) și intern E coli amestec.

Proiectul a început cu producția de TXTL foarte activ E coli amestecuri. Pentru a ajuta alte laboratoare care au acces doar la echipamente de bază, am folosit un protocol ieftin și ușor de pregătire a extractelor celulare, astfel încât munca noastră să fie ușor de reprodus. Am pregătit extracte de celule fie în mod tradițional cu o presă franceză (Emulsiflex) și centrifugă de mare viteză, fie folosind o abordare mai ieftină și mai eficientă, folosind liza celulară cu ultrasunete și o centrifugă de masă răcită. Independent de protocolul pe care l-am folosit pentru pregătirea E coli lizat, activitatea a fost la egalitate cu amestecul comercial (Promega T7 randament mare S30) (Fig.B).

Figura c: Amestecurile TXTL arată mai active în soluție decât pe hârtie.

Provocările au început atunci când am încercat să rulăm reacția TXTL pe hârtie: amestecurile fără celule sunt întotdeauna active în soluție, omologul lor pe hârtie oferă doar un semnal scăzut care ar putea fi vizualizat doar cu instrumente scumpe și, prin urmare, nu a putut fi utilizat. în orice mediu cu resurse reduse (Fig.C).

Deocamdată, am găsit o alternativă viabilă care este potrivită pentru extindere: spre deosebire de liofilizarea TXTL pe hârtie, liofilizăm TXTL în tub. În mod surprinzător, amestecul de reacție a fost la fel de activ ca și cel inițial, iar conform rapoartelor anterioare componentele de reacție își păstrează activitatea timp de săptămâni și chiar luni. Astfel, ne propunem să folosim acest produs TXTL „la jumătate” în viitoarea activitate de vară. Cu toate acestea, bătălia nu s-a încheiat încă, acum ne-am îndreptat atenția către alte materiale suport, cum ar fi agaroza, care nu interferează cu TXTL, este ieftină, poate fi liofilizată și poate fi turnată sub orice formă.


Fabricarea de medicamente

Un alt domeniu activ în cercetarea CFS este biofabricarea produselor terapeutice și a altor reactivi pe bază de proteine. Sistemele biologice naturale au dezvoltat o capacitate remarcabilă de a sintetiza o varietate de molecule, de la metaboliți la biopolimeri. Sistemele de exprimare a proteinelor fără celule permit încorporarea unor astfel de reacții într-un proces extrem de controlat care permite producerea de molecule după cum este necesar și în teren. Accentul nostru principal aici va fi pe un subset de biopolimeri, și anume proteinele terapeutice. Munca în curs de desfășurare în acest domeniu se bazează pe decenii de cercetare care au condus la sistemele productive și practice disponibile în prezent [28, 29, 36,37,38, 40]. Progresele recente în tehnicile de pregătire cu randament ridicat [40, 45] și în dezvoltarea sistemelor care pot utiliza surse de energie mai economice [64, 65] au făcut ca CFS să fie extrem de accesibil. Între timp, se fac progrese semnificative către rezolvarea diferitelor probleme de pliere a proteinelor și a deficiențelor în modificările post-translaționale [66] asociate cu CFS tradițional. Progresele recente au arătat potențialul de extindere a reacțiilor fără celule, unii au demonstrat că volume de reacție ajung la 100 de litri [67, 68] până la 1000 de litri [69]. Expresia fără celule a fost folosită ca platformă pentru producerea unei game largi de potențiale terapeutice, dintre care unele au fost rezumate în Tabelul 1. Un număr dintre aceste produse au fost validate pe modele animale [49, 76].

Au fost urmărite două moduri principale de CFS. Primul, folosit de eforturi comerciale precum Sutro [94], se concentrează pe producția mare, centralizată. Această abordare valorifică avantajele sintezei în afara celulei pentru bioproducție. Pentru aceste aplicații, CFS nu numai că permite producția rapidă, dar și accelerează semnificativ procesul de dezvoltare a medicamentelor [95]. În mod remarcabil, Sutro și-a crescut producția fără celule la un incredibil de 1000 de litri [69], arătând scalabilitatea producției centralizate fără celule. Al doilea mod utilizează sisteme FD-CF pentru a descentraliza capacitatea de bioproducție pentru producția de medicamente în loturi mici, cu aplicații în sănătatea globală și răspunsul la urgențe [49, 73, 96, 97]. Folosind acest mod de producție, am demonstrat recent capacitatea de dovadă a conceptului de a produce peste 50 de reactivi terapeutici și de laborator, inclusiv proteine ​​(de exemplu, vaccinuri, anticorpi și peptide antimicrobiene) și molecule mici [49], cu aplicații în afara cadrul de laborator.

Biofabricarea fără celule este deosebit de potrivită pentru producția de vaccin datorită potențialului său de extindere rapidă ca răspuns la urgențele de sănătate publică. Exprimarea cu succes fără celule a unui număr de vaccinuri recombinate (de exemplu, botulinum, difterie, antrax) a fost demonstrată [49, 86,87,88,89,90, 98], unele fiind validate pe modele animale, cum ar fi şoareci [49, 90]. Având în vedere cerințele de doză mică (interval de micrograme) pentru multe dintre aceste medicamente, comercializarea vaccinurilor derivate din CFS va avea probabil o creștere rapidă în următorii ani. Producerea de anticorpi a fost, de asemenea, un domeniu de interes pentru comunitatea fără celule [20, 49, 51, 74,75,76,77,78,79,80, 99, 100]. Datorită dimensiunii lor compacte și nivelurilor de expresie relativ ridicate în CFS, anticorpii cu un singur domeniu au atras o atenție deosebită și par bine plasați strategic pentru a servi nevoilor emergente în medicina personalizată, adică pentru terapie și diagnosticare.

Rezistența la antibiotice a fost recunoscută ca o amenințare majoră pentru sănătatea globală, ducând la aproximativ două milioane de îmbolnăviri și 23.000 de decese numai în SUA în fiecare an [101]. În consecință, producția fără celule de compuși antimicrobieni, inclusiv peptide antimicrobiene și medicamente cu molecule mici, a devenit punctul central al unor grupuri [49, 93]. Un număr de laboratoare au demonstrat, de asemenea, puterea CFS de a exprima fagii [56, 102,103,104]. Tendința ascendentă a cazurilor raportate de rezistență la antibiotice a condus la o reapariție a vederii terapiei cu fagi ca o alternativă potențial viabilă la regimurile antibiotice actuale [101, 105]. Utilizarea fagilor a fost, de asemenea, evaluată ca o strategie eficientă de tratament pentru o serie de boli ale plantelor, unii fagi fiind acum disponibili comercial pentru consum în masă [106]. Producția pe bază de CFS a acestor antimicrobiene netradiționale ar putea juca un rol semnificativ în lupta împotriva crizei rezistenței la antibiotice și ar putea contribui, de asemenea, la îmbunătățirea securității alimentare pe tot globul.

Mai jos, vom evidenția unele dintre domeniile în care CFS a demonstrat un mare potențial pentru îmbunătățirea metodelor actuale de dezvoltare și fabricare a terapiei. Aceste progrese transformă rapid CFS într-o parte integrantă a ecosistemului de producție.

Proteinele membranare

În timp ce aproximativ 70% din toate medicamentele acționează asupra proteinelor membranare[107], lucrul cu aceste proteine ​​este notoriu dificil din cauza îmbogățirii lor în suprafețe hidrofobe. Expresia celulară a proteinelor membranare este adesea plină de provocări, cum ar fi toxicitatea cauzată de încorporarea lor în membrană sau incompatibilitatea lor cu fiziologia gazdei [108]. Recent, abordări fără celule au fost folosite pentru a aborda această categorie provocatoare de proteine, ale căror secvențe de codificare cuprind 20-30% din toate genele cunoscute [107]. În comparație cu metodele actuale bazate pe celule, CFS poate fi un instrument puternic în producerea de proteine ​​​​membranare active solubile [109]. Abilitatea de a integra pași care pot aborda aspectele provocatoare ale sintezei proteinelor membranare este deosebit de valoroasă. De exemplu, eforturile anterioare în sistemele bazate pe celule au demonstrat că imitațiile membranei pot fi utilizate cu succes pentru a sintetiza și stabiliza o gamă largă de proteine ​​​​membranare, cum ar fi receptorii cuplați cu proteina G [110, 111], receptorul factorului de creștere epidermic [71]. ], proteinele membranei virusului hepatitei C [112] și o ATP sintetază [109, 113]. Aceste mime includ surfactanți, lipozomi și nanodiscuri [114,115,116] și pot fi adăugate direct la CFS co-translațional sau post-translațional. Există, de asemenea, dovezi care sugerează că proteinele membranare funcționale cu un singur interval pot fi sintetizate pur și simplu în prezența unei interfețe ulei-apă (de exemplu, prin utilizarea emulsiilor) [117].

Producția macromoleculară

Cercetările moleculare au evidențiat importanța interacțiunilor proteină-proteină și a complexelor rezultate pe care aceste interacțiuni le pot genera. Fie că este vorba de studiul biofizic al acestor complexe sau ca vehicule pentru o nouă livrare terapeutică (de exemplu, schele asemănătoare virusurilor pentru vaccinuri), există o nevoie tot mai mare de a dezvolta instrumente robuste care vizează sinteza unor astfel de complexe. Ca și în cazul proteinelor membranare, CFS a demonstrat, de asemenea, randamente mai mari, în comparație cu strategiile in vivo, în producerea de ansambluri macromoleculare, cum ar fi particulele de tip virus (VLP) [109]. Lucrări inovatoare ale grupului Swartz, care demonstrează expresia fără celule a antigenului central al hepatitei B VLP (2 subunități) [91] într-un E colisistem fără celule, a deschis ușa altor cercetători care exprimă o varietate de ansambluri macromoleculare, inclusiv E coli ARN polimerază (5 subunități) [118] și o ATP sintază (25 subunități) [113]. Lucrările anterioare cu lizat de reticulocite au demonstrat, de asemenea, expresia fără celule a receptorului celulelor T umane (7 subunități) [119]. În mod remarcabil, un număr de bacteriofagi au fost acum exprimați cu succes în CFS, inclusiv fagul T4, care conține structural 1500 de proteine ​​din 50 de gene [56, 102,103,104] (Fig. 3).

Sinteza complexului proteic cu mai multe subunități în CFS. Diverse grupuri au demonstrat producerea de complexe proteice din ce în ce mai complicate. Acestea au inclus antigenul central al hepatitei B (HBc) VLP (2 subunități) [91], E coli ARN polimeraza (5 subunități) [118], receptorul celulelor T umane (7 subunități) [119], o ATP sintetază (25 subunități) [113] și fagul T4 (1500 subunități) [102,103,104]

Subunitățile neidentice ale unui complex proteic sunt adesea denumite subunități hetero. În unele cazuri, astfel de subunități hetero necesită co-traducere pentru a produce complecși activi [120]. Astfel, capacitatea CFS de a traduce simultan mai multe ARNm facilitează producerea de complexe active compuse dintr-un număr de subunități diferite [121]. Unele CFS, cum ar fi E colipreparatele pe bază de substanțe nu sunt, în general, capabile să producă proteine ​​care conțin legături disulfurice, care sunt esențiale pentru numeroase proteine ​​relevante din punct de vedere farmaceutic (de exemplu, anticorpi și multe citokine) [121]. Cu toate acestea, eforturile recente au sporit aceste sisteme pentru a permite producerea de proteine ​​complexe care necesită legături disulfurice multiple [85, 99, 122], extinzând gama de terapii care pot fi făcute în CFS.

Modificarea proteinelor și a tabelelor de codoni

Eficacitatea multor terapii pe bază de proteine ​​depinde de controlul precis asupra modificării naturale sau non-naturale a secvențelor lor peptidice. Una dintre cele mai convingătoare utilizări ale unor astfel de modificări este în dezvoltarea conjugatelor anticorp-medicament (ADC), care câștigă rapid favoarea ca o nouă clasă de terapii împotriva cancerului. Tehnicile clasice de conjugare au ca rezultat un amestec eterogen de anticorpi marcați datorită dependenței lor de conjugarea arbitrară cu mai multe lanțuri laterale de aminoacizi. Studii recente, totuși, sugerează că proprietățile farmacologice ale ADC-urilor ar putea fi îmbunătățite prin conjugarea specifică locului. Aminoacizii nenaturali oferă o cale eficientă pentru o astfel de conjugare specifică locului [123]. Până în prezent, încorporarea co-translațională a peste 100 de aminoacizi nenaturali diferiți a fost demonstrată in vivo [124], permițând o gamă largă de modificări [125,126,127,128,129]. Multe dintre aceste modificări au fost demonstrate în contextul fără celule pentru o varietate de aplicații, inclusiv imobilizarea controlată de orientare [92, 98] și funcționalizarea specifică locului (de exemplu, fosforilarea [130], PEGilarea [131] sau conjugarea medicamentului). [81]) [132,133,134].

Platformele CFS eludează unele dintre limitările de toxicitate și permeabilitate bazate pe celule și oferă un control mai mare și o versatilitate în efectuarea modificărilor proteinelor [109, 135]. Încorporarea aminoacizilor nenaturali în abordările bazate pe celule s-a bazat de obicei pe reutilizarea codonilor stop pentru a minimiza impactul negativ al recodării asupra viabilității celulare [109]. Într-un sistem fără celule, totuși, întreaga tabelă de codoni poate fi, teoretic, reprogramată, permițând nu numai încorporarea de aminoacizi nenaturali, ci și crearea unor tabele de codoni complet noi.

Dus la extrem, acesta din urmă ar putea ajuta la protecția proprietății intelectuale. Secvențele de ADN ar putea fi obscucate astfel încât să fie făcute nefuncționale în afara contextului lor specializat fără celule. Acest cod obscurcat ar face proiectele proprietare dificil de copiat. Ofuscarea codonilor ar putea pune, de asemenea, provocări serioase pentru detectarea secvențelor de ADN care pot fi folosite de entități răuvoitoare. De exemplu, companiile de sinteză a ADN-ului ar avea un timp mult mai dificil de screening împotriva secvențelor de ADN care ar putea fi utilizate pentru activități nefaste (de exemplu, bioterorism). Lucrări recente au arătat că dimensiunea tabelului de codoni poate fi, de asemenea, extinsă prin mărirea alfabetului genetic de patru litere cu perechi de baze nenaturale [136, 137]. Astfel, proteinele produse în CFS ar putea – cel puțin în teorie – să dețină un număr nelimitat de aminoacizi nenaturali.

CFS poate fi, de asemenea, folosit pentru a face modificări naturale la proteine. Un exemplu al acestora este altoirea zaharurilor (adică, glicani) denumită glicozilare. Producerea cu succes a multor substanțe terapeutice este adesea condiționată de o glicozilare extrem de eficientă, deoarece lipsa glicozilării adecvate poate reduce eficacitatea și timpul de înjumătățire în circulație a multor proteine ​​terapeutice [138]. Unele CFS (de exemplu, insecte, ovar de hamster chinezesc și sisteme pe bază de extract uman K562) sunt în mod inerent capabile de glicozilare. Cu toate acestea, repertoriul lor de structuri de glicani tinde să fie limitat la cele sintetizate în mod natural de tipul de celule sursă a lizatelor lor. În plus, glicozilarea în aceste sisteme necesită adesea recapitularea mecanismelor de trafic de proteine ​​ale celulei sursă [109]. Astfel, crearea căilor sintetice de glicozilare în CFS a devenit un domeniu de interes în ultimii ani [135, 139]. Succesul în acest domeniu va servi probabil ca un catalizator cheie în aducerea vaccinurilor produse fără celule și a altor medicamente pentru masă. Figura 4 subliniază unele dintre posibilele modificări ale proteinei în CFS.

Modificări ale proteinelor în CFS. Modificările posibile ale proteinei includ, dar nu se limitează la, glicozilarea, formarea de legături disulfură, acetilarea [140], fosforilarea [141] și PEGilarea [131] (care poate fi realizată prin utilizarea de aminoacizi nenaturali). Aminoacizii nenaturali pot fi utilizați și pentru conjugarea unei game largi de compuși, cum ar fi medicamentele (de exemplu, prin chimie prin clic) [81] sau moleculele fluorescente [142]. Figura adaptată după Pagel și colab. [143]

Evoluție dirijată

Evoluția direcționată este un instrument puternic pentru ingineria aptamerilor și proteinelor care utilizează runde iterative de mutageneză și selecție pentru a modifica sau regla proprietățile bimoleculare specifice (de exemplu, activitatea substratului unei enzime). Utilitatea aptamerilor sau proteinelor, într-un context dat, în ceea ce privește secvențele lor de nucleotide corespunzătoare este adesea descrisă ca un peisaj de fitness. Evoluția direcționată oferă o metodă masiv paralelă de căutare printr-un peisaj de fitness pentru a găsi variante optime și genotipurile lor corespunzătoare [144]. Acest lucru necesită, în general, maparea unu-la-unu a fenotipului la genotip. Deși celulele au o capacitate încorporată pentru o astfel de cartografiere datorită naturii lor compartimentate, utilizarea celulelor pentru a efectua o evoluție direcționată poate impune limite asupra dimensiunii bibliotecilor candidate analizate și restricționează tipul de solvenți, tampon și temperaturi care pot fi eșantionate. 145]. Ca rezultat, platformele de evoluție direcționată fără celule au câștigat favoarea [145], începând cu primele sisteme cu adevărat fără celule publicate la sfârșitul anilor 90 [146, 147]. Mai recent, conectarea fenotipului la genotip a fost realizată prin compartimentare artificială (de exemplu, folosind emulsie, microbile și lipozomi) [145, 148,149,150,151]. Aplicațiile au inclus proiectarea și optimizarea fragmentelor de anticorp Fab [77, 152], proteinelor membranare [151] și, așa cum vom discuta mai jos, descoperirea enzimelor [52].


Abstract

Rețelele de reglementare sintetice cu funcții prescrise sunt proiectate prin asamblarea unui set redus de elemente funcționale. De asemenea, le-am putea asambla computațional dacă modelele matematice ale acelor elemente funcționale ar fi suficient de predictive în contexte genetice diferite. Numai după ce vom realiza acest lucru vom avea biblioteci de modele de părți biologice capabile să ofere comportamente dinamice predictive pentru majoritatea circuitelor construite cu acestea. Avem astfel nevoie de instrumente care pot explora automat diferite contexte genetice, pe lângă faptul că putem folosi astfel de biblioteci pentru a proiecta circuite noi cu dinamică țintită. Am implementat un nou instrument, AutoBioCAD, care vizează proiectarea automată a circuitelor de reglare a genelor. AutoBioCAD încarcă o bibliotecă de modele de elemente genetice și implementează strategii de proiectare evolutivă pentru a produce (i) secvențe de nucleotide care codifică circuite cu dinamică țintită care pot fi apoi testate experimental și (ii) modele de circuite pentru testarea principiilor de reglare în sistemele naturale, oferind un nou instrument pentru biologie sintetică. AutoBioCAD poate fi folosit pentru a modela și proiecta circuite genetice cu comportament dinamic, datorită încorporării efectelor stocastice, robusteței, dinamicii calitative, optimizării multiobiective sau secvențe de nucleotide degenerate, toate facilitând legătura cu ingineria piesei/circuiturilor biologice.


Elemente de bază ale vieții, totul se află în gene

De Deborah Smith

Ce este esențial pentru viață? Nu mult, se pare. S-a dezvăluit săptămâna aceasta că unele bacterii - chiar dacă sunt mici - poartă în jur o mulțime de bagaje genetice suplimentare.

Doar 12% din ADN-ul unui microb obișnuit de apă dulce a fost necesar pentru supraviețuirea acestuia, au descoperit cercetătorii, după ce i-au eliminat pe celelalte 88%. Nu în mod neașteptat, aceste părți vitale ale codului genetic au inclus gene și alte segmente de ADN care pornesc și dezactivează genele.

'⟚r au fost multe surprize,'' un biolog de la Universitatea Stanford, Dr Lucy Shapiro, spune. '⟞ exemplu, am găsit 91 de segmente esențiale de ADN unde nu avem idee ce fac.''

Reducerea modelului genetic al unui organism până la cele mai elementare elemente esențiale face parte dintr-o nouă încercare de a înțelege mai bine viața și apoi de a o reproiecta.

Marea promisiune este capacitatea de a construi noi forme de viață artificiale, care pot rezolva multe dintre problemele lumii: curățarea scurgerilor de petrol și alți poluanți și producerea de alimente, combustibil, materiale plastice și medicamente.

Principiile formale de inginerie sunt cheia acestei căutări controversate, cunoscută sub numele de biologie sintetică, care este încă la început, spune dr. Jim Haseloff, expert australian în plante la Universitatea din Cambridge.

„Domeniul se află într-o situație similară cu cea a ingineriei mecanice la începutul anilor 1800 și a microelectronicii la începutul anilor 1950”, spune el.

În urmă cu două secole, inginerii mecanici au construit fiecare motor cu abur individual. Dar dezvoltarea pieselor standardizate, cum ar fi filetele șuruburilor în anii 1830 și construcția modulară, a condus la producția în masă a motoarelor din schițe.

Ingineria electrică a urmat o cale similară, cu dezvoltarea componentelor cheie, cum ar fi tranzistoarele și circuitele integrate, ducând la industria electronică internațională de astăzi. „Și acum aveți același tip de traiectorie care are loc în biologie”, spune dr. Haseloff.

La fel ca primii constructori de motoare, biologii au devenit foarte buni în a-și crea propriile organisme modificate genetic prin adăugarea uneia sau două gene la o plantă sau un microb.

Dar este nevoie de o revoluție în proiectarea noilor organisme dacă lumea vrea să scape de dependența de surse neregenerabile de energie și materiale, spune dr. Haseloff, care a susținut recent o conferință la Universitatea din Sydney.

Blocurile Lego dintr-o cutie de joacă pentru copii au oferit prima inspirație. În ultimii ani, oamenii de știință au creat o bibliotecă de mii de blocuri biologice standardizate. Aceste mici piese de schimb ADN pot fi folosite de orice cercetător pentru a asambla noi microbi care pot, de exemplu, să funcționeze la temperaturi mai ridicate, să absoarbă dioxid de carbon sau să se blocheze pe metale grele.

'ɾste o idee simplă. Dar este și o schimbare profundă în modul în care faci lucrurile - asemănătoare cu trecerea de la biologie la inginerie,'' Dr. Haseloff spune.

Cea mai recentă fază, mai sofisticată, implică construirea de circuite genetice complexe, formate din gene și proteine ​​care interacționează, pentru a controla comportamentul celular.

Circuitele naturale, de exemplu, direcționează celulele să crească, să se dividă, să producă un semnal sau să se transforme într-un tip diferit de celulă. Synthetic circuits might be able to be integrated with natural circuits to ''rewire'' cells and get a plant or microbe to produce the fuel, medicine or material that is desired.

Dr Haseloff is particularly interested in how to modify the shape of plants, by altering the number of cells that proliferate or change type during development, to increase the amount of certain tissues, such as fruit.

He points to the remarkable differences between the ancient, small tomatoes of Peru and the large, red juicy ones we enjoy today, achieved by traditional breeding. ''The question is whether you can rationally engineer and produce those changes [with synthetic circuits].''

Medical researchers have already begun to use synthetic biology techniques in the laboratory, to try to tackle infectious disease and cancer, researchers report this week in the journal, Ştiinţă.

For example, bacteria have been engineered to produce a protein that allows them to invade cancer cells, and to then produce a small piece of RNA that turns down the effect of a gene in the cell that stimulates colon cancer.

Concerns about synthetic biology focus on bioterror - the potential for development of new deadly microbes as weapons - and bioerror - their escape into the environment or unforseen harm to human health.

Some environmental groups have called for a moratorium on the science, but many researchers say the technology is an extension of genetic modification techniques widely used now. 'ɺnd we already have a very efficient framework of regulation and governance for these kinds of manipulations,'' Dr Haseloff says.


What is the life of cell-free genetic circuits? - Biologie

Store, Exchange, and Interact with Synthetic Biological Data

mv2.png/v1/fill/w_146,h_80,al_c,usm_0.66_1.00_0.01,blur_3/logo-cello-color.png" />

As synthetic biology techniques become more powerful, researchers are anticipating a future in which the design of biological circuits will be similar to the design of integrated circuits in electronics. Cello is a framework that describes what is essentially a programming language to design computational circuits in living cells. The circuits generated on plasmids expressed in Escherichia coli required careful insulation from their genetic context, but primarily functioned as specified. The circuits could, for example, regulate cellular functions in response to multiple environmental signals. Such a strategy can facilitate the development of more complex circuits by genetic engineering.

Cello converts electronic design specifications of combinational logic to complete DNA sequences encoding transcriptional logic circuits that can be executed in bacterial cells. A database of transcriptional repressors characterized in the Voigt lab provide genetic NOT gates and NOR gates that can be composed into any logic function.

The automated workflow and in-house genetic gates will make circuit design more reproducible and broadly accessible to biological engineering labs.

Generates a Boolean circuit as a Directed Acyclic graph from an HDL specification (Verilog).

Uses a database of second-generation genetic logic gates whose transfer functions are insulated from promoter context.

Allows users to upload custom UCF (User Constraint file) files.

Searches for the optimal assignment of transcriptional repressors to NOT/NOR gates by signal matching with the experimentally measured transfer functions.

Offers a wide range of assignment algorithms including Simulated annealing (default), Hill climbing, Breadth first search, Random permutations,etc.

Generates histograms for predicted gate REU for each row of the truth table for the best genetic circuit assignment.

Generates multiple plasmid versions using the Eugene language for constrained combinatorial enumeration of transcriptional unit orders and orientations.

Allows external applications to connect to Cello using a REST API.

Life Technologies (a Thermo Fisher brand): A114510

Office of Naval Research: Multidisciplinary University Research Initiative grant N00014-13-1-0074

Siebel Scholarship: Class of 2015

Air Force Office of Scientific Research: National Defense Science and Engineering Graduate fellowship FA9550-11-C-0028


Synthetic biologists extend functional life of cancer fighting circuitry in microbes

Bioengineers at the University of California San Diego have developed a method to significantly extend the life of gene circuits used to instruct microbes to do things such as produce and deliver drugs, break down chemicals and serve as environmental sensors.

Most of the circuits that synthetic biologists insert into microbes break or vanish entirely from the microbes after a certain period of time -- typically days to weeks -- because of various mutations. But in the September 6, 2019 issue of the journal Ştiinţă, the UC San Diego researchers demonstrated that they can keep genetic circuits going for much longer.

The key to this approach is the researchers' ability to completely replace one genetic-circuit-carrying sub-population with another, in order to reset the mutation clock, while keeping the circuit running.

"We've shown that we can stabilize genetic circuits without getting into the business of fighting evolution," said UC San Diego bioengineering and biology professor Jeff Hasty, the corresponding author on the study. "Once we stopped fighting evolution at the level of individual cells, we showed we could keep a metabolically-expensive genetic circuit going as long as we want."

The circuit the UC San Diego researchers used in the Ştiinţă study is one that this team, and others, are actively using to develop new kinds of cancer therapies.

"As synthetic biologists our goal is to develop gene circuits that will enable us to harness microorganisms for a wide range of applications. However, the reality today is that the gene circuits we insert into microbes are prone to fail due to evolution. Whether it be days, weeks, or months, even with the best circuit-stabilization approaches, it's just a matter of time. And once you lose functionality in your genetic circuit, there is nothing to do but start over," said Michael Liao, a UC San Diego bioengineering PhD student and the first author on the Ştiinţă paper. "Our work shows there is another path forward, not just in theory, but in practice. We've shown that it's possible to keep circuit-busting mutations at bay. We found a way to keep hitting reset on the mutation clock."

If the team's method can be optimized for living systems, the implications could be significant for many fields, including cancer therapy, bioremediation, and bioproduction of useful proteins and chemical components.

Rock Paper Scissors

To actually build a "reset button" for the mutation clock, the researchers focused on dynamics between strains of microbes, rather than trying to hold selective pressures at bay at the level of individual cells. The researchers demonstrated their community-level engineering system using three sub-populations of E. coli with a "rock-paper-scissors" power dynamic. This means that the "rock" strain can kill the "scissors" strain but will be killed by the "paper" strain.

Most published work tends to focus on stabilization strategies that act at the level of single cells. While some of these approaches may be sufficient in a given therapeutic context, evolution dictates that single cell approaches will naturally tend to stop working at some point. However, since the rock-paper-scissors (RPS) stabilization acts at a community level, it can also be coupled with any of the systems that act on a single cell level to drastically extend their lifespan.

Making Cancer Drugs and Delivering them to Tumors

In 2016 in Natură, UC San Diego researchers led by Hasty, along with colleagues at MIT, described a "synchronized lysis circuit" that could be used to deliver cancer-killing drugs that are produced by bacteria that accumulate in and around tumors. This led the UC San Diego group to focus on the synchronized lysis platform for the experiments published in Ştiinţă.

These coordinated explosions only occur once a predetermined density of cells has been reached, thanks to "quorum sensing" functionality also baked into the genetic circuitry. After the explosion, the approximately 10% of the bacterial population that did not explode starts growing again. When the population density once again reaches the predetermined density (more "quorum sensing"), another drug-delivering explosion is triggered and the process encoded by the researchers' synchronized lysis circuit restarts.

The challenge, however, is that this cancer killing genetic circuit -- and other genetic circuits created by synthetic biologists -- eventually stop working in the bacteria. The culprit. Mutations driven by the process of evolution.

"The fact that some bugs naturally grow in tumors and we can engineer them to produce and deliver therapies in the body is a game-changer for synthetic biology," said Hasty. "But we have to find ways to keep the genetic circuits running. There is still work to do, but we're showing that we can swap populations and keep the circuit running. This is a big step forward for synthetic biology."

Biomedical Research Advances

One of the research teams working to further advance and implement the synchronized lysis circuit is run by Tal Danino, now a professor at Columbia University, who also published seminal work on the development of quorum sensing for synthetic biology as part of his Ph.D. at UC San Diego.

"Tal recently showed that synchronized lysis technology can be used to deliver an immunotherapy to tumors in mice. To my knowledge, they are the first to show that bacterial drug production and delivery within a treated tumor can modify the immune system to attack untreated tumors. The results are fascinating. They also highlight how important it is for us to figure out how to keep the lysis circuit running as long as possible," said Hasty.

The current approach is not limited to a three-strain system. Individual sup-populations of microbes, for example, could each be programmed to produce different drugs, offering the potential of precise combination drug therapies to treat cancer, for example.

The researchers studied the dynamics of the populations using microfluidic devices that allow for controlled interactions between the different sub-populations. They also demonstrated the system is robust when tested in larger wells.

One next step will be to combine the approach with standard stabilizing approaches and demonstrate the system works in live animal models.

"We are converging on an extremely stable drug delivery platform with wide applicability for bacterial therapies," said Hasty.

Hasty, Din, and Danino are co-founders of GenCirq, a company which seeks to transfer this and related work to the clinic.


The Cell: A Molecular Approach. a 2-a editie.

Cells are divided into two main classes, initially defined by whether they contain a nucleus. Prokaryotic cells (bacteria) lack a nuclear envelope eukaryotic cells have a nucleus in which the genetic material is separated from the cytoplasm. Prokaryotic cells are generally smaller and simpler than eukaryotic cells in addition to the absence of a nucleus, their genomes are less complex and they do not contain cytoplasmic organelles or a cytoskeleton (Table 1.1). In spite of these differences, the same basic molecular mechanisms govern the lives of both prokaryotes and eukaryotes, indicating that all present-day cells are descended from a single primordial ancestor. How did this first cell develop? And how did the complexity and diversity exhibited by present-day cells evolve?

Table 1.1

Prokaryotic and Eukaryotic Cells.


Researchers create synthetic cells to isolate genetic circuits

Imaginile pentru descărcare de pe site-ul MIT News Office sunt puse la dispoziția entităților necomerciale, presei și publicului larg sub o licență Creative Commons Attribution Non-Comercial No Derivatives. Nu puteți modifica imaginile furnizate, decât pentru a le decupa la dimensiune. O linie de credit trebuie utilizată la reproducerea imaginilor, dacă nu este furnizată mai jos, creditați imaginile la „MIT”.

Imaginea anterioară Imaginea următoare

Synthetic biology allows scientists to design genetic circuits that can be placed in cells, giving them new functions such as producing drugs or other useful molecules. However, as these circuits become more complex, the genetic components can interfere with each other, making it difficult to achieve more complicated functions.

MIT researchers have now demonstrated that these circuits can be isolated within individual synthetic “cells,” preventing them from disrupting each other. The researchers can also control communication between these cells, allowing for circuits or their products to be combined at specific times.

“It’s a way of having the power of multicomponent genetic cascades, along with the ability to build walls between them so they won’t have cross-talk. They won’t interfere with each other in the way they would if they were all put into a single cell or into a beaker,” says Edward Boyden, an associate professor of biological engineering and brain and cognitive sciences at MIT. Boyden is also a member of MIT’s Media Lab and McGovern Institute for Brain Research, and an HHMI-Simons Faculty Scholar.

This approach could allow researchers to design circuits that manufacture complex products or act as sensors that respond to changes in their environment, among other applications.

Boyden is the senior author of a paper describing this technique in the Nov. 14 issue of Nature Chemistry. The paper’s lead authors are former MIT postdoc Kate Adamala, who is now an assistant professor at the University of Minnesota, and former MIT grad student Daniel Martin-Alarcon. Katriona Guthrie-Honea, a former MIT research assistant, is also an author of the paper.

Circuit control

The MIT team encapsulated their genetic circuits in droplets known as liposomes, which have a fatty membrane similar to cell membranes. These synthetic cells are not alive but are equipped with much of the cellular machinery necessary to read DNA and manufacture proteins.

By segregating circuits within their own liposomes, the researchers are able to create separate circuit subroutines that could not run in the same container at the same time, but can run in parallel to each other, communicating in controlled ways. This approach also allows scientists to repurpose the same genetic tools, including genes and transcription factors (proteins that turn genes on or off), to do different tasks within a network.

“If you separate circuits into two different liposomes, you could have one tool doing one job in one liposome, and the same tool doing a different job in the other liposome,” Martin-Alarcon says. “It expands the number of things that you can do with the same building blocks.”

This approach also enables communication between circuits from different types of organisms, such as bacteria and mammals.

As a demonstration, the researchers created a circuit that uses bacterial genetic parts to respond to a molecule known as theophylline, a drug similar to caffeine. When this molecule is present, it triggers another molecule known as doxycycline to leave the liposome and enter another set of liposomes containing a mammalian genetic circuit. In those liposomes, doxycycline activates a genetic cascade that produces luciferase, a protein that generates light.

Using a modified version of this approach, scientists could create circuits that work together to produce biological therapeutics such as antibodies, after sensing a particular molecule emitted by a brain cell or other cell.

“If you think of the bacterial circuit as encoding a computer program, and the mammalian circuit is encoding the factory, you could combine the computer code of the bacterial circuit and the factory of the mammalian circuit into a unique hybrid system,” Boyden says.

The researchers also designed liposomes that can fuse with each other in a controlled way. To do that, they programmed the cells with proteins called SNAREs, which insert themselves into the cell membrane. There, they bind to corresponding SNAREs found on surfaces of other liposomes, causing the synthetic cells to fuse. The timing of this fusion can be controlled to bring together liposomes that produce different molecules. When the cells fuse, these molecules are combined to generate a final product.

More modularity

The researchers believe this approach could be used for nearly any application that synthetic biologists are already working on. It could also allow scientists to pursue potentially useful applications that have been tried before but abandoned because the genetic circuits interfered with each other too much.

“The way that we wrote this paper was not oriented toward just one application,” Boyden says. “The basic question is: Can you make these circuits more modular? If you have everything mishmashed together in the cell, but you find out that the circuits are incompatible or toxic, then putting walls between those reactions and giving them the ability to communicate with each other could be very useful.”

Vincent Noireaux, an associate professor of physics at the University of Minnesota, described the MIT approach as “a rather novel method to learn how biological systems work.”

“Using cell-free expression has several advantages: Technically the work is reduced to cloning (nowadays fast and easy), we can link information processing to biological function like living cells do, and we work in isolation with no other gene expression occurring in the background,” says Noireaux, who was not involved in the research.

Another possible application for this approach is to help scientists explore how the earliest cells may have evolved billions of years ago. By engineering simple circuits into liposomes, researchers could study how cells might have evolved the ability to sense their environment, respond to stimuli, and reproduce.

“This system can be used to model the behavior and properties of the earliest organisms on Earth, as well as help establish the physical boundaries of Earth-type life for the search of life elsewhere in the solar system and beyond,” Adamala says.


Priveste filmarea: Diagnostic prenatal + Investigatii si boli genetice (August 2022).