Informație

2.8: Echilibrul genelor - Biologie

2.8: Echilibrul genelor - Biologie


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

De ce trisomiile, dublările și alte anomalii cromozomiale care modifică numărul de copii ale genelor au adesea un efect negativ asupra dezvoltării normale sau fiziologiei unui organism? Acest lucru este deosebit de intrigant, deoarece la multe specii, aneuploidia este dăunătoare sau letală, în timp ce poliploidia este tolerată sau chiar benefică. Probabil că răspunsul diferă în fiecare caz, dar probabil este legat de conceptul de echilibrul genelor, care poate fi rezumat după cum urmează: genele și proteinele pe care le produc, au evoluat pentru a funcționa în rețele metabolice și de reglementare complexe. Cu toate acestea, trisomia și dublările segmentare mari ale cromozomilor afectează dozajul atât de multe gene încât rețelele celulare nu sunt în măsură să compenseze modificările și rezultă un fenotip anormal sau letal.


CRISPR-CasΦ de la fagi uriași este un editor de genom hipercompact

Sistemele CRISPR-Cas se găsesc pe scară largă în procariote, unde oferă imunitate adaptativă împotriva infecției cu virus și transformării plasmidelor. Descriem un sistem CRISPR-Cas funcțional minim, care cuprinde un singur

Proteina de 70 kilodalton, CasΦ și o matrice CRISPR, codificate exclusiv în genomul bacteriofagelor uriași. CasΦ folosește un singur sit activ atât pentru procesarea CRISPR ARN (crRNA), cât și pentru tăierea ADN-ului ghidată de crRNA pentru a ținti acizii nucleici străini. Acest sistem hipercompact este activ in vitro și în celule umane și vegetale, cu capacități extinse de recunoaștere a țintei în comparație cu alte proteine ​​CRISPR-Cas. Util pentru editarea genomului și detectarea ADN-ului, dar cu o greutate moleculară jumătate față de enzimele de editare a genomului Cas9 și Cas12a, CasΦ oferă avantaje pentru livrarea celulară care extind setul de instrumente de editare a genomului.

Copyright © 2020 Autori, unele drepturi rezervate licențiat exclusiv Asociația Americană pentru Avansarea Științei. Nicio pretenție la lucrările guvernamentale originale ale SUA.

Cifre

CasΦ este a de bună credință Sistem CRISPR-Cas din fagi uriași. ( A )…

CasΦ scindează ADN-ul. ( A ) Testul de scindare a plasmidei supercoilate care testează RNP-urile CasΦ...

CasΦ procesează pre-ARNcr în...

CasΦ procesează pre-ARNcr în cadrul site-ului activ RuvC. ( A ) substraturi pre-crARN...

CasΦ este funcțional pentru genom...

CasΦ este funcțional pentru editarea genomului. ( A ) Fluxul de lucru experimental al...


Fundal

Copiați numărul

În timp ce genele vin în general în perechi, există o serie de situații în care numărul de copii ale genelor se abate de la complet diploid [1]. Unele dintre aceste abateri sunt normale, cum se întâmplă în cazul cromozomilor sexuali [2] și amplificarea în celulele diferențiate terminal [3, 4]. Poliploidia este, de asemenea, o modificare a numărului de copii la nivel de cromozom care modifică fenotipurile în organisme precum plantele și albinele cu forme distincte specifice ploidiei [5, 6]. În majoritatea situațiilor, modificările numărului de copii sunt anormale și dăunătoare și variază ca măsură de la cromozomi completi, la segmente de cromozomi, la regiuni focale care modifică numărul de copii ale genelor individuale. Modificările evidente ale numărului de copii cariotipic sunt de obicei denumite aneuploidie. Modificările submicroscopice ale numărului de copii de-a lungul unui cromozom sunt adesea denumite variante ale numărului de copii. Avansarea recentă a tehnicilor la nivel de genom a făcut detectarea numărului de copii mult mai ușoară, iar amploarea variantelor numărului de copii în populații este extinsă [7, 8].

Mecanismele responsabile pentru diferitele clase de numere de copii variază. Cauza majoră a modificării numărului de copii întregi cromozomiale este segregarea greșită la mitoză sau meioză, din cauza nedisjuncției, defectelor punctului de control, defectelor de coeziune, atașării merotelice a microtubulilor la cinetocori, fusurilor mitotice multipolare sau evenimentelor de recombinare sau reparare care generează dicentrice și acentrice. cromozomi [9, 10]. Modificările segmentale ale numărului de copii rezultă din rearanjamente datorate evenimentelor de reparare, segregarea dezechilibrată a translocațiilor pentru a genera perechi de duplicare și ștergere și recombinare la dublări în tandem [11-13]. Aceste evenimente cu numărul de copii pot fi extinse, rezultând blocuri mari de numere de copii, dar sunt deosebit de informative atunci când sunt afectați doar câțiva loci. Astfel de modificări mici ale numărului de copii sunt adesea găsite asociate cu repetări care promovează recombinarea omoloagă non-alelic, în timp ce recombinarea mediată de segmente de microomologie de 2 până la 15 bp poate genera modificări sporadice ale numărului de copii [13]. În timp ce se poate dezbate dacă 2 bp este cu adevărat omolog, în ambele cazuri regiunile de omologie extinsă sau limitată facilitează rearanjamentele în timpul reparării ADN-ului.

La nivel de organism, modificările numărului de copii sunt adesea asociate cu o serie de anomalii, inclusiv deces, defecte de dezvoltare sau întârziere, tulburări psihiatrice, avorturi spontane și cancere [11, 14]. Unele modificări ale numărului de copii sunt „șoferi” cu consecințe fenotipice, în timp ce altele sunt „pasageri” neutri sau aproape neutri [15-18]. Atunci când modificările numărului de copii sunt extinse (de exemplu, cromozomi monozomici) sunt probabile mai multe drivere, dar atunci când modificările numărului de copii sunt limitate în amploare și sunt recurente, este posibil să se deducă identitatea genelor driver asociate cu un anumit fenotip. În plus, în ambele Drosophila și oameni, schimbarea extensivă a numărului de copii duce la moarte în timpul dezvoltării [19, 20]. În Drosophila acest lucru este puțin probabil din cauza driverelor specifice, ci mai degrabă efectului aditiv al modificărilor multiple ale numărului de copii [21].

Efectul modificării numărului de copii asupra fitnessului este dependent de context. De exemplu, în plantele de cultură, poliploidele produc adesea fructe sau flori mai mari [22]. Modificările dezechilibrate ale numărului de copii au ca rezultat modificări fenotipice mai severe decât poliploidia, subliniind importanța echilibrului dozării genelor, mai degrabă decât numărul absolut de copii [23]. În microorganisme precum Candida albicans se crede că numărul de copii modificat al genelor mediază rezistența la antibiotice [24]. În mod similar, în celulele tumorale modificări ale numărului de copii care au ca rezultat configurații favorabile ale numărului de copii ale driverelor sunt asociate cu rezistența la chimioterapie [25]. Într-adevăr, dovezile experimentale directe arată că celulele tumorale obțin avantaje din modificările cromozomiale și segmentare ale numărului de copii, deoarece o eliminare a componentelor mitotice ale punctelor de control la șoareci crește atât deviațiile numărului de copii, cât și tumorigeneza spontană sau indusă de cancerigen [9]. Această legătură între numărul de copii și fitness-ul celulelor canceroase este susținută de profilarea de înaltă performanță a 8.000 de genomi de cancer, în care modificările de linie generală au fost legate de kinaze și regulatorii ciclului celular [18]. Aceste studii sugerează că modificările numărului de copii pot crește fitness-ul celular.

Drosophila cromozomii

Euploid Drosophila melanogaster celulele sunt diploide, cu trei perechi de autozomi și o pereche de cromozomi sexuali, femelele având două cromozomi X și bărbații având un singur cromozom X și un cromozom Y. Numărul de cromozomi X determină sexul [26], iar cromozomul X este doza compensată prin asocierea cu complexul letal specific masculin (MSL) [27, 28]. Cromozomul Y este necesar pentru fertilitatea masculină, dar nu pentru viabilitate, iar femelele XX care poartă un Y sunt viabile și fertile [29]. Al patrulea cromozom mic este adesea monosomic și este compensat de Pictura al patrulea (POF) [30]. Pentru a înțelege efectele biologice ale numerelor de copii, am studiat structurile genomului D. melanogaster celule de cultură tisulară. După cum sa demonstrat anterior prin resecvențiere S2 celule [31], am găsit modificări extinse ale numărului de copii în aceste linii. Datele noastre susțin cu tărie ideea că schimbarea numărului de copii modifică funcția căii pentru a selecta pentru creșterea crescută și că modificările coerente ale numărului de copii în genele care codifică membrii complexelor proteină-proteină corectează dezechilibrele pentru a menține funcția complexă. În mod similar, sugerăm că selecția împotriva efectelor dăunătoare ale numărului de copii au ca rezultat regiuni în care modificările numărului de copii sunt rare.


Rezultate

Siturile CTCF direcționale exogene funcționează ca izolatori de protocadherină în modelul celular in vitro

Pentru a investiga mecanismele specifice celulei Pcdh expresia genelor în creier, am efectuat ARN-seq unicelular a neuronilor corticali de șoarece și am găsit membri ai Pcdhα cluster sunt exprimate în neuroni unici într-o manieră combinatorie și stocastică (Fig. 1b), similar cu modelele de expresie monoalelice stocastice ale Pcdhα în celule Purkinje unice din cerebel [28, 39]. În plus, modelarea probabilității maxime confirmă modelele de expresie monoalelice stocastice în celulele individuale ale neocortexului de șoarece (Fișier suplimentar 1: Figura S1a,b) [40].

Apoi am folosit linia celulară HEC-1-B, care se exprimă monoalelic α6 și α12 (Fișier suplimentar 1: Figura S1c-f reține că oamenii au 13 exoni variabili alternativi), ca un sistem model cu o singură celulă pentru a investiga mecanismele de reglare a genelor [12]. Am efectuat inserții CBS prin editarea fragmentelor de ADN și am verificat clonele CRISPR unicelulare (Fig. 1c, d) [37, 38]. Am inserat mai întâi elemente CBS orientate înainte simple ("F") sau tandem ("FF") în locația dintre Pcdhα cluster și ei HS5-1 amplificator (Fig. 1d-f) și a efectuat o copie cantitativă de captare a conformației cromozomului de înaltă rezoluție, urmată de experimente de secvențiere de generație următoare (QHR-4C) (Fișier suplimentar 1: Figura S2). QHR-4C a dezvăluit interacțiuni proeminente ale cromatinei la distanță lungă HS5-1 și elementele CBS inserate și o scădere concomitentă a interacțiunilor cromatinei între HS5-1 si Pcdhα promotori (Fig. 1g–j și fișierul suplimentar 1: Figura S3a,b). În plus, mutațiile CBS elimină aceste efecte (Fig. 1g-j și fișierul suplimentar 1: Figura S3a, b). În concordanță cu scăderea interacțiunilor amplificator-promotor, ARN-seq a relevat o scădere semnificativă a α6 și α12 nivelurile de expresie și mutațiile CBS își salvează expresia (Fișier suplimentar 1: Figura S3c, d). În rezumat, elementele CBS orientate înainte introduse blochează contactele spațiale ale cromatinei la distanță lungă dintre HS5-1 amplificator și promotorii săi țintă și astfel funcționează ca izolatori ai cromatinei concurând cu ținta Pcdhα promotori.

Apoi am inserat trei elemente CBS diferite orientate invers, fiecare în locații distincte din Pcdhα cluster (Fișier suplimentar 1: figurile S3e-j și S4). Am descoperit că fiecare concurează cu HS5-1 amplificator pentru a forma interacțiuni cromatinei la distanță lungă cu promotorii țintă și funcționează astfel ca un izolator (Fișier suplimentar 1: figurile S3e-j și S4). În cele din urmă, am inserat perechi CBS invers-înainte („RF” sau „RRFF”) în locația dintre Pcdhα cluster și cel HS5-1 amplificator. Am constatat că funcționează și ca izolatori (Fișier suplimentar 1: figurile S5 și S6).

Locurile CTCF înainte-înapoi nu compromit activitatea de izolație

Studiile anterioare au demonstrat că Drosophila izolatorii perechi compromit activitatea de izolare unul altuia [41, 42]. Pentru a testa orientarea izolatorilor de mamifere, am introdus patru elemente CBS tandem într-o configurație înainte-înapoi între Pcdhα cluster și ei HS5-1 amplificator (Fișier suplimentar 1: Figura S7a). Am descoperit, în mod surprinzător, aceste elemente CBS spre interior înainte-înapoi încă funcționează ca izolatori. Mai exact, QHR-4C și ARN-seq au evidențiat o scădere semnificativă a interacțiunilor cromatinei HS5-1 si Pcdhα promotori precum și expresia scăzută a acestora (Fișier suplimentar 1: Figura S7b-f). Acest lucru sugerează că, diferit de izolatoarele de muște, site-urile CTCF tandem înainte-invers de la mamifere nu își compromit activitățile de izolare. Ca control, elementele CBS de frontieră inversă-înainte introduse funcționează ca izolatori conform așteptărilor (fișier suplimentar 1: figurile S5 și S6).

Concluzionăm că atât elementele CBS ectopice înainte cât și invers funcționează ca izolatori pentru Pcdhα genele prin bucla direcțională mediată de CTCF (Fig. 1 și fișierul suplimentar 1: figurile S3-S7), și anume, izolatorii CTCF funcționează într-o manieră independentă de orientare. Cu toate acestea, mecanismele lor de izolare sunt distincte. Elementele CBS înainte sau inversă formează interacțiuni cromatinei la distanță lungă cu Pcdhα amplificatori sau promotori (probabil prin alunecarea cohesinei prin site-urile CTCF convergente care se apropie, Fișier suplimentar 1: Figura S7b, c), respectiv, într-o manieră dependentă de orientare. Astfel, locațiile și orientările relative ale elementelor CBS inserate determină specificitatea izolației lor prin bucla direcțională către site-uri CTCF distincte din Pcdhα cluster.

Izolatorii CTCF îmbunătățesc utilizarea promotorului distal

Interesant este că izolatorii CTCF introduși blochează în principal contactele amplificatorului cu proximal Pcdhα promotori (Fig. 1g, h și fișierul suplimentar 1: figurile S3f, S5b, S6b și S7b). În mod surprinzător, inserarea izolatorilor CTCF mărește interacțiunile cromatinei la distanță lungă între HS5-1 amplificator și distal Pcdhα promotori (Fig. 1g, h și fișierul suplimentar 1: figurile S3f, S5b, S6b și S7b). Pentru a înțelege acest fenomen nedumerit, am simulat dinamica conformației polimerului Pcdhα cluster prin extrudarea buclei de coezină „cu două capete” pe o fibră de cromatină cu granulație grosieră (fișier suplimentar 1: Figura S7g), pe baza locațiilor și orientărilor relative ale elementelor CBS care sunt legate dinamic de proteinele CTCF (fișier suplimentar 1: Figura S7g). S8a-c) [9, 10, 12, 18,19,20].

Presupunem că cohesina alunecă de-a lungul Pcdhα fibră de cromatină până când întâlnește un element CBS opus sau o altă coezină de alunecare (Fișier suplimentar 1: Figura S7g) [18, 19, 43]. În mod remarcabil, simulările computaționale de polimeri 3D au arătat că, pe lângă cele proximale Pcdhα izolarea promotorului, extrudarea continuă a coezinei a buclelor de cromatina are ca rezultat o creștere semnificativă a interacțiunilor cromatinei între HS5-1 amplificator și distal Pcdhα promotori la inserarea diverșilor izolatori CTCF (Fig. 1k, l și fișierul suplimentar 1: figurile S3i, S5f, S6f și S7e), în concordanță cu datele observate din experimentele QHR-4C (Fig. 1g, h și fișierul suplimentar 1). : Figurile S3f, S5b, S6b și S7b). În cele din urmă, prin aplicarea abordării entropiei maxime relative cu erori gaussiene independente, am optimizat simulările noastre polimerice și am obținut dovezi puternice că izolatorii CTCF promovează interacțiunile cromatinei distale (Fișier suplimentar 1: Figura S8d).

Apoi am simulat conformația cromozomală a Igh cluster care conține, de asemenea, un repertoriu mare de site-uri CTCF variabile în tandem (Fișier suplimentar 1: Figura S8e,f) [33] și a constatat că, similar cu cel din Pcdhα cluster, inserarea diverșilor izolatori CTCF în orientări diferite mărește, de asemenea, segmentul distal al genei variabile (VH) utilizare (Fișier suplimentar 1: Figura S8f,g). Astfel, bucla direcțională mediată de CTCF a elementelor CBS aranjate în tandem determină echilibrul promotor al ambelor Pcdhα și Igh clustere de gene.

Bucla topologică a site-urilor CTCF distal-distal în Pcdh β/γ clustere

Similar cu Pcdhα cluster, promotorul fiecărui membru al Pcdh β și γ clustere (cu excepția β1, γc4, și γc5) poartă un CBS înainte, iar super-amplificatorul din aval conține o matrice tandem de elemente CBS orientate invers (Fig. 1a) [12, 44]. Nu este clar cum membrii Pcdh β și γ clusterele sunt reglementate de aceste elemente CBS inverse tandem. ARN-seq-ul unicelular și modelarea probabilității maxime au demonstrat că neuronii corticali unici exprimă combinații aleatorii de aproximativ până la 4 izoforme ale Pcdhβ familia și 4 izoforme ale Pcdhγ familia din creierul șoarecelui (Fig. 2a și fișierul suplimentar 1: Figura S9a). Cu toate acestea, ștergerea site-urilor CTCF fi în super-amplificator afectează în principal expresia membrilor Pcdhβ grupați în celule unice în cortexul șoarecelui (Fig. 2b în comparație cu Fig. 2a).

Site-urile CTCF tandem echilibrează utilizarea Pcdh β și γ promotori. A, b Secv. ARN unicelular al neuronilor corticali ai WT (A) și CBS b-e (b) șoareci de ștergere. Rețineți că absența Pcdhβ expresia în neuroni corticali unici ai situsurilor CTCF fi șoareci de ștergere. c Profiluri QHR-4C cu un repertoriu al Pcdhβ promotorii ca punct de vedere arată că formează contacte spațiale de cromatină cu situsurile distale CTCF d-f, dar nu siturile CTCF proximale a-c, în cadrul super-amplificator în țesuturile corticale de șoarece. Inserat în colțul din dreapta sus, ChIP-seq cu un anticorp specific împotriva CTCF sau Rad21. d Profiluri QHR-4C cu un repertoriu al Pcdhγ promotorii ca punct de vedere arată că, în plus față de situsurile CTCF distale, ei formează contacte de cromatină spațială crescute treptat cu situsurile CTCF proximale. a-c în super-amplificator în țesuturile corticale de șoarece. e Profilurile de interacțiune QHR-4C cu un repertoriu de situsuri CTCF din ce în ce mai distale în super-amplificator, ca punct de vedere, arată contacte crescute ale cromatinei spațiale cu Pcdhβ cluster. f Schema ștergerilor site-urilor individuale CTCF sau combinațiilor acestora în Pcdh β și γ super-amplificator la șoareci. SE, super-enhancer del, deletion

Pentru a investiga dacă site-urile CTCF în tandem din Pcdh β și γ clusterele și super-amplificatorul lor din aval echilibrează, de asemenea, contactele cromatinei spațiale și alegerea promotorului, am efectuat experimente QHR-4C cu un repertoriu de Pcdh β și γ promotori ca punct de vedere folosind țesuturi corticale de șoarece (Fig. 2c, d). În mod remarcabil, reglementarea Pcdh β și γ promotorii apare topologic. Și anume, există interacțiuni specifice cromatinei la distanță lungă între membrii Pcdhβ cluster și situsurile distale CTCF d-f, dar nu siturile CTCF proximale a-c (în ciuda faptului că toate cele șase site-uri CTCF a-f sunt legate de CTCF și cohesină, introduse în colțul din dreapta sus al Fig. 2c), în super-amplificatorul din aval (Fig. 2c). Cu toate acestea, atunci când se folosește un repertoriu al Pcdhγ promotori ca punct de vedere, în plus față de situsurile distale CTCF d-f, apar contacte crescute ale cromatinei spațiale cu situsurile CTCF proximale a-c a super-amplificatorului din aval (Fig. 2d). În cele din urmă, pentru a confirma această reglementare spațială a Pcdh β și γ promotori, am efectuat experimente QHR-4C cu fiecare dintre repertoriul CBS de super-amplificator ca punct de vedere și am găsit interacțiuni crescute ale cromatinei pe distanță lungă între situsurile CTCF distale înainte ale Pcdh promotori variabili și situsuri CTCF inverse distale ale super-amplificatorului (Fig. 2e). Prin urmare, membrii Pcdh β și γ clusterele sunt reglate topologic de situsurile CTCF distale și, respectiv, proximale, în cadrul super-amplificatorului din aval.

Site-urile CTCF tandem echilibrează utilizarea Pcdh β și γ promotori

Pentru a investiga în continuare mecanismul funcției CBS aranjate în tandem în super-amplificator, am generat o serie de ștergeri ale site-urilor CTCF individuale sau combinațiile acestora la șoareci (Fig. 2f și fișierul suplimentar 1: Figura S9b). Experimentele QHR-4C au arătat că ștergerea acestor site-uri CTCF are ca rezultat o creștere semnificativă a interacțiunilor cromatinei la distanță lungă între Pcdhγ promotori și super-amplificator, precum și o scădere semnificativă a interacțiunilor cromatinei la distanță lungă între Pcdhβ promotori și super-amplificator (Fig. 3a și fișierul suplimentar 1: Figurile S10 și S11).

Topologia contactelor cromatinei spațiale ale super-amplificatorului cu Pcdh β și γ promotori. A Profiluri de interacțiune QHR-4C cu CBS f a super-amplificatorului din aval ca punct de vedere în țesuturile corticale ale șoarecilor cu o serie de deleții ale situsurilor CTCF individuale sau combinațiile acestora. b Profiluri de interacțiune QHR-4C cu CBS f a super-amplificatorului din aval ca punct de vedere folosind celule transfectate numai cu dCas9 sau dCas9 cu ARNsg care vizează site-urile CTCF individuale sau combinațiile lor pentru a identifica efectele la situsurile CTCF. c, d Profiluri de interacțiune QHR-4C cu amonte Pcdhβ17 promotorul CBS ca punct de vedere la șoarecii cu deleții de situs CTCF sau în celule cu situsuri CTCF blocate cu dCas9 confirmă interacțiunile scăzute cu super-amplificatorul din aval. WT, tip sălbatic del, ștergere

Pentru a identifica aceste efecte topologice la site-urile CTCF, dar nu la amplificatori, am folosit sisteme CRISPR Cas9 inactive catalitic (dCas9 pentru Cas9 mort) pentru a bloca în mod specific fiecare CBS în deleții, fără a perturba amplificatorii. Experimentele QHR-4C au confirmat o creștere semnificativă cu proximal Pcdhγ si o scadere semnificativa cu Pcdhβ (Fig. 3b). În cele din urmă, am confirmat această reglare topologică la șoarecii cu ștergere și sistemul de blocare a dCas9 de către QHR-4C cu Pcdhβ17 promotor ca punct de vedere (Fig. 3c, d). Conchidem că, similar cu Pcdhα și Igh clustere, siturile endogene tandem CTCF funcționează ca izolatori topologici pentru a echilibra contactele amplificatoare spațiale și alegerea promotorului. Pcdh β și γ clustere.

Siturile endogene CTCF funcționează ca izolatori de protocadherină

Apoi am testat dacă fiecare dintre matricele endogene tandem ale celor orientate înainte Pcdh Elementele CBS funcționează ca un izolator. Am constatat că ștergerea fișierului αc1 Elementul CBS are ca rezultat o creștere semnificativă a interacțiunilor cromatinei la distanță lungă HS5-1 si Pcdhα genele în amonte de αc1 (Fig. 4a, b). În plus, această ștergere are ca rezultat o creștere semnificativă a α6 și α12 nivelurile de expresie (Fig. 4c). Mai mult, ștergerea fișierului α12 Elementul CBS duce, de asemenea, la o creștere semnificativă a interacțiunilor cromatinei între HS5-1 iar în amonte Pcdhα genele (Fig. 4d, e) precum și ale α6 niveluri de expresie (Fig. 4f). Împreună, aceste date sugerează că fiecare element CBS endogen funcționează ca un izolator pentru amonte. Pcdhα genele.

Siturile CTCF endogene ca Pcdh izolatoare. A CTCF ChIP-seq al Pcdhαc1 Clone de celule CRISPR HEC-1-B cu deleție CBS. b Profilele QHR-4C ale cromatinei pe rază lungă de contact cu HS5-1 ca punct de vedere în două clone CRISPR unicelulare (D11, D16) cu ștergerea endogenului αc1 CBS. Rapoartele Log2 (deleție vs tip sălbatic) sunt de asemenea prezentate. c ARN-seq al WT și αc1 Clone CRISPR șterse de CBS. df Corespunde Ac, respectiv, dar cu α12 Ștergerea CBS în două clone CRISPR unicelulare (D32, D93). g Profilurile de interacțiune 5C ale Pcdh α și β clustere în țesuturile corticale ale HS5-1b sau HS5-1a Șoareci cu ștergere CBS. Rapoartele log2 ale interacțiunilor cromatinei ale HS5-1 cu Pcdhα sau 5′ izoforme ale β repertoriul genelor sunt evidențiate prin dreptunghiuri albastre sau, respectiv, negre. Observați creșterea semnificativă a interacțiunilor cromatinei între HS5-1 cu izoformele 5′ ale Pcdhβ cluster pe HS5-1b ștergerea indicată de mărirea Inserțiilor A și B, în comparație cu nicio modificare asupra HS5-1a ștergerea indicată de mărirea Inserțiilor A' și B′.h, i QHR-4C a confirmat interacțiunile crescute cu izoformele 5′ ale Pcdhβ cluster și scăderea interacțiunilor cu Pcdhα cluster. j, k ARN-seq a dezvăluit niveluri crescute de expresie ale izoformelor 5′ ale Pcdhβ cluster în CBS homozigot HS5-1b ștergere (j) soareci in comparatie cu HS5-1a ștergere (k) soareci ca martori. Date ca medie ± SD, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Studenții cu o singură coadă t Test

Pentru a investiga dacă fiecare dintre cele două elemente CBS orientate invers (HS5-1a și HS5-1b) flancând la HS5-1 intensificatorul funcționează, de asemenea, ca un izolator, am șters fiecare dintre ele la șoareci in vivo și am efectuat experimente 5C, QHR-4C și ARN-seq folosind țesuturi corticale de șoarece (Fig. 4g-k). Ștergerea HS5-1b CBS (Fișier suplimentar 1: Figura S12a,b), care se află la limita dintre Pcdhα și Pcdhβγ subTAD [12], are ca rezultat o creștere aberantă a interacțiunilor cromatinei la distanță lungă între HS5-1 iar izoformele 5′ ale Pcdhβ cluster (Fig. 4g, h), precum și o activare aberantă a promotorilor acestora (Fig. 4j). Remarcabil, chiar și pentru Pcdhβ1 promotorul, care nu poartă CBS, cu care interacțiunile cromatinei la distanță lungă HS5-1 sunt încă crescute aberant, sugerând că HS5-1b CBS funcționează ca un izolator pentru a bloca HS5-1 amplificator de la activarea necorespunzătoare a Pcdhβ1 promotor (Fig. 4h). În schimb, atât interacțiunile cromatinei HS5-1 cu alternativul proximal Pcdhα genele, precum și nivelurile de expresie ale acestora sunt semnificativ scăzute (Fig. 4g, i, j). Acest lucru sugerează că granița HS5-1b Elementul CBS este un izolator care limitează HS5-1 activitatea de amplificare din activarea aberantă a Pcdhβ promotori. Ca control, ștergerea homozigotă a internului HS5-1a Elementul CBS (Fișier suplimentar 1: Figura S12a,b) nu duce la nicio modificare a expresiei izoformelor 5′ ale Pcdhβ cluster (Fig. 4k). Prin urmare, deși ambele HS5-1a și HS5-1b Elementele CBS sunt necesare pentru unirea HS5-1 amplificator la Pcdhα promotori (Fig. 4g, i–k), doar limita HS5-1b Elementul CBS funcționează ca un izolator care blochează HS5-1 activitatea de amplificare de la activarea aberantă a Pcdhβ genele.

În cele din urmă, pentru a investiga în continuare dacă activitatea de izolare a CBS HS5-1b este dependentă de orientare, am generat o linie de mouse cu CBS HS5-1b inversat (Fișier suplimentar 1: Figura S12a,b). În mod surprinzător, nici nivelurile de expresie ale izoformelor 5′ ale Pcdhβ cluster și nici interacțiunile lor la distanță lungă cu cromatina HS5-1 intensificatorii sunt semnificativ crescute (Fișier suplimentar 1: Figura S12c-e). Prin contrast, ambele niveluri de expresie ale proximale alternative Pcdhα genele și interacțiunile lor la distanță lungă cu cromatina HS5-1 intensificatorii sunt semnificativ reduse (Fișier suplimentar 1: Figura S12c,f). Astfel, CBS inversat HS5-1b încă funcționează ca un izolator pentru a bloca HS5-1 amplificator de la activarea necorespunzătoare a Pcdhβ cluster, dar nu mai este capabil să facă o punte HS5-1 amplificator cu alternativul proximal Pcdhα genele. Acest lucru demonstrează din nou că activitatea de izolație a izolatorilor CTCF este independentă de orientare, dar bucla direcțională a site-urilor CTCF este dependentă de orientare. Concluzionăm că atât site-urile CTCF endogene din locațiile genomice native, cât și situsurile CTCF exogene inserate în locații ectopice funcționează ca izolatori într-o manieră independentă de orientare.

Izolatoare pt Pcdh și β-globină amplificatori fără site CTCF

Apoi am pregătit șoarecii cu o ștergere a întregului HS5-1 fragment incluzând cele două elemente CBS de flancare ale HS5-1a și HS5-1b (Fig. 5a–e și fișierul suplimentar 1: Figura S12a,b). Am descoperit că interacțiunile cromatinei la distanță lungă dintre HS7 amplificator și izoformele 5′ ale Pcdhβ cluster sunt semnificativ crescute pe HS5-1 ştergere (Fig. 5a–c). În plus, nivelurile de expresie ale izoformelor 5′ ale Pcdhβ clusterele sunt, de asemenea, semnificativ crescute (Fig. 5e). Acest lucru sugerează că cei doi HS5-1 Elementele CBS funcționează ca un izolator pentru a bloca activitatea HS7 intensificator, care nu conține CBS, de la activarea aberantă a Pcdhβ promotori. Ca control, am inversat la fel in situ HS5-1 fragment care include cele două site-uri CTCF orientate invers la șoareci in vivo (Fig. 5a și fișierul suplimentar 1: Figura S12a, b). În contrast cu HS5-1 ștergere, nici HS7 interacțiunile buclei cromatinei cu nici nivelurile de expresie ale izoformelor 5′ ale Pcdhβ clusterele sunt semnificativ crescute (Fig. 5b, d, f). Aceste diferențe remarcabile între ștergerea și inversarea HS5-1 arată clar că cele două endogene HS5-1 Elementele CBS funcționează ca un izolator pentru a bloca HS7 intensificator de la activarea aberantă a Pcdhβ expresia genei, iar activitatea sa de izolație este independentă de orientare in vivo, în concordanță cu inserțiile de elemente CBS exogene ale fiecărei orientări în liniile celulare in vitro (Fig. 1 și fișierul suplimentar 1: figurile S3-S7).

Izolatoare pentru amplificatori fără site CTCF. A Schema a HS5-1 Elemente CBS ca izolator al HS7 amplificator pentru Pcdhβ genele. b Profilurile de interacțiune 5C ale Pcdh α și β clustere în HS5-1 șoareci cu ștergere (del) sau inversare (inv) in vivo. Rapoartele log2 ale interacțiunilor cromatinei ale HS5-1 cu Pcdhα si de HS7 cu izoformele 5′ ale Pcdhβ cluster sunt evidențiate prin dreptunghiuri albastre sau, respectiv, negre. Observați creșterea semnificativă a interacțiunilor cromatinei între HS7 cu izoformele 5′ ale Pcdhβ cluster pe HS5-1 ștergerea indicată de mărirea inserțiilor C și D. c QHR-4C cu HS7 sau β3 ca punct de vedere confirmă interacţiunile crescute între HS7 și izoformele 5′ ale Pcdhβ grupare în homozigot HS5-1 șoareci de ștergere. d QHR-4C cu HS7 sau β3 ca punct de vedere nu se confirmă nicio modificare semnificativă a interacțiunilor dintre HS7 și izoformele 5′ ale Pcdhβ grupare în homozigot HS5-1 soareci de inversare. e ARN-seq al țesuturilor corticale ale WT și HS5-1 șoareci de ștergere. f ARN-seq al țesuturilor corticale ale WT și HS5-1 soareci de inversare. g CTCF și Rad21 ChIP-seq al unei singure celule umane β-globină Clone CRISPR cu inserarea unei perechi de elemente CBS invers-înainte („RF2”). h Profiluri QHR-4C cu omul β-globină HBG2 promotor ca punct de vedere. i ARN-seq dezvăluie niveluri de expresie scăzute (normalizate la WT) ale omului β-globină repertoriu. Nivelurile reale de expresie sunt afișate în insert. Date ca medie ± SD, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Studenții cu o singură coadă t Test. j Tabelele de contingență pe perechi care arată interrelațiile fiecărei perechi de variabile între rezistența izolatorului la nivelul genomului, activitatea promotorului și puterea amplificatorului și a buclei. k Structura optimă a relațiilor dintre rezistența izolatorului la nivelul întregului genom, activitatea promotorului, intensificatorul și rezistența buclei în timpul diferențierii epidermice umane, învățată de rețele Bayesian. l Bucla direcțională CTCF stă la baza monoalelicului stocastic Pcdh α și βγ expresia genelor și utilizarea echilibrată a promotorului. În special, bucla direcțională a cromatinei mediată de CTCF stocastică și monoalelica stă la baza activării unuia și a unui singur promotor variabil în fiecare cromozom din Pcdhα cluster, în timp ce până la 4 promotori sunt activați în fiecare cromozom din Pcdhp/y clustere. m Un polimer simulat 3D Hulu (tărtăcuță) model de site-uri CTCF în tandem echilibrând topologic contactele cromatinei spațiale și selecția amplificator-promotor. n Interpretarea mecanică a modelului 3D Hulu în contextul „extrudării buclei” bidirecționale a coezinei prin site-uri CTCF tandem

Pentru a investiga în continuare dacă acest lucru este adevărat pentru β-globină cluster, apoi am inserat o pereche de elemente CBS invers-forward (denumite „RF2” pentru a fi distinse de primul „RF” din Fișierul suplimentar 1: Figura S5) în locația dintre cei cinci promotori de globină și HS2 amplificator, care, de asemenea, nu conține CBS (Fig. 5g). ChIP-seq a confirmat legarea CTCF/coesinei la perechea CBS inserată, dar nu și situsurile mutante ale acesteia (Fig. 5g). QHR-4C experimentează fie cu HS2 amplificator sau HBG2 promotor ca punct de vedere a demonstrat o scădere semnificativă a β-globină interacțiuni amplificator-promotor (Fig. 5h și Fișier suplimentar 1: Figura S13a). În mod constant, nivelurile de expresie ale tuturor β-globină genele sunt semnificativ scăzute, iar scăderea este salvată de mutațiile CBS (Fig. 5i).

QHR-4C cu 5’HS5 sau 3’HS1 as a viewpoint, which contains a CBS element located outside of and beyond the β-globin enhancer and promoter regions, respectively, revealed opposite chromatin looping interactions with the inserted reverse-forward CBS pair (Additional file 1: Figure S13b-d). Thus, CBS elements, if inserted between enhancers and promoters with no CBS, also function as insulators by forming long-distance chromatin looping interactions with CBS elements located in the endogenous genome outside of and beyond respective enhancer and promoter regions. Finally, we inserted various combinations of CBS elements upstream and/or downstream of the HS7 enhancer, which contains no CTCF site, of the Pcdhα cluster and found that the inserted CBS elements block long-distance chromatin interactions of the HS7 enhancer (Additional file 1: Figure S13e-g). In conjunction with the data of the endogenous Pcdh CBS deletion, we conclude that CBS elements function as insulators for enhancers with no CBS.

Genome-wide CTCF sites function as insulators

To see whether genome-wide CTCF-bound CBS elements function as insulators for enhancers, we analyzed developmental plasticity of insulators, promoters, and enhancers during human epidermal differentiation by Bayesian networks learned by the max-min hill-climbing algorithm [45] using categorized factors (Fig. 5j) inferred from previously published capture Hi-C data [46]. Remarkably, we find a direct inverse relationship between insulator strength and promoter activity (Fig. 5k). Moreover, insulators also regulate promoter activity indirectly through enhancers by perturbing the looping strength of their spatial chromatin contacts (Fig. 5k). Thus, these Bayesian network analyses, in conjunction with our deletion and inversion experiments in mice in vivo (Figs. 2, 3, 4, and 5), suggest that CTCF-bound CBS elements function as insulators through directional chromatin looping across the human genome.


Identifying distinct diabetes phenotypes

Recent studies challenge the traditional concept of T2D as single entity, as patients already exhibit a broad variability in insulin secretion and sensitivity at diagnosis 35 . Unbiased cluster analyses discriminated subgroups with different degrees of insulin deficiency and moderate obesity-related, moderate age-related or severe insulin resistance 35,36 . Whereas no known diabetes gene variants were associated with all clusters, a TCF7L2 variant related to insulin deficiency and a TM6SF2 variant related to the severely insulin-resistant cluster predicted nephropathy, cardiovascular disease 36 and NAFLD 35 . Soft clustering analyses point to further gene–phenotype associations 37 underlining different pathogenic mechanisms.


Epigenetic regulation of antagonistic receptors confers rice blast resistance with yield balance

Crop breeding aims to balance disease resistance with yield however, single resistance (R) genes can lead to resistance breakdown, and R gene pyramiding may affect growth fitness. Here we report that the rice Pigm locus contains a cluster of genes encoding nucleotide-binding leucine-rich repeat (NLR) receptors that confer durable resistance to the fungus Magnaporthe oryzae without yield penalty. Among these NLR receptors, PigmR confers broad-spectrum resistance, whereas PigmS competitively attenuates PigmR homodimerization to suppress resistance. PigmS expression, and thus PigmR-mediated resistance, are subjected to tight epigenetic regulation. PigmS increases seed production to counteract the yield cost induced by PigmR Therefore, our study reveals a mechanism balancing high disease resistance and yield through epigenetic regulation of paired antagonistic NLR receptors, providing a tool to develop elite crop varieties.


Rezumatul secțiunii

When true-breeding, or homozygous, individuals that differ for a certain trait are crossed, all of the offspring will be heterozygous for that trait. Dacă trăsăturile sunt moștenite ca dominante și recesive, F1 descendenții vor prezenta toți același fenotip ca și părintele homozigot pentru trăsătura dominantă. Dacă acești descendenți heterozigoți sunt autoîncrucișați, rezultatul F2 descendenții vor avea la fel de probabil să moștenească gameți purtând trăsătura dominantă sau recesivă, dând naștere la descendenți dintre care un sfert sunt dominanti homozigoți, jumătate sunt heterozigoți și un sfert sunt homozigoți recesivi. Deoarece indivizii homozigoți dominanti și heterozigoți sunt fenotipic identici, trăsăturile observate în F2 descendenții vor prezenta un raport de trei dominant la unul recesiv.

Mendel a postulat că genele (caracteristicile) sunt moștenite ca perechi de alele (trăsături) care se comportă într-un model dominant și recesiv. Alelele se segregă în gameți, astfel încât fiecare gamet este la fel de probabil să primească oricare dintre cele două alele prezente la un individ diploid. În plus, genele sunt asortate în gameți independent unul de celălalt. That is, in general, alleles are not more likely to segregate into a gamete with a particular allele of another gene.

Exerciții

Glosar

allele: one of two or more variants of a gene that determines a particular trait for a characteristic

dihybrid: the result of a cross between two true-breeding parents that express different traits for two characteristics

genotype: the underlying genetic makeup, consisting of both physically visible and non-expressed alleles, of an organism

heterozygous: having two different alleles for a given gene on the homologous chromosomes

homozygous: having two identical alleles for a given gene on the homologous chromosomes

law of dominance: in a heterozygote, one trait will conceal the presence of another trait for the same characteristic

law of independent assortment: genes do not influence each other with regard to sorting of alleles into gametes every possible combination of alleles is equally likely to occur

law of segregation: paired unit factors (i.e., genes) segregate equally into gametes such that offspring have an equal likelihood of inheriting any combination of factors

monohybrid: the result of a cross between two true-breeding parents that express different traits for only one characteristic

phenotype: the observable traits expressed by an organism

Punnett square: a visual representation of a cross between two individuals in which the gametes of each individual are denoted along the top and side of a grid, respectively, and the possible zygotic genotypes are recombined at each box in the grid

test cross: a cross between a dominant expressing individual with an unknown genotype and a homozygous recessive individual the offspring phenotypes indicate whether the unknown parent is heterozygous or homozygous for the dominant trait


Priveste filmarea: NASA Vrea Sa Modifice ADN-ul Uman (Iunie 2022).


Comentarii:

  1. De

    În opinia mea, nu ai dreptate. Pot apăra poziția.

  2. Calldwr

    va rog parafrazati mesajul

  3. Reginald

    Licențiați -mi de la asta.

  4. Shaktilar

    Vă mulțumesc pentru ajutor în această întrebare. La tine, un forum remarcabil.

  5. Lootah

    I agree, this remarkable opinion



Scrie un mesaj