Informație

Etichetare exclusivă a microtubulilor minus-end

Etichetare exclusivă a microtubulilor minus-end


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

După cum explică titlul, caut o modalitate de a eticheta exclusiv microtubul minus final in vivo. Căutând prin literatură nu am găsit încă nicio tehnică. Ai vreo idee?


γ-Tubulina este localizată în mod specific la capătul minus al microtubulilor. γ-Tubulina marcată cu GFP poate fi utilizată pentru a eticheta capetele minus in vivo și fără cerința de colorare. Fan și colab. au dezvoltat un anticorp de afișare fagică specific a-tubulinei care poate fi utilizat pentru a vizualiza capete minus. Vezi figura de mai jos.

Imaginea este o micrografie electronică, dar cu siguranță este posibil să se facă o microscopie fluorescentă după colorarea IHC.


Pivotarea microtubulilor acționate de motoarele direcționate spre minus duce la asamblarea axului

La începutul mitozei, celula formează un fus format din microtubuli și proteine ​​asociate pentru a segrega cromozomii. O parte importantă a arhitecturii fusului este un set de fascicule de microtubuli antiparalel care conectează polii fusului. O întrebare cheie este modul în care microtubulii care se extind în unghiuri arbitrare formează un fascicul interpolar antiparalel.

Rezultate

Aici, arătăm în drojdia de fisiune că microtubulii se întâlnesc la un unghi oblic și ulterior se rotesc în aliniament antiparalel. Abordarea noastră imagistică cu celule vii oferă o observare directă a formării fasciculului interpolar. Combinând experimentele cu teoria, arătăm că microtubulii din fiecare pol îi caută pe cei de la polul opus efectuând mișcări unghiulare aleatorii. La contact, doi microtubuli alunecă lateral unul de-a lungul celuilalt într-o manieră direcționată către configurația antiparalelă. Introducem lungimea conturului microtubulilor ca măsură a activității motoarelor care antrenează alunecarea microtubulilor, pe care am folosit-o împreună cu observarea motoarelor Cut7/kinesin-5 și teoria noastră pentru a dezvălui motilitatea direcționată la capătul minus a acestui motor in vivo.

Concluzie

Mișcarea de rotație aleatorie ajută microtubulii de la polii opuși să se găsească unul pe altul, iar acumularea ulterioară de motoare le permite să genereze forțe care conduc la formarea fasciculului interpolar.


Abstract

Deși instabilitatea dinamică a microtubulilor (MT) se crede că depinde de nucleotida guanină (GTP vs GDP) legată de β-tubulină a subunităților terminale, capătul minus MT prezintă instabilitate dinamică chiar dacă β-tubulina terminală este întotdeauna încoronat de GTP−α-tubulină. Ca o abordare pentru înțelegerea modului în care instabilitatea dinamică apare la capătul minus, am investigat efectele N-tubulină modificată cu etilmaleimidă (NTb) privind alungirea și scurtarea rapidă a MT-urilor individuale. NTb inhibă de preferință ansamblul final minus atunci când este combinat cu tubulină nemodificată (PCTb), dar mecanismul de inhibare este necunoscut. Aici, microscopia de contrast cu interferență diferențială îmbunătățită video a fost utilizată pentru a observa efectele NTb asupra MT-urilor asamblate din PCTb pe fragmente de axonemă. MT-urile au fost expuse la amestecuri de PCTb (25 μM) și NTb (marcate pe ≈1 Cys per monomer) în care raportul NTb/PCTb a variat de la 0,025 la 1. Amestecul NTb/PCTb a avut un ușor efect inhibitor asupra alungirii la capătul plus. rata, dar semnificativ inhibată sau complet oprită minus alungirea capătului. Pentru majoritatea amestecurilor care au fost testate (raport 0,1-1 NTb/PCTb), minus lungimea MT a rămas constantă până când amestecul NTb/PCTb a fost înlocuit. Înlocuirea cu PCTb a permis alungirea să continue, în timp ce înlocuirea cu tampon sau NTb a cauzat scurtarea capetelor minus. Luate împreună, rezultatele indică faptul că NTb se asociază atât cu capete plus cât și cu minus și că NTb acționează pentru a acoperi capetele minus în mod reversibil numai atunci când este prezent și PCTb. Maparea cu rezoluție scăzută a reziduurilor Cys marcate, împreună cu experimentele anterioare cu alți compuși Cys-reactivi, sugerează că modificarea β-tubulinei Cys 239 poate fi asociată cu acțiunea de limitare a NTb.

Această lucrare a fost susținută de NIH Grant GM52340 (la RAW), o grant în sprijinul cercetării de la Sigma-Xi (KKP) și o grant pentru Proiectul de cercetare universitară (GRDP) (KKP) de la Adunarea Studenților Absolvenți de la Politehnica Virginia Institutul și Universitatea de Stat.

Cui trebuie adresată corespondența: Departamentul de Biologie, Institutul Politehnic din Virginia și Universitatea de Stat, Blacksburg, VA 24061-0406. Telefon: (540) 231-3803. Fax: (540) 231-9307. E-mail: [email protected]


DINAMICA MICROTUBULULOR ÎN ÎNVĂȚARE ȘI MEMORIE

Faptul că MT-urile sunt dinamice în neuronii maturi ridică întrebarea ce funcție ar putea servi dinamica lor într-o structură neuronală extrem de polarizată și relativ stabilă. O posibilitate este ca neuronii, ca toate celulele din organism, trebuie să răspundă la schimbările care apar în organism, iar dinamica MT poate fi un factor important în această plasticitate celulară. Plasticitatea este deosebit de importantă pentru neuroni, deoarece aceștia trebuie să-și mențină polaritatea extremă, dar să sufere și modificări de-a lungul duratei de viață a organismului. Având în vedere că majoritatea neuronilor din creierul mamiferelor sunt postmitotici, o zonă în care apar modificări plastice este prin sinapsă, joncțiunea dintre butonul axonal presinaptic și coloana vertebrală dendritică postsinaptică (Figura 2). Modificările morfologice și moleculare ale sinapselor, atât presinaptic cât și postsinaptic, sunt considerate pe scară largă drept substrat pentru învățare și memorie (Xu et al., 2009 Yang et al., 2009 Hubener și Bonhoeffer, 2010). Astfel, plasticitatea coloanelor dendritice joacă, fără îndoială, un rol cheie în buna funcționare a creierului, iar defectele plasticității coloanei vertebrale sunt adesea asociate cu boli și neurodegenerare (Sala și Segal, 2014).

FIGURA 2: Microtubulii sunt capabili să se polimerizeze în spini dendritici. Un grup de neuroni maturi ai SNC care prezintă spini dendritici localizați atât de-a lungul dendritelor apicale, cât și ale dendritelor bazale. Axonul este colorat în verde. Tijele orizontale verzi indică axonii de la alți neuroni care cresc perpendicular pe dendritele apicale. Inset prezintă doi spini de-a lungul unei dendrite care fac sinapse pe doi axoni perpendiculari. Veziculele presinaptice sunt prezentate în axoni. În acest exemplu, un microtubul dinamic polimerizează în coloana vertebrală dendritică dreaptă, extinzându-se bine în capul coloanei vertebrale.

Mai multe studii recente au început să sugereze că dinamica MT în dendrite joacă un rol important în funcția creierului și boli. Potențarea pe termen lung (LTP), un protocol de stimulare care imită formarea memoriei ex vivo și poate modifica amintirile la șoarecii vii (Nabavi et al., 2014), este afectată de modificările dinamicii MT. Stabilizarea farmacologică a MT cu paclitaxel (Shumyatsky et al., 2005) sau inhibarea polimerizării MT cu nanomolar (Jaworski et al., 2009) sau micromolar (Barnes et al., 2010) concentrațiile de nocodazol abrogă LTP. Un avertisment important al acestor studii este că toate au folosit aplicarea în baie a medicamentelor MT, care afectează atât MT-urile axonale (presinaptice) și dendritice (postsinaptice), cât și MT-urile gliale. Prin urmare, nu este posibil să se determine exact ce procese dependente de MT afectează LTP. Cu toate acestea, aceste date sugerează că MT-urile ar putea juca un rol cheie în formarea sau reținerea memoriei.

Studierea dinamicii MT direct la animalele vii este extrem de dificilă, totuși, au fost folosite metode ingenioase pentru a determina dacă dinamica MT funcționează în învățare și memorie în organismul intact. Prin eliminarea staminului, o proteină care leagă tubulina și inhibă polimerizarea MT, Shumyatsky et al. (2005) au demonstrat că afectarea stabilității MT are ca rezultat deficite în LTP, în plus față de frica învățată și înnăscută la șoareci. Un studiu ulterior efectuat de un alt grup a implementat o metodă cu izotop stabil pentru a eticheta tubulina nou sintetizată, care este încorporată în MT care suferă de instabilitate dinamică (Fanara et al., 2010). Prin purificarea fracțiilor MT asociate cu tau (un proxy pentru MT-urile axonale) și asociate cu MAP2 (un proxy pentru MT-urile dendritice), precum și fracțiile MT stabile la rece (MT-uri hiperstabile, în general, prezente numai în neuroni), acest grup a arătat că contextual condiționarea fricii a dus la creșterea cifrei de afaceri a MAP2 și a fracțiunilor stabile la rece (Fanara et al., 2010). Inhibarea polimerizării MT prin injecția cu nocodazol a inhibat înghețarea în paradigma fricii contextuale, în timp ce includerea paclitaxelului (pentru a stabiliza MT) sau a factorului neurotrofic derivat din creier (BDNF) a salvat înghețarea. În mod similar, nocodazolul a inhibat creșterea densității coloanei vertebrale în hipocamp și cortex după condiționarea fricii contextuale, iar aceste efecte au fost salvate de paclitaxel sau BDNF. Deși nu este posibil să se identifice în mod direct care celule și ce modificări subcelulare în stabilitatea MT au loc în acest studiu, este încă intrigant faptul că perturbarea MT poate afecta învățarea și memoria.

Dovezi mai recente, concentrate pe o proteină specifică asociată cu MT, au arătat că învățarea poate induce o schimbare bifazică dependentă de fosforilarea stathminei a stabilității MT (Uchida et al., 2014). Folosind condiționarea fricii contextuale, urmată de preparate sinaptozomale și blotting cantitativ, acest grup a arătat că a existat o creștere a tubulinei tirozinate, care indică MT-uri noi/dinamice, la 30 de minute după antrenament, urmată de o creștere a tubulinei detirozinate, care indică o creștere a tubulinei mai vechi/stabile. MTs, 8 ore după antrenament. De interes, ei ar putea perturba farmacologic formarea memoriei prin injectarea intrahipocampală de paclitaxel în faza timpurie și ar putea inhiba sau spori faza târzie a hiperstabilității MT prin injectarea de nocodazol sau, respectiv, paclitaxel. Mai mult, ei au arătat că staminul reglează transportul subunității GluA2 a receptorului acidului propionic α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-izoxazol propionic prin KIF5, rezultând o creștere a GluA2 la locurile sinaptice, ceea ce a promovat memoria pe termen lung. Această idee a unei faze timpurii în care MT sunt hiperdinamice, urmată câteva ore mai târziu de o fază în care MT sunt hiperstabile este intrigantă și sugerează, cum ar fi Fanara. et al. (2010), că manipularea dinamicii MT poate afecta învățarea și memoria.


Formarea și spargerea microtubulilor

BERKELEY, CA & ndash Microtubulii sunt polimeri proteici activi critici pentru structura și funcția celulelor și procesul de diviziune celulară. Într-o celulă vie, capetele lor în creștere se alungesc în mod constant și se retrag într-o frenezie zdrobitoare de polimerizare și depolimerizare, ca șerpii care se zvârcesc ai părului Medusei. Cunoscută prozaic ca „instabilitate dinamică”, această creștere și contracție rapidă în curs de desfășurare este cheia funcționării diverse a microtubulilor din celulă.

Pentru prima dată, cercetătorii au dezvăluit la nivel molecular formele luate de structurile de tranziție ale tubulinei (proteina din care se formează microtubulii) în timpul asamblării și dezasamblarii microtubulilor. Detaliile acestor structuri deosebite arată modul în care legarea de tubulină a nucleotidului guanozin trifosfat, GTP, controlează activitatea la capătul de creștere al microtubulului. Eva Nogales și Hong-Wei Wang de la Divizia de Științe ale Vieții a Laboratorului Național Lawrence Berkeley al Departamentului de Energie își raportează concluziile în numărul din 16 iunie 2005 al revistei Nature.

„Tubulina este o țintă majoră pentru medicamentele anticancerigene, care pot împiedica tranziția de la creșterea la stările de scădere sau invers”, spune Nogales, care este, de asemenea, membru al Diviziei de bioștiințe fizice a laboratorului Berkeley, profesor asociat de biochimie și biologie moleculară la Universitatea din California din Berkeley și investigator al Institutului Medical Howard Hughes. „Am produs anterior structuri de înaltă rezoluție ale structurilor de tubulină stabilizate, dar nimeni nu știa structura stărilor de tranziție. Scopul nostru a fost să înțelegem procesul de asamblare și dezasamblare a microtubulilor”.

Wang spune: „Lucrările noastre actuale au dezvăluit de fapt structurile diferitelor ansambluri de tubulină la extremitățile microtubulilor în creștere și ale microtubulilor depolimerizați. Acest lucru permite o nouă înțelegere a mecanismului instabilității dinamice a microtubulilor, deschizând oportunități pentru noi experimente care testează rolurile fiziologice ale acestor microtubuli. intermediari de microtubuli în celulă.”

Richard Rodewald, ofițer de program și biolog celular la Institutul Național de Științe Medicale Generale, care a finanțat cercetarea, a remarcat că „aceste studii oferă un model persuasiv, în detalii atomice elegante, pentru modul în care legarea GTP la un anumit site din tubulină conduce. la schimbări structurale de anvergură care conduc la creșterea microtubulilor.”

Construirea unui microtubul

Microtubulii sunt polimeri ale căror unități de bază sunt perechi (dimeri) de proteine ​​tubulinice similare, dar nu identice, denumite formele alfa și beta. În timpul polimerizării, dimerii se stivuiesc cap la cap pentru a forma un protofilament. Aproximativ treisprezece protofilamente sunt dispuse unul lângă altul, extinzându-se longitudinal, pentru a forma pereții unui microtubul cilindric.

Așa-numitul capăt minus al microtubulului crește lent și este adesea ancorat de o structură celulară. Celălalt capăt, capătul plus, este un focar de activitate. În prezența GTP, protofilamentele microtubulilor dobândesc mai mulți dimeri de tubulină, iar întregul microtubul se extinde rapid timp de multe milioanemi de metru înainte de a se opri brusc și a se micșora din nou.

Nucleotidele precum GTP sunt cel mai bine cunoscute ca unități ale acizilor nucleici ADN și ARN, constând dintr-o bază (o literă în codul genetic) plus un zahăr și trei grupe fosfat. Dar aceste molecule reglează și activitatea enzimelor și joacă un rol crucial în controlul creșterii microtubulilor.

Când GTP se leagă de un anumit locus al beta tubulinei (locul E sau locul schimbabil) are loc polimerizarea: dimerii de tubulină se adună pe protofilamente, iar microtubulul crește. Dar prin hidroliză (cuvântul înseamnă „diviziunea apei”), GTP se schimbă cu ușurință într-o nucleotidă diferită, guanozin difosfat sau GDP. Tubulina legată de GDP depolimerizează microtubul prin ondularea protofilamentelor la capătul său plus și smulgând-o.

Deși se știa că tubulina polimerizează în prezența GTP și se depolimerizează în prezența GDP, înainte de Nogales și Wang era imposibil să se vizualizeze ceea ce se întâmpla structural în timpul acestor stări de tranziție rapidă. Apoi, spune Nogales, „Hong-Wei a găsit trucuri biochimice pentru a încetini tranzițiile aproape până la punctul de a le opri”.

Microscopia crio-electronică (cryo-EM) este capabilă să capteze astfel de structuri polimerice fără a fi nevoie să le descompună și să cristalizeze subunități individuale pentru analiza de difracție cu raze X. Difracția cu raze X ar putea permite o rezoluție mai mare, dar ar pierde toate informațiile referitoare la contactele dintre subunități în timpul polimerizării. „Cu cryo-EM, prin modificarea parametrilor am putea vedea cum se convertesc diferite forme de polimer”, spune Nogales.

Nogales și Wang au abordat mai întâi procesul de depolimerizare, urmărind ce se întâmplă cu microtubuli atunci când PIB-ul este legat de tubulină. În timpul acestui proces, protofilamentele de tubulină se curbează brusc înapoi de la capătul microtubulului, formând „coji”, ca un ras de lemn care se înfășoară dintr-un plan. Wang a găsit condiții în care buclele tubulinei legate de GDP se închid în tuburi, cu protofilamentele strâns înfășurate în jurul axei tubului. Aceste tuburi sunt în două straturi, o proprietate care contribuie la stabilitatea lor, dar a pus și frâna proiectului pentru o lungă perioadă de timp.

„Cheia a fost să blochezi ansamblurile de tubulină în stările corecte potrivite pentru analiza structurală, dar și mai dificilă a fost găsirea unui algoritm pentru a reconstrui tuburile GDP-tubulină cu două straturi”, spune Wang.

„Datorită proprietății cu două straturi, ne-a fost imposibil să folosim metode clasice de reconstrucție elicoidal”, spune el, „dar nu existau alte metode disponibile atunci când am început proiectul. A trebuit să petrecem peste doi ani în dezvoltarea și implementarea noastră. propriul algoritm. Odată ce a fost gata, am reușit să obținem reconstrucția corectă în mai puțin de trei luni.”

Apoi, cercetătorii au abordat procesul de polimerizare, urmărind ce se întâmplă atunci când GTP este legat de moleculele de tubulină. Dacă PIB-ul determină cumva protofilamentele să se înmulțească strâns, GTP face opusul, determinând ca protofilamentele să se îndrepte și să se adune în microtubuli. Dar, deoarece GTP se poate hidroliza rapid în PIB, capturarea stărilor de tranziție ale tubulinei legate direct de GTP a fost nepractică.

În schimb, cercetătorii au lucrat cu o moleculă similară, GMPCPP, un analog al GTP care se leagă de același loc, dar nu este vulnerabil la hidroliză. Folosind crio-EM, au reușit să captureze tubulina legată de GMPCPP în timpul etapelor inițiale de creștere a microtubulilor.

La temperaturi scăzute, tubulina legată de GMPCPP formează panglici curbate din câteva protofilamente una lângă alta, pe măsură ce acestea cresc mai late, panglicile apropiate în tuburi elicoidale foarte mari cu un diametru de 500 de angstromi, în loc de diametrul subțire de 25 de angstromi al unui microtubul ( un angstrom este o zece miliarde de metru, aproximativ dimensiunea unui atom mic).

Ridicate la temperatura corpului, totuși, panglicile protofilamentare se îndreaptă imediat și se transformă în microtubuli normali, sugerând că panglicile și foile ușor curbate corespund protofilamentelor polimerizate de la capătul unui microtubul în creștere.

În 1998, când era bursier postdoctoral în laboratorul lui Kenneth Downing, un om de știință senior în divizia de științe a vieții a Berkeley Lab, Nogales a obținut structura atomică a tubulinei în forma ei stabilă, dreaptă, folosind metode de cristalografie electronică, în care bidimensională. rețele de polimeri „plati” de tubulină au fost studiate folosind crio-EM și difracția de electroni.

Prin „ancotarea” acestui model cristalografic în structurile pe care le-au obținut acum pentru intermediarii de polimerizare la rezoluție mai modestă, Nogales și Wang au reușit să vadă schimbări în moleculele de tubulină, cum este modificată capacitatea lor de a interacționa cu alte molecule prin legarea de GTP sau GDP și modul în care aceste modificări controlează îndoirea și flexibilitatea.

Ei au descoperit că în tubulina legată de GDP, contactele dintre tubulinele alfa și beta din interiorul și între dimeri sunt ambele afectate, deși în moduri semnificativ diferite, rezultând un protofilament curbat care nu poate forma contacte laterale.

În schimb, în ​​tubulina care leagă analogul GTP GMPCPP, contactele dintre subunități sunt suficient de drepte pentru a permite interacțiunea laterală între protofilamentele în creștere. Nogales spune: „Asemenea contacte par semiconservate în raport cu cele observate anterior în microtubuli și sugerează un mecanism prin care microtubulii vor crește mai întâi în foi deschise care sunt capabile să se „fermeze” rapid într-un tub închis.

Interesant este că atât în ​​starea de tranziție de polimerizare, cât și de depolimerizare, protofilamentele apar de obicei în perechi. Acest lucru este derutant, deoarece cel mai comun microtubul are 13 protofilamente, ceea ce indică o modificare a numărului de protofilamente după hidroliza GTP, printr-un mecanism încă neînțeles.

Noile modele de înaltă rezoluție ale stărilor de tranziție ale tubulinei vor fi folosite pentru a înțelege modul în care microtubulii își explorează mediul celular pentru a-și găsi obiectivele și reprezintă un proces esențial pentru desfășurarea precisă a fusurilor în timpul diviziunii celulare, de exemplu &mdash și modul în care medicamentele pot fi proiectate și vizate. pentru a pune o cheie de maimuță în creșterea celulelor canceroase.

Flexibilitatea de curbare dependentă de nucleotide a tubulinei reglează asamblarea microtubulilor, de Hong-Wei Wang și Eva Nogales, apare în numărul din 16 iunie 2005 al revistei Nature.

Această cercetare a fost finanțată de Institutul Național de Științe Medicale Generale din National Institutes of Health. Laboratorul Eva Nogales este susținut și de Departamentul de Energie și Institutul Medical Howard Hughes.


Rezultate

Evenimente timpurii în timpul intrării HSV-1

Datorită dimensiunii mari a virionilor și capsidelor HSV-1, interacțiunile timpurii dintre celulele virusului pot fi ușor vizualizate prin EM (Campadelli-Fiume și colab., 1988 Fuller și colab., 1989 Lycke și colab., 1988). Am urmărit capsidele de intrare în diferite stadii de intrare în celulele Vero (Fig. 1). Particulele virale extracelulare, legate la suprafață, aveau caracteristicile familiare ale unui virus herpes: o înveliș membranar cu vârfuri, o capsidă cu un miez de ADN dens în electroni și un strat de tegument între capside și înveliș (Fig. 1, A și b). Imaginile fuziunii dintre învelișul viral și membrana plasmatică au fost obținute cu ușurință (Fig. 1, c și d). După fuziune, capsidele au părut să se separe de cea mai mare parte a tegumentului, deoarece o masă densă de electroni a rămas asociată cu suprafața citoplasmatică a membranei plasmatice (Fig. 1, e și f, vârfuri de săgeți vezi şi CampadelliFiume şi colab., 1988 Fuller şi colab., 1989).

După 1 oră, primele capside au ajuns la nucleu și s-au atașat de complexele porilor nucleari (Fig. 1, g și h vezi, de asemenea, Batterson şi colab., 1983 Lyke şi colab., 1988). Păreau să se lege de fibrele citosolice care ies din pori (vezi vârfuri de săgeți în Fig. 1 h). Deoarece majoritatea capsidelor de pe învelișul nuclear nu aveau masa centrală densă în electroni, se pare că a avut loc eliberarea de ADN. La momente ulterioare, unele capside goale au fost, de asemenea, văzute libere în citosol, fără conexiune cu nucleul. Ocazional, la 1 oră după infecție și mai târziu, virioni intacți și parțial degradați au fost observați și în endozomi și lizozomi, indicând faptul că o fracțiune din inocul a fost preluată de endocitoză.

Rata și eficiența legării suprafeței celulare și internalizarea ulterioară au fost testate cantitativ utilizând HSV-1 marcat cu [3H]timidină. Pentru a monitoriza legarea, celulele au fost incubate cu virus marcat la un MOI de 10, 50 sau 100 la 4°C, iar radioactivitatea asociată celulelor a fost măsurată la momente diferite. După cum sa raportat anterior, a fost observată o creștere continuă a legării virusului până la 4 ore, fără semne de saturație (Fig. 2). A McClain şi Fuller, 1994 Shieh şi colab., 1992). La 2 ore - perioada de adsorbție utilizată în toate experimentele ulterioare - s-a legat aproximativ 40% din virusul adăugat.

Pentru a urmări biochimic internalizarea, a fost utilizat un test de protecție cu protează (Helenius și colab., 1980). După o perioadă de legare de 2 ore la rece, celulele au fost încălzite până la 37°C pentru diferite perioade de timp pentru a iniția penetrarea. După aceea, au fost răciți la 4°C și tratați cu proteinază K pentru a detașa virusurile de suprafață celulară rămași. Fracția de virus protejată de protează a crescut rapid după încălzire (Fig. 2,b) cu o jumătate de timp de interiorizare de 8 min. Rezistența totală la protează a atins un nivel de 70% în 30 de minute. Eficiența și rata de internalizare au fost identice într-un interval de multiplicitate de la 3 × 10 -4 -10 MOI. Tratamentul celulelor cu nocodazol, un medicament care depolimerizează MT (Fig. 2). b, ND), sau cu citocalasina D, care depolimerizează filamentele de actină (neprezentate), nu a avut nici un efect, nici asupra eficienței legării și internalizării, nici asupra cineticii internalizării. În concordanță cu rapoartele anterioare care utilizează inactivarea acidă și testele plăcii pentru a evalua internalizarea virusului (Huang și Wagner, 1964), aceste rezultate au arătat că penetrarea HSV-1 are loc rapid și eficient.

Transportul capsidelor de la membrana plasmatică la nucleu

Microscopia cu imunofluorescență indirectă a fost apoi utilizată pentru a analiza transportul capsidelor individuale de la periferia celulei la nucleu. Anticorpii utilizați au fost fie împotriva VP-5 (anti-NC-1) fie împotriva VP19c (anti-NC-2), cele două proteine ​​majore de capside, fie împotriva capsidelor întregi purificate (anti-HC și anti-LC). Toți anticorpii au dat rezultate similare și au avut în comun faptul că au colorat capsidele care se aflau în citosol (Fig. 3, 1 h), dar nu și capsidele prezente în virusurile intacte legate la suprafață (Fig. 3, 0 h). Probabil că această selectivitate utilă a fost cauzată de accesibilitatea la antigen, epitopii capside relevanți din particulele de virus intacte au fost probabil ascunși de componentele învelișului și/sau tegumentului. În schimb, anticorpii anti-capside au marcat capside virale pe criosecții dezghețate (Sodeik, B., M.W. Ebersold și A. Helenius, observații nepublicate).

Capsidele din citoplasmă au apărut ca pete mici, intens marcate (Fig. 3, săgeți, 1 h). Folosind microscopia imunoelectronică pe criosecțiuni ultrasubțiri dezghețate, am confirmat că aceste pete reprezentau capside unice (neprezentate). Toate structurile marcate în citosol sau la nivelul membranei nucleare de anticorpi direcționați împotriva capsidei sau împotriva VP5 au reprezentat capside virale singulare (neprezentate). Numărul de puncte marcate fluorescent a crescut continuu în prima oră de încălzire. În plus, distribuția lor în interiorul celulei s-a schimbat odată cu creșterea timpului: de la periferia celulei spre nucleu, unde s-au acumulat la marginea nucleară (Fig. 3, 2 h). După 4 ore, practic toate petele au fost localizate la membrana nucleară (Fig. 3, 4 h) unde se vedeau câteva sute de capside. Astfel, capsidele citosolice de intrare au fost transportate eficient de la periferie la nucleul gazdă.

Capsidele se leagă de microtubuli

Microscopia cu imunofluorescență dublă folosind anticorpi anti-capside și anti-tubulină a arătat că majoritatea capsidelor care nu erau legate de nucleu au fost asociate cu MT (Fig. 4, A și b). Mai mult, în multe celule, capsidele au fost observate concentrându-se în jurul centrului de organizare MT (MTOC) (Fig. 4,b). Asocierea strânsă a capsidelor cu MT a fost confirmată de EM (Fig. 4, c–e). Numeroase capside citoplasmatice au fost observate în imediata apropiere a filamentelor citoplasmatice cu lățimea așteptată de 24 nm și morfologie asemănătoare MT. De obicei, distanța dintre suprafața capsidei și tubuli a fost de aproximativ 50 nm, ceea ce sugerează prezența unor componente suplimentare de legare. ADN-ul viral din interiorul capsidelor asociate cu MT ar putea fi văzut ca un material colorat întuneric.

Tubulii au fost identificați fără ambiguitate ca MT prin marcarea cu antitubulină a specimenului care a fost preextras cu TX-100 înainte de fixare. După o astfel de extracție, au putut fi vizualizate secțiuni mai groase, permițând analiza MT pe distanțe mai mari. Capsidele asociate MT conțineau în general ADN viral (Fig. 4,f, săgeți). La momentele ulterioare, majoritatea capsidelor erau goale și situate de obicei la porii nucleari și nu la membrana anvelopei nucleare (Fig. 4,g). Majoritatea acestor capside nu conțineau ADN (Fig. 4, g și h). La 4 ore după infecție, au existat ocazional capside goale localizate pe MT în imediata apropiere a nucleului (neprezentat). Ori de câte ori au fost observați viruși extracelulari în aceste probe extrase cu TX-100, aceștia au fost înconjurați de material foarte dens de electroni, care probabil reprezentau glicoproteinele virale și proteinele tegumentului care aparent nu au fost îndepărtate în timpul extracției (Fig. 4). h, săgeată curbată).

Cuantificarea intrării HSV-1 și transportului capsidelor

Pentru a cuantifica cinetica transportului capsidei citosolice, am determinat localizarea subcelulară a virusului primit prin EM la diferite momente de timp postinfecție la un MOI de 500 (Fig. 5). Pentru a compara acest experiment cu microscopia cu imunofluorescență, secțiunile ultrasubțiri au fost tăiate paralel cu substratul prin regiunea bazală a celulelor (vezi Fig. 5,A). Pentru fiecare punct de timp, au fost luate 25 de micrografii electronice într-un mod sistematic aleatoriu și s-au determinat numărul și localizarea capsidelor citosolice. Capside citosolice (Fig. 5,b) au fost localizate la nivelul membranei plasmatice (Fig. 5,c), în citosol fără legătură evidentă cu vreun organel (Fig. 5,d), la MT (Fig. 5,e), sau la nucleu (Fig. 5 f).

După încălzire, numărul total de capside citosolice a crescut rapid, atingând un vârf după 60 de minute (Fig. 5,b). Ulterior, numărul de capside citosolice a scăzut, sugerând că capsidele au fost în cele din urmă dezasamblate. De asemenea, am marcat dacă capsidele citosolice au conținut miezul ADN-ului viral dens în electroni sau dacă păreau goale (vezi Fig. 1). Până la 60 de minute după internalizare, nu au fost detectate capside goale, în timp ce după 2 ore 20% și după 4 ore 64% își pierduseră miezul de ADN dens în electroni (Fig. 5). b). Virionii din endozomi au atins vârful la 1 oră și au scăzut brusc după aceea. Este posibil să fi fost degradate sau reciclate înapoi la suprafața celulei sau capsidele ar fi putut fi eliberate prin fuziune în citosol.

La 15 minute postinfecție, aproape 70% din toate capsidele citosolice au fost localizate la 100 nm de membrana plasmatică (vezi Fig. 1, c–f, și 5 c). Toate capsidele din apropierea membranei plasmatice au conținut miezul ADN viral. La 1 oră după infecție, majoritatea capsidelor citosolice (aproape 80%) aveau o locație intermediară, nu erau nici aproape de membrana plasmatică, nici de nucleu (Fig. 5, d și e). O fracție semnificativă (10% din toate capsidele citosolice) a fost colocalizată cu MT (vezi Fig. 4, c–e, și 5 e). Deoarece capsidele (125 nm) sunt considerabil mai mari decât grosimea secțiunii (60–70 nm), cifra pentru colocalizarea cu MT a fost cel mai probabil o subestimare. Dintre capsidele citosolice, doar o capside (0,9% din toate capsidele la 4 ore după infecție) a fost observată a fi colocalizată cu filamente intermediare (neprezentate).

Capsidele citosolice au ajuns la nucleu la 2 ore după infecție, iar la 4 ore, majoritatea capsidelor citosolice (>60%) au fost localizate în nucleu (Fig. 5,f). La momentele anterioare (până la 1 oră), <4% din capsidele citosolice au fost localizate la nucleu. Dintre capsidele nucleare, 68% la 2 ore și 87% la 4 ore au fost goale, ceea ce sugerează că eliberarea ADN-ului a avut loc după sosirea la nucleu. Marea majoritate a capsidelor goale au fost localizate în nucleu (Fig. 5,g). Toate capsidele de la nucleu au fost localizate la complexele porilor nucleari (vezi Fig. 1, g și h).

În rezumat, experimentul cu microscopul electronic a confirmat datele microscopiei cu imunofluorescență. Capsidele citosolice au fost transportate eficient de la membrana plasmatică prin citosol la complexele porilor nucleari. În timpul tranzitului, o fracțiune semnificativă atașată la MT. Capsidele goale au apărut la scurt timp după sosirea lor la nucleu, iar unele dintre acestea au fost eliberate în citosol. În cele din urmă, capsidele păreau să se dezambleze și să dispară, deoarece numărul total de capside citosolice a scăzut târziu în infecție. Interesant este că apariția capsidelor citosolice sub membrana plasmatică a atins vârful înainte de transportul virionilor în endozomi, sugerând cu tărie că capsidele citosolice timpurii au fost într-adevăr derivate din fuziunea virusului la membrana plasmatică, mai degrabă decât din fuziunea din endozomi.

Transport redus de capside la nucleu fără microtubuli

Pentru a determina dacă transportul eficient al capsidei prin citosol a depins de un citoschelet intact, celulele au fost infectate la un MOI de 50 timp de 2 ore în prezența medicamentelor care afectează filamentele de MT sau actină. Microscopia de imunofluorescență a arătat că nici taxolul, un medicament care împiedică dezasamblarea MT (Wilson și Jordan, 1994), nici citocalazina D, un medicament care provoacă depolimerizarea filamentelor de actină (Cooper, 1987), nu au afectat transportul capsidei către nucleu (Fig. 6,A, panouri superioare). În schimb, acumularea capsidei la membrana nucleară a fost redusă semnificativ de colchicină, vinblastină și nocodazol (Fig. 6,A, panouri inferioare). Aceste medicamente interacționează cu tubulina prin diferite mecanisme moleculare (Wilson și Jordan, 1994). Etichetarea cu anti-tubulină a confirmat că colchicina și nocodazolul au depolimerizat MT, în timp ce vinblastina a cauzat formarea paracristalului de tubulină (nu este prezentată). În prezența acestor medicamente, majoritatea capsidelor au rămas împrăștiate în citosol. To test whether the effect of nocodazole was reversible, the cells were analyzed 2 h after drug removal. At this time, the MT had repolymerized, and the previously dispersed capsids were concentrated on the nuclear rim (Fig. 6 b).

Since we were unable to quantify the localization of the fluorescent spots representing cytosolic capsids reliably, we infected Vero cells at an MOI of 150 in the presence or absence of nocodazole and analyzed the embedded cell pellets by quantitative EM. For each experimental condition, 50 electron negatives were taken in a systematic, random fashion and the localization of cytosolic capsids was determined (Fig. 7, A și b). After 2 h of infection, 31% of the cytosolic capsids had reached the nucleus, and only 25% were still in close proximity to the plasma membrane. In contrast in the absence of MT, none had reached the nucleus, and 58% were still in the region close to the plasma membrane. After 4 h postinfection, 75% of all cytosolic capsids had reached the nucleus, 14% were at the plasma membrane, and the remaining 11% were present in the cytosol. In the presence of nocodazole, only 47% of the cytosolic capsids had reached the nucleus, 18% were still at the plasma membrane, and 36% were in the cytosol distant from both the plasma membrane and the nucleus.

As nocodazole, vinblastine, and colchicine all affect the network of MT (Wilson and Jordan, 1994), we concluded that MT are directly or indirectly involved in the rapid transport of capsids from the cell periphery to the nucleus in Vero cells. In cells devoid of functional MT, the arrival of capsids at the nucleus was significantly delayed.

Viral Infection in the Absence of Microtubules

Whether nocodazole would have an effect on productive infection was determined by monitoring the onset of viral protein synthesis in the presence or absence of the drug. Cell extracts prepared after different periods of infection were subjected to immunoblotting using antibodies against an early HSV-1 protein, ICP4, and a late structural protein, VP5. The results in Fig. 7 c show that the synthesis of both viral proteins was delayed and reduced in the absence of MT. Calnexin, an integral membrane protein of the ER (Hammond and Helenius, 1994), was used as a control and remained constant. Labeling with [ 35 S]methionine demonstrated that nocodazole had no overall effect on protein synthesis in uninfected or HSV-1–infected Vero cells (not shown).

When immunofluorescence microscopy using ICP4 was performed, we found that, under control conditions, viral protein synthesis commenced in many cells already at 2 h postinfection. In contrast, in the presence of nocodazole, only very few cells showed ICP4 labeling. At 4 h postinfection, all control cells were strongly labeled for ICP4, whereas in the absence of MT, significantly less cells show strong labeling for ICP4 (data not shown). However, at later time points, all cells synthezised ICP4, in the presence and absence of MT.

Thus, depolymerization of MT delayed the onset of viral protein synthesis in cultured fibroblasts, but did not prevent viral infection per se.

Dynein Colocalizes with Incoming Capsids

Our results strongly suggested that incoming herpes capsids move along MT toward the nucleus. Therefore, we ask whether they would use host MT-dependent motors for their transport. Since the antibody against tubulin often obscured the morphology of putative tethering factors located between the viral capsids and the MT (see Fig. 4), we repeated these experiments without immunolabeling. Electron-dense material was usually attached to the vertices of the capsids that were associated with MT (Fig. 8). The morphology of the appendages was variable, but, in some cases (Fig. 8 d, săgeată), they had the dimensions and the shape of cytoplasmic dynein, a minus end–directed MT-dependent motor. Dynein is a Y-shaped protein complex with a length of ∼50 nm. It is connected to its cargo via the stalk and to MT through two 14-nm globular domains (Gilbert and Sloboda, 1989 Vale, 1990 Vallee et al., 1988).

To test whether cytoplasmic dynein was, indeed, associated with the capsids, we used an affinity-purified antibody directed against the heavy chain of cytoplasmic dynein (Vaisberg et al., 1993). Immunoelectron microscopy with the anti-dynein antibody was performed on ultrathin cryosections of in situ fixed cells 1 or 2 h after initiation of virus entry. In addition to a low level of labeling of the cytoplasm, dynein was found to be localized on the surface of endosomes (Fig. 9,h), mitochondria (Fig. 9,A), and the Golgi apparatus (Fig. 9,A). Very few gold particles were seen over the nucleus and the mitochondrial matrix (Fig. 9, A, c, și d). The mitochondria, which do not contain dynein, served as a background control. Compared with the mitochondrial matrix, there was a slightly higher labeling in the nuclei, and the cytoplasm was labeled 2.3-fold higher than background (Table I).

In cells containing incoming HSV-1 capsids, dynein was, in addition, found associated with many of the capsids (Fig. 9, a–f). Capsids directly underneath the plasma membrane (Fig. 9,g) and within the cytoplasm (Fig. 9,b), as well as capsids in close proximity to the nucleus (Fig. 9, A, c, și d), were labeled with anti-dynein. On average, 13% of the cytoplasmic capsids were labeled (Table I). Capsids of intact virions, either extracellular (Fig. 9,f) or within endosomes (Fig. 9, g și h), were not labeled. Only 1.5% of all capsids present in virions had colloidal gold particles in close proximity (Table I). Thus, the labeling density was eightfold higher on cytosolic capsids compared with capsids within virions, ruling out the possibility that the antidynein antibody showed cross-reactivity to capsid proteins. Given that the labeling efficiency using this technique does not exceed 10%, e.g., only 10% of the primary antibody present on the sections is detected by protein A–gold (Griffiths, 1993A), these results showed that incoming cytosolic viral capsids associated with cytoplasmic dynein.


SPR2 protects minus ends to promote severing and reorientation of plant cortical microtubule arrays

The cortical microtubule arrays of higher plants are organized without centrosomes and feature treadmilling polymers that are dynamic at both ends. The control of polymer end stability is fundamental for the assembly and organization of cytoskeletal arrays, yet relatively little is understood about how microtubule minus ends are controlled in acentrosomal microtubule arrays, and no factors have been identified that act at the treadmilling minus ends in higher plants. Aici, ne identificăm Arabidopsis thaliana SPIRAL2 (SPR2) as a protein that tracks minus ends and protects them against subunit loss. SPR2 function is required to facilitate the rapid reorientation of plant cortical arrays as stimulated by light perception, a process that is driven by microtubule severing to create a new population of microtubules. Quantitative live-cell imaging and computer simulations reveal that minus protection by SPR2 acts by an unexpected mechanism to promote the lifetime of potential SPR2 severing sites, increasing the likelihood of severing and thus the rapid amplification of the new microtubule array.


Tim Mitchison

Tim Mitchison completed his undergraduate degree in biochemisty at Oxford University before moving to the University of California, San Francisco to do his PhD with Marc Kirschner. After a brief post-doc at National Institute for Medical Research in London, Mitchison returned to UCSF as an assistant professor in 1988. In the late 1990s, he moved… Continue Reading


Materiale și metode

More detailed descriptions of the materials and methods used in this study are provided in Anexa SI, Materiale și metode.

Animale.

All animal experiments were approved by the Animal Center of the Institute of Genetics and Developmental Biology (IGDB), Chinese Academy of Sciences, and by the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of RIKEN Kobe Branch, and were conducted in accordance with the IACUC guidelines at IGDB and RIKEN Kobe Branch. Mice were maintained in specific pathogen-free conditions in the animal facility and housed on a 12-h light/12-h dark cycle with ad libitum access to food and water.

Cell Culture, Transfection, and Immunofluorescence.

Neurons were isolated from P0 mice and maintained in Neurobasal medium supplemented with 2% B27 (Gibco), 2 mM L-glutamine, and 1% penicillin/streptomycin (Gibco) at 37 °C in 5% CO2. HEK293 cells were maintained in DMEM/F12 containing 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin at 37 °C in 5% CO2.

Transfections were performing using Lipofectamine 2000 reagent or the Neon Transfection System (Invitrogen) according to the manufacturer’s instructions.

For immunofluorescence, neurons and brain sections were blocked with goat serum and subsequently incubated with primary antibodies and secondary antibodies. Finally, the neurons and sections were mounted on slides with FluorSave reagent (MilliporeSigma).

Immunoprecipitation and Mass Spectrometry.

The cultured cells or dissected tissues were lysed in cold buffer containing protease inhibitor mixture. After centrifugation to remove insoluble fraction and preclearing of the sample with protein G-Sepharose, antibody and protein G-Sepharose were incubated with the sample, followed by centrifugation to collect the protein.

For MS analysis, protein samples were loaded onto sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis gels. The band was subjected to MS analysis after verification by Western blot analysis.

In Vitro MT Assays.

Taxol-stabilized MT seeds were attached to the coverslips, and CAMSAP1-GFP or mutant was added to the flow chamber to measure the binding ability. Here 4 mg/mL tubulin was mixed with protein or drug in polymerization buffer on ice, and 1 mM GTP was added to the solution. The solution was transferred into a prewarmed 384-well plate, and tubulin turbidity was measured at 340 nm. For the MT depolymerization assay, nocodazole was transferred into the wells, and the tubulin turbidity was measured at 340 nm for another 30 min.

Statistical Analyses.

Statistical tests were performed using GraphPad Prism, and a two-tailed Student’s t test determined all statistical comparisons between the data. All of the data are represented as mean ± SEM.

Data Availability Statement.

All pertinent data are available in the main text and Anexa SI.


Assembly and disassembly of plant microtubules: tubulin modifications and binding to MAPs

Giampiero Cai, Assembly and disassembly of plant microtubules: tubulin modifications and binding to MAPs, Journal of Experimental Botany, Volume 61, Issue 3, March 2010, Pages 623–626, https://doi.org/10.1093/jxb/erp395

Microtubules are dynamic heteropolymers of α- and β-tubulin that assemble co-ordinately in response to a variety of intracellular and extracellular signals and participate in a number of different functions in eukaryotic cells, from cell division to organelle transport, from RNA positioning to flagellar beating. In plant cells, microtubules assemble and disassemble during the cell cycle to organize different microtubule arrays. Interphase cortical microtubules have a critical role in the construction of the cell wall by controlling the correct deposition of cell wall polymers ( Lloyd and Chan, 2008). During cell division, microtubules are arranged into characteristic structures. The preprophase band (a circular array of microtubules) defines the future construction site of the cell plate, thus imposing asymmetry on the daughter cells. The mitotic spindle shares the function of the analogous structure of animal and fungal cells but its organization shows some critical differences, mainly caused by the absence of centrioles. The phragmoplast is a special microtubule array that substitutes the contractile ring of animal cells during cytokinesis, allowing the synthesis of a new cell wall that physically separates the two daughter cells. Since the four different microtubule arrays have distinct features and structures, use of different proteins (tubulin and non-tubulin) is a critical requisite for the assembly of each array. Understanding how individual proteins are used in the assembly of microtubules will allow a clearer picture of how microtubules perform their function and pass from interphase to mitotic arrays (and vice versa).

In this issue, Jovanovic and colleagues ( Jovanovic et al., 2010) report that the tyrosination/detyrosination cycle of tubulin could regulate the transition of plant cells from the elongation to the division stages. In their work, a specific compound (nitrotyrosine) is used irreversibly to incorporate tyrosine into detyrosinated α-tubulin the consequence of this post-translational modification is the inhibition of mitosis and the increase in cell elongation. The article points to the importance of post-translational modification of tubulin in the reorganization of the microtubule cytoskeleton during the life cycle of plant cells. Although microtubules within each array are apparently identical in structure, plants have distinct gene sets coding for both α and β -tubulin ( Guo et al., 2009). Tubulin genes are not expressed uniformly during plant development for example, a particular gene is expressed almost exclusively in reproductive organs ( Yu et al., 2009). At cellular levels, distinct α-tubulin genes can be specifically expressed in cells that exit from mitosis when transverse microtubules determine the cell shape ( Schröder et al., 2001). Generally, the expression of tubulin isotypes seems to be tissue-specific, a model that is also supported by immunological approaches (Parrotta et al., 2009). The use of different tubulin isoforms is further complicated by mechanisms of post-translational modifications which are used to label subpopulations of microtubules, and that work individually or in combination at the level of single cells to control specific microtubule functions in particular cell domains. The detyrosination/tyrosination of tubulin is probably involved in controlling the binding of plus-end tracking proteins and motor proteins with microtubule depolymerizing activity ( Peris et al., 2009) glutamylation and glycylation are hypothetically involved in the mechanism of microtubule severing by katanin ( Sharma et al., 2007). On the other hand, acetylation is a post-translational modification detected in stable microtubules of most cells, but is also likely to be involved in regulating kinesin-based motility ( Gardiner et al., 2007). Recently, the discovery of phosphorylated tobacco tubulin suggested that tyrosine phosphorylation is also involved in regulating the properties of plant microtubules ( Blume et al., 2008). A recent report suggests that addition of putrescine to tubulin by pollen transglutaminase can also regulate the binding and release of kinesin to/from microtubules ( Del Duca et al., 2009). Consequently, current data from genetic and biochemical approaches suggest a model in which development of specific plant cells and tissues is characterized by the expression of distinct tubulin genes and, consequently, by the use of distinct tubulin isotypes, which are post-translationally modified to control the binding of microtubule-associated proteins (MAPs).

MAPs are used to assemble different microtubule arrays according to the specific stage of the cell cycle and their interaction with microtubules is critical at almost every stage of microtubule life. After one microtubule is assembled by a γTuC nucleating complex (containing γ-tubulin and several gamma complex proteins or GCPs), stabilization of the growing end is supported by binding to specific proteins, such as MOR1, and/or by putative association with the plasma membrane through plus-end proteins like CLASP. Subsequent detachment of microtubules from the nucleating complex is probably supported by the activity of katanin. Net addition of α/β-subunits to the plus-end and the concomitant removal of subunits at the minus-end generate a treadmilling process, which is responsible for the translocation of microtubules in the cell cortex (plant MAPs are reviewed by Hamada, 2007). This process brings microtubules in contact with other cortical (bundles of) microtubules. In this context, post-translational modifications like glutamylation and glycylation hypothetically constitute signals for the severing activity of katanin ( Sharma et al., 2007), which could cut microtubules in order to increase their number. Microtubules moving by treadmilling in the cell cortex can be captured by other microtubules and organized into larger bundles by, for example, proteins of the MAP65 family ( Van Damme et al., 2004). In interphase cells, microtubules are anchored along their length to the plasma membrane by proteins that stabilize microtubules, such as p161 ( Cai et al., 2005), and/or by proteins that mediate the intercellular communication, like phospholipase D ( Gardiner et al., 2001). Association of the plus-end of microtubules with the plasma membrane and with the endomembrane system is probably mediated by a class of proteins collectively known as +TIPs, so far including EB1, SPR1, and the kinesin-14A ATK5 ( Pastuglia and Bouchez, 2007). Association of +TIPs with microtubules is potentially regulated by the C-terminal detyrosination/tyrosination of tubulin. Although previous studies showed that detyrosinated microtubules are less dynamic than those containing tyrosinated tubulin, more recent investigations indicate that the detyrosinated form of tubulin interacts specifically with kinesin-1 ( Liao and Gundersen, 1998), while tyrosinated microtubules interact preferentially with the plus-end protein CLIP170 ( Hammond et al., 2008). These findings suggest that the tyrosination/detyrosination of plus-end tubulin can regulate the binding of microtubules to MAPs and, consequently, their dynamics. Association of microtubules with motor MAPs could also be controlled by other post-translational modifications: microtubules containing acetylated tubulin interact preferentially with the motor proteins kinesin-1 and dynein ( Fukushima et al., 2009) while the addition of polyamines by transglutaminase changes the binding properties of kinesin ( Del Duca et al., 2009). Consequently, the interaction of microtubules with associated proteins regulating their function and dynamics is speculatively dependent on various types of local post-translational modifications. It is still unknown whether the lateral association of microtubules with actin filaments, which is required for the assembly and directionality imposed on transverse microtubules by the actomyosin-based cytoplasmic streaming ( Sainsbury et al., 2008), needs specific post-translational modification of tubulin. Plant kinesins with a calponin-homology domain (KCH) ( Frey et al., 2009) and structural MAPs, like MAP190 ( Igarashi et al., 2000), are candidates for this function and they could putatively be regulated by post-translational modifications of tubulin ( Fig. 1).

Speculative activity of post-translational modifications and MAPs during the assembly of microtubule bundles in interphase cells. After transcription and translation, tubulins are modified by the addition/removal of specific groups. Such modifications, which are likely to occur at the level of both monomers and polymers, hypothetically regulate the binding of motor and non-motor MAPs to microtubules. See the text for further explanation. Abbreviations: γ, gamma tubulin ?, hypothetical protein. The pair of diverging short arrows at the minus-end and plus-end of the microtubules indicates shortening and elongation. (This figure is available in colour at JXB online.)

Speculative activity of post-translational modifications and MAPs during the assembly of microtubule bundles in interphase cells. After transcription and translation, tubulins are modified by the addition/removal of specific groups. Such modifications, which are likely to occur at the level of both monomers and polymers, hypothetically regulate the binding of motor and non-motor MAPs to microtubules. See the text for further explanation. Abbreviations: γ, gamma tubulin ?, hypothetical protein. The pair of diverging short arrows at the minus-end and plus-end of the microtubules indicates shortening and elongation. (This figure is available in colour at JXB online.)

The transition from interphase to mitotic microtubules is marked by the disassembly of microtubule bundles beneath the plasma membrane and by the co-ordinated assembly of new microtubules. Current literature provides few indications on the post-translational modifications of tubulin during the transition from interphase to mitosis in plant cells. Since the detyrosinated form of tubulin interacts specifically with kinesin-1 while tyrosinated microtubules interact with plus-end proteins, the incorporation of tyrosine could enhance the binding to specific MAPs (such as +TIPs), which changes the equilibrium between cell elongation and mitosis. In this context, the work of Jovanovic et al. (2010) suggests that the post-translational modifications of tubulin could be part of the mechanism that regulates the transition from interphase to mitotic microtubules. Another ‘controller’ could be acetylated tubulin, which interacts preferentially with kinesin-1 and dynein ( Fukushima et al., 2009) and is localized at the poles of the plant mitotic spindle ( Smertenko et al., 1997). Speculatively, acetylation of tubulin could mark specific subsets of microtubules involved in the assembly of the mitotic spindle. The organization of the mitotic apparatus also requires the co-ordinated bundling of microtubules into parallel and anti-parallel orders. The MAP65 protein family performs a critical role because distinct members of MAP65 are localized to specific sites of the mitotic spindle (MAP65-1 and MAP65-3 localize to the spindle midzone during metaphase and anaphase while MAP65-4 is preferentially localized at the spindle poles) ( Van Damme et al., 2004). A progressively increasing literature suggests that a number of mitosis-specific kinesins plays a crucial role in the assembly of the mitotic spindle in vascular plants, such as AtKRP125c/kinesin-5 ( Bannigan et al., 2007) and the PAKRP1/Kinesin-12A and PAKRP1L/Kinesin-12B, which localize at the juxtaposing plus-ends of antiparallel microtubules in the phragmoplast ( Lee et al., 2007). Depicting the interplay between post-translational modifications of tubulin and the microtubule binding of both motor and structural MAPs in interphase and mitotic plant cells may be a critical priority in the future.



Comentarii:

  1. Deacon

    Between us speaking, I would go another by.

  2. Ferchar

    M-am gândit și am îndepărtat ideea

  3. Kagalkis

    Da, acest lucru este deja cunoscut de toată lumea de multă vreme. Dar autorului nu-i pasă!

  4. Archambault

    Punctul de vedere autoritar, în mod curios...



Scrie un mesaj