Informație

Liza celulelor bacteriene - ce soluție să folosiți?

Liza celulelor bacteriene - ce soluție să folosiți?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Încerc să determin cât de repede acționează detergenții asupra celulelor bacteriene (liza celulară). Aș dori să compar unii detergenți la concentrații diferite pentru activitatea bacteriolitică. Nu-mi pasă de toți metaboliții din interiorul celulelor (proteine, ADN, etc...). Multe publicații sugerează că adesea se folosesc soluții mai complicate. Primul meu gând a fost să folosesc un detergent simplu preparat în PBS sau soluție salină pentru lizarea celulelor. Am nevoie de o soluție complexă pentru a liza celulele? Poate cineva să-mi dea o sugestie? Mulțumesc anticipat.


Care este scopul exact al lizei celulelor? Soluțiile „complicate”, după cum spuneți, includ o grămadă de ingrediente. Detergentul este prezent în mare parte pentru a dizolva membranele celulare (care sunt pe bază de lipide) și pentru a permite extragerea proteinelor sau a altor substanțe biochimice din interiorul celulei (și organele la eucariote). Există și două tipuri de detergenți: ionici și anionici. Ambele tipuri de detergenți vor dizolva membranele, dar detergenții ionici tind să fie mai duri dintre cei doi, prin distrugerea puternică a structurilor proteinelor.

Dacă biochimia proteinelor este importantă, atunci următoarele cele mai importante ingrediente vor fi inhibitorii specifici ai proteazelor: enzimele care degradează proteinele. Există multe dintre acestea, dar unele exemple includ PMSF, EDTA, aprotinină etc.

Uneori este necesar să se tamponeze pH-ul soluției de liză pentru a monitoriza complexele proteice sau pentru a menține o proteină naturală sau pentru a menține ADN-ul într-un interval optim de pH. Soluțiile generale pentru tampon de liză includ Tris-EDTA (TE), PBS, etc. Această alegere se reduce dacă doriți un tampon și în ce interval de pH doriți să păstrați soluția de liză. Tampoanele comune, cum ar fi TE și PBS, sunt alcătuite pentru un interval de pH cuprins între 7-8. Există și alte soluții tampon care sunt utilizate pentru intervale de pH scăzute (pH 4-6), dar sunt de obicei mai puțin frecvente.

În cele din urmă, există modalități de a liza celulele fără a utiliza niciun fel de tampon de liză. O metodă este utilizarea sonicării, care utilizează impulsuri direcționate de sunet de înaltă frecvență pentru a liza celulele prin forfecarea lor mecanică. O altă metodă este de a îngheța-dezgheța în mod repetat celulele de la -80°C la 4°C (de obicei de 3 ori este suficient). Liza în acest mod este realizată prin formarea repetată a cristalelor de gheață care taie celulele deschise, eliberându-le conținutul.

Dacă aveți o întrebare mai specifică, unul dintre noi vă poate îndruma în continuare, dar aceasta oferă o privire de ansamblu asupra a ceea ce este implicat cu tampoanele de liză celulară.


Mă întreb cum plănuiți să măsurați liza? Veți găsi că multe metode de liză pentru E coli incorporeaza un tratament cu lizozim si EDTA. Acest lucru este astfel încât straturile de lipopolizaharidă (membrana exterioară) și peptidoglicani ale anvelopei celulare pot fi sparte înainte ca detergentul (de obicei SDS sau Triton X-100) să fie adăugat pentru a dizolva membrana interioară sau citoplasmatică. Bănuiesc că dacă ați adăuga detergent la celulele intacte, acesta nu ar fi deosebit de eficient și orice celule care au fost afectate ar rămâne ca celule denaturate care, de exemplu, ar contribui în continuare la densitatea optică.

Deoarece sunt de obicei capabile să reziste la sărurile biliare din intestinul subțire, bacteriile Gram negative pot fi destul de rezistente la detergenți. De exemplu multe Enterobacteriile poate crește în 5% SDS - vezi:

Rajagopal, S et al. (2003) Opt bacterii Gram-negative sunt de 10 000 de ori mai sensibile la detergenții cationici decât la detergenții anionici. Canad. J. Mic. 49:775-779


Bacterii

Bacteriile sunt clasificate ca Gram-pozitive sau Gram-negative pe baza structurii peretelui celular. Peptidoglicanul, care constă din repetiții glican-tetrapeptide conectate prin punți penta-glicină, oferă rezistență și rigiditate peretelui celular.

Peptidoglicanul are o compoziție similară în ambele tipuri de bacterii, cu toate acestea, în bacteriile Gram-pozitive este mult mai gros. Spre exteriorul celulei Gram-pozitive, peptidoglicanul este conectat la acizii teicoici și polizaharide [1]. Peretele bacteriilor Gram-negative este format dintr-o membrană lipidică exterioară care acoperă peptidoglicanul într-o structură cu două straturi cu spațiul periplasmatic în între. Membrana exterioară a bacteriilor Gram-negative împiedică de obicei accesul enzimelor digestive la peptidoglican. Din acest motiv, celulele Gram-negative necesită de obicei un pretratament cu un detergent sau un agent de chelare pentru a destabiliza sau îndepărta membrana exterioară înainte de digestie [1, 2].

Enzimele care scindează peptidoglicanul se numesc murein hidrolaze și sunt clasificate în 3 grupe: glicozidaze (clivează lanțurile polizaharide), endopeptidaze (clivează lanțurile polipeptidice) sau amidaze (clivează între polizaharide și peptide) [1, 2].

Lizozima

Dintre muramidaze, lizozimul este cel mai utilizat, deoarece are activitate împotriva majorității bacteriilor Gram-negative și a multor bacterii Gram-pozitive. Lizozimul albușului de ou de găină este cel mai frecvent utilizat lizozim datorită activităților sale, disponibilității și costului. Hidroliza extinsă a peptidoglicanului de către lizozim poate fi suficientă pentru liza celulară fără măsuri suplimentare la unele bacterii. În altele, poate fi necesară o procedură suplimentară, cum ar fi un șoc hipoton și o sensibilizare prealabilă, pentru o liză completă. Tratamentul cu lizozim al celulelor viabile ale unor bacterii se poate dovedi mai dificil.

Lizozima este utilizată în mod obișnuit pentru liza E coli, Streptomiceteși alte bacterii. În plus, există numeroase alte utilizări dincolo de bacterioliză și formare de protoplaste, cum ar fi controlul antimicrobian, prepararea probelor, farmacologia, precum și un potențiator de aromă în unele alimente și băuturi.

Alte enzime bacteriolitice:

Alte enzime sunt disponibile pentru bacteriile care sunt rezistente la lizozim (cum ar fi multe bacterii Gram-pozitive) sau în cazurile în care se dorește o alternativă la lizozimă. Exemplele includ:

  • Lisostafina este o endopeptidază cu specificitate pentru punțile de pentaglicină ale peptidoglicanului. A fost utilizat cu tulpini de stafilococi și ca potențial antimicrobian [4].
  • Acromopeptidaza este o endopeptidază cu spectru larg cu specificitate pentru legăturile Lys/- care păstrează activitatea în SDS 0,1% și uree 5M. A fost utilizat pentru prepararea protoplastelor Actinomicete și pentru liza stafilococului și micrococului [5].
  • Labiaze are activități β-N-acetil-D-glucozamidazei și muramidazei și s-a demonstrat că are activitate bacteriolitică cu spectru larg asupra bacteriilor gram pozitive [6]. A fost folosit pentru extracția ADN-ului și alte utilizări.
  • Mutanolizina a fost caracterizat mai întâi ca un compus din 3 enzime din S. globisporus cu β-1,4-N,6-O-diacetilmuramidaza (M1), β-1,4-N-acetilmuramidaza (M2) și N-acetilmuramil-alanin amidaza Activități. Enzima M1 izolată poate fi denumită și Mutanolizină [7]. A fost folosit pentru liza Listeria, Lactococcus, Lactobacillus, și streptococși a fost folosit pentru formarea protoplastelor și izolarea ADN-ului.

Și ceilalți detergenți?

Fiecare proteină este diferită și interacționează cu detergenții în moduri diferite. Dacă nu credeți că vă solubilizați toate proteinele sau dacă căutați o interacțiune specifică proteină-proteină, atunci vă recomandăm să vă jucați cu diferiți detergenți.

CHAPS (3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propansulfonat un detergent zwitterionic) este mai dur decât detergenții neionici, dar mai blând decât detergenții ionici. Prin urmare, poate menține unele interacțiuni proteină-proteină, dar poate fi mai bună la solubilizare.

Digitonina este un detergent blând, noninonic, similar cu NP-40 și Triton X-100. Este foarte eficient la solubilizarea proteinelor membranare. Dacă sunteți în căutarea unei interacțiuni proteină-proteină folosind co-IP, atunci s-ar putea să doriți să încercați digitonina. Când eram student absolvent, am lucrat cu două proteine ​​care ar fi co-IP doar în prezența digitoninei.

Pentru a utiliza acești detergenți începeți la o concentrație de 1%.


Tampon de liză pentru acizi nucleici

Lizarea celulelor pentru extracția acizilor nucleici este, într-un fel, mult mai ușoară decât extracția proteinelor. Acizii nucleici sunt mult mai rezistenți la denaturare decât majoritatea proteinelor, așa că poate fi utilizat un tampon de liză denaturant. Tipul de tampon de liză depinde de tipul de acid nucleic, cum ar fi ADN-ul genomic, mitocondrial sau plasmidic, și totalul sau o scădere de ARN, precum și sursa celulei.

Obținerea ARN intact este mai exigentă decât izolarea ADN-ului, datorită prezenței RNazelor. Tamponul de liză celulară pentru extracția ARN este foarte denaturant și este de obicei compus din fenol și izotiocianat de guanidină. Inhibitorii RNazei sunt de obicei prezenți în tamponul de liză, deoarece RNazele pot fi foarte rezistente la denaturare și rămân active.

Pentru extragerea ADN-ului tamponul de liză va conține în mod obișnuit SDS. În majoritatea truselor pentru extracția plasmidelor, tamponul va conține hidroxid de sodiu, precum și SDS, pentru liza alcalină. Adăugarea de acetat de potasiu la acest tampon de liză permite renaturarea ADN-ului plasmid, dar nu a ADN-ului bacterian, care precipită.

Deoarece liza celulară și extracția acizilor nucleici nu sunt supuse la atât de multe variabile ca în cazul proteinelor, cea mai mare parte a extracției de acid nucleic se poate face cu unul dintre câteva truse. Trusele conțin în mod obișnuit un tampon de liză celulară și o matrice de legare a acidului nucleic corespunzătoare.

Bio-Rad oferă o gamă de truse pentru prepararea și purificarea probelor de acid nucleic, toate incluzând un tampon de liză celulară optimizat pentru fiecare kit: izolarea totală a ARN-ului din diferite tipuri de celule, extracția de plasmide și ADN genomic, extracția cu gel de agaroză și curățarea sondelor radiomarcate. , translații nick, plasmide și amestecuri de reacție PCR.


Liza celulară - ce soluție să folosiți? (26.04.2002)

Sunt un chimist care fac un pic de pregătire și analiză celulară. Încerc să determin ce soluție de liză celulară să folosesc. Primul meu gând a fost să folosesc un detergent simplu sau o soluție hipotonică pentru a liza celulele. cu toate acestea, o căutare rapidă a literaturii sugerează că de multe ori se folosesc soluții mai complicate. Poate cineva să-mi dea o scurtă explicație pentru următoarele ingrediente pentru soluția de liză celulară? Trebuie să decid care dintre acestea sunt necesare pentru scopurile mele. Mulțumesc anticipat.

* Unele soluții conțin 150 mM ser fiziologic. De ce să vă faceți griji cu privire la osmolaritate dacă intenționați să ucideți celulele?

* Unele soluții sunt tamponate. De ce să vă faceți griji pentru pH (cu fosfat sau citrat sau HEPES sau orice altceva) dacă intenționați să ucideți celulele?

* Unele soluții de liză conțin EDTA. De ce să-l folosești/ce chelați?

* Când este adecvat/necesar pentru a inhiba proteazele? Cum se decide între diferitele opțiuni (de exemplu, DFP vs PMSF vs AEBSF etc.)?

* Cum se selectează detergenții corespunzători? Uneori se vede amestecuri foarte simple (de exemplu 0,5% Triton X) dar uneori relativ complicate (SDS + NP-40 + deoxicolat de Na). pe care ar trebui sa folosim?

Scuze pentru postarea lungă. Pentru un răspuns, ar trebui să fie o propoziție pentru fiecare subiect - veți primi recunoştinţa eternă a unui chimist confuz.

(PS. Dacă sunteți interesat, în prezent analizez celulele neuronale CATH.a pentru conținutul de catecolamine. dar indiferent de soluția de liză pe care o folosesc acum, sunt interesat de subiectele de mai sus pentru informații generale pentru viitor.)

Tampoanele de liză celulară depind de ceea ce doriți să faceți cu lizatul dvs.:

EDTA este de obicei pentru a chela ionii de Ca implicați în aderența intercelulară și intracelulară, astfel încât să obțineți o descompunere mai bună a celulelor. Poate, de asemenea, chela ionii care sunt cofactori ai anumitor enzime.

Inhibitorii de protează sunt utilizați pentru a preveni degradarea proteinei dacă este o proteină care vă interesează. Diferiții inhibitori utilizați au caracteristici diferite pentru inhibarea anumitor familii de proteaze, de ex. PMSF pentru serin proteaze.

Este necesar un control adecvat al pH-ului pentru a menține activitatea proteinelor pentru testele enzimatice etc., astfel încât acestea să nu se desfășoare și să devină inactive sau, în cazul occidentalilor, să-și piardă antigenitatea. Același lucru pentru menținerea osmolarității.

Din nou, cu alegerea detergentului, puteți distruge selectiv diferite membrane pentru a elibera conținutul.


Liza gazdei de către bacteriofag

Perspectivă

Liza a fost odată considerată o consecință destul de trivială și inevitabilă a infecției cu bacteriofagi, o consecință indirectă a redirecționării extinse a funcțiilor biosintetice și de întreținere a gazdei către scopurile virusului. Cu toate acestea, acum este clar că liza este un proces atent orchestrat și reglat programat de fag. În plus, baza moleculară a evenimentului litic și reglarea acestuia sunt extrem de interesante, implicând aspecte fundamentale ale comportamentului proteinelor membranare și, de asemenea, ale funcției căii de biosinteză a peretelui celular bacterian. Disponibilitatea facilității genetice tradiționale puternice a fagilor, cuplată cu abordări genomice, proteomice și structurale moderne, promite un progres rapid în înțelegerea noastră a acestui proces biologic fundamental.


Americi

Site-ul va fi afișat în limba engleză.

Folosim aceste cookie-uri pentru a ne asigura că site-ul nostru funcționează în siguranță și în mod corespunzător, acestea sunt necesare pentru ca serviciile noastre să funcționeze și nu pot fi dezactivate în sistemele noastre. De obicei, acestea sunt setate doar ca răspuns la acțiunile efectuate de dvs. care reprezintă o solicitare de servicii, cum ar fi autentificarea, utilizarea unui coș de cumpărături sau completarea formularelor. Puteți seta browserul să vă blocheze sau să vă avertizeze despre aceste cookie-uri, dar unele părți ale serviciilor noastre nu vor funcționa fără ele. La fel ca și celelalte cookie-uri pe care le folosim, cookie-urile strict necesare pot fi fie cookie-uri primare, fie cookie-uri terțe.

Folosim aceste cookie-uri pentru a vă aminti setările și preferințele. De exemplu, este posibil să folosim aceste module cookie pentru a vă aminti preferințele de limbă.
Permite module cookie de preferință

Folosim aceste cookie-uri pentru a colecta informații despre modul în care interacționați cu serviciile noastre și pentru a ne ajuta să le măsurăm și să le îmbunătățim. De exemplu, putem folosi aceste cookie-uri pentru a determina dacă ați interacționat cu o anumită pagină.
Permite cookie-uri de performanță/statistică

Noi și partenerii noștri de publicitate folosim aceste module cookie pentru a furniza reclame, pentru a le face mai relevante și mai semnificative pentru dvs. și pentru a urmări eficiența campaniilor noastre de publicitate, atât pe serviciile noastre, cât și pe alte site-uri web și rețele sociale.
Permite cookie-uri de marketing


Liza E coli de către lizozimă - (17.07.2010)

Încerc să lizez E coli cu lizozim. Am căutat mic și mare, în majoritatea protocoalelor se spune că folosiți 1 mg/ml pentru a lize bacteriile. Dar când m-am întors la literatura foarte veche, majoritatea foloseau 0,02 mg/ml de lizozimă pentru a liza bacteriile.
Am încercat cu o concentrație diferită și am găsit rezultate interesante:
1. E coli netratată cu EDTA nu a fost niciodată lizată
2. E coli tratată cu EDTA bine lizat de la 0,02 mg/ml până la 1 mg/ml (soluția devine translucidă)
3. E coli tratată cu concentrație mare de lizozimă >2mg/ml nelizat. soluția a devenit de fapt foarte foarte tulbure, foarte ciudată
4. Indiferent cât de mult lizozim, soluția nu devine niciodată complet clară. De exemplu, când se transferă o cantitate mică din proba 2 de mai sus după liză într-o soluție proaspătă de celule E coli, liza are loc, dar nu este completă (judecăm după transparență). Asta inseamna:
a) lizozimele sunt active, dar cumva nu lizează toate celulele?
soluția nu a fost niciodată clară, deoarece stratul de peptidoglican a fost hidrolizat doar parțial de lizozimă, alte molecule mari legate covalent, dar rupte de lizozimă?
c) LPS-ul prea mare, astfel încât să curgă în jurul soluției și să nu contribuie la limpezirea 100%.

În comparație cu sonicare, primesc întotdeauna un lizat foarte foarte clar. Tratamentul cu lisozme îmi poate oferi cel mai bine lizat

50% limpede comparativ cu tratamentul cu sonicare.

Are cineva un tratament foarte bun cu lizozim pentru a liza E coli 100%

Bună ziua, numele meu este Mary Ann Santos și sunt un om de știință al produselor InVitria. Aș dori să vă împărtășesc beneficiile Lysobac, lizozima umană recombinată, fără animale, care este utilizată în lizarea eficientă a celulelor E.coli. Mai jos este o scurtă descriere a acestui produs:

Lysobac® este o descoperire pentru liza celulelor bacteriene și poate fi utilizat în aplicații de diagnosticare, bioprocesare și cercetare în știința vieții. Lysobac este lizozimă umană recombinantă produsă într-un sistem de producție fără animale. Producția fără animale elimină riscul de siguranță și performanța inconsecventă de la lot la lot a lizozimei de albuș de ou de găină. Lysobac are o bioactivitate semnificativ mai mare decât lizozimul albușului de ou de găină. Un gram de Lysobac înlocuiește 4 grame de lizozim albușului de ou de găină. Lysobac oferă, de asemenea, liză celulară blândă, spre deosebire de liza mecanică, care poate provoca forfecarea proteinelor și poate reduce producția de proteine ​​cu până la 20%. Când este adăugat la lizarea mecanică, poate asigura o liză mai completă, crescând randamentul proteic.

Îmbunătățește eficiența fermentației bacteriene
Activitate mai mare de liză bacteriană per mg
1 gram de Lysobac oferă mai multă activitate de liză decât 4 grame de HEWL
Fără animale și consecvent, ceea ce duce la îmbunătățirea eficienței de reglementare pentru fabricarea medicamentelor
Randament de proteine ​​recombinate îmbunătățit în comparație cu liza mecanică
Reduce costul mărfurilor

Lucrăm cu grupuri care folosesc Lysobac singur pentru a-și liza E.coli. În aceste cazuri, ei și-au redus concentrațiile obișnuite de lizozim de găină așa cum este descris mai sus și au dus la o liză completă.

De asemenea, lucrăm cu grupuri care combină Lysobac cu sonicare. Unul dintre grupuri a spus că utilizează în mod regulat lizozimul de găină în combinație fie cu înghețare-dezghețare, fie cu sonicare și că au reușit să își reducă concentrația de lizozim de 4 ori și au dus la o liză mai completă. Combinarea a 0,1 mg/ml Lysobac cu sonicare a dat cele mai bune rezultate.

În cele din urmă, tabelul atașat arată efectul sinergic al Lysobac atunci când este utilizat în combinație cu EDTA (concentrațiile sunt în micrograme/ml)

Vă rugăm să nu ezitați să mă contactați la [email protected] dacă doriți să obțineți o mostră de Lysobac pentru evaluare sau dacă aveți nevoie de informații suplimentare.

Am vrut doar să vă direcționez către pagina web de mai jos. Veți găsi, de asemenea, un link către un articol de jurnal care ar putea fi de interes pentru dvs. în această pagină (partea dreaptă).


Priveste filmarea: Cell Lysis (Iunie 2022).


Comentarii:

  1. Zujinn

    Pur și simplu strălucirea

  2. Zuluzshura

    Gând foarte util

  3. Marybell

    Dupa parerea mea te inseli. Sunt sigur. Trimite un e-mail la PM, vom discuta.

  4. Heh

    mesajul foarte amuzant

  5. Ransey

    În el este ceva. Now all became clear to me, Many thanks for the information.

  6. Senapus

    Cred că vei lua decizia corectă.

  7. Lairgnen

    Cred că veți găsi soluția potrivită. Nu vă faceți griji.



Scrie un mesaj