Informație

Ce s-ar întâmpla dacă plasăm ADN denaturat în mediu acid?

Ce s-ar întâmpla dacă plasăm ADN denaturat în mediu acid?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ADN-ul poate fi denaturat la temperaturi ridicate sau în soluții alcaline. Dar ADN-ul poate fi recoapt la temperaturi scăzute. Vreau să întreb, ar putea fi recoaptă în mediu acid?


Bună ziua și bun venit Nandini Yadav,

Merită menționat ADN-ul este un acid (Acidul dezoxiribonucleic), iar pH-ul intracelular este cel mai frecvent între 7,0 și 7,4.

Exemplu de reactiv alcalin

„Hidroxidul de sodiu (NaOH) este un reactiv utilizat în mod obișnuit pentru a denatura ADN-ul prin creșterea pH-ului. La un pH alcalin, grupele OH sunt predominante. Ele îndepărtează protonii contributori de legături de hidrogen din guanină și timină, rupând astfel hidrogenul. legături dintre cele două oligonucleotide”.

Sursă

Puteți vedea în imaginea de mai jos legăturile de hidrogen dintre nucleotidele Adenina (A), Citozina (C), Guanina (G) și Timina (T).

Exemplu de reactiv acid

S-a constatat că o scădere a pH-ului deteriorează stabilitatea termică a ADN-ului

Sursă

La un pH acid, H+ din mediul înconjurător al ADN-ului este ridicat și, prin urmare, legăturile de hidrogen dintre Adenină (A) și Timină (T), Citozină (C) - Guanină (G) se vor „rupe”.

Mai multe informații aici.


Manual de imunohistochimie și hibridizare in situ a carcinoamelor umane, volumul 4

A. Denaturarea

Sunt descrise două tipuri de denaturare, în funcție de tipul probei.

Denaturare I (co-denaturare pentru secțiuni de țesut)

Preîncălziți 30 μl de cocktail de sondă (vezi pregătirea sondei) la 37 ° C timp de 5 minute într-o microcentrifugă. Acest amestec de sonde conține 10 ng/μ de ADN alfoid marcat cu biotină.

Nota 5: În loc de biotină, pot fi utilizate alte sonde marcate.

Se pipetează 30 μl de soluție de sondă și se plasează pe o zonă specifică pe lama pretratată din protocolul anterior (Protocolul 8).

Acoperiți zona de hibridizare cu o lamă de sticlă și sigilați cu atenție toate cele patru lame cu ciment de cauciuc.

Denaturarea sonda și proba simultan prin introducerea într-un cuptor (co-denaturare) la 92°C timp de 15 min.

Nota 6: Temperatura de denaturare și durata denaturarii variază de la probă la probă. În general, probele de țesut FFPE necesită temperatură mai mare și mai mult timp pentru denaturare, în timp ce secțiunile congelate, frotiurile și preparatele la atingere necesită temperatură mai mică și timp mai mic. În diferite laboratoare, temperatura de denaturare a variat de la 75°−95°C, în timp ce durata duratei a variat de la 5–20 min. Aceasta conduce la efectuarea unui experiment de optimizare pentru a determina temperatura ideală și durata denaturarii pentru specimenul în cauză.

Se procedează la hibridizare.

Denaturare II (denaturare separată pentru cromozomi în metafază, celule de cultură de țesuturi și celule exfoliate)

Deshidratați lamelele care poartă celule de cultură de țesut, cromozomi de metafază (Protocolul 4) și celulele exfoliate printr-o serie de etanol 60%, 70% și 95% rece ca gheață timp de 2 minute fiecare.

Denaturați lamele în tampon de denaturare care conține 70% formamidă. Tamponul de denaturare preparat (vezi prepararea reactivului) trebuie transferat într-un borcan Coplin și preîncălzit la 70°C într-o baie de apă. Odată ce temperatura atinge 70°-72°C, incubați lama în tampon de denaturare timp de 2-3 minute. (Timpul optim de denaturare variază în fereastra îngustă de 2-3 minute).

Deshidratați lama denaturată în etanol 80%, 90% și 100% menținut la 4°C timp de 2 minute la fiecare pas și lăsați lama să se usuce la aer.

Adăugați aproximativ 1,5 μl de sondă satelit alfa marcată cu biotină (sau digoxigenină) în 40 μl de amestec de sondă (amestec de hibridizare) într-un tub de microcentrifugă. (Vezi prepararea reactivului.)

Denaturați cocktail-ul sondei la 70°-74°C timp de 5–7 minute într-o baie de apă. Răciți rapid într-o baie de gheață. (Unele sonde necesită o etapă de precoacere. În astfel de cazuri, după denaturarea sondei, transferați tubul de centrifugă în cuptor la 37°C sau în baie de apă timp de 60 de minute pentru recoacere.)

Aplicați cocktail-ul cu sondă pe lamă și acoperiți cu o lametă. Sigilați lamela cu ciment de cauciuc și procedați la hibridizare.


Enzime și evoluție

Iată ce știm: enzimele din celule pot metaboliza doar un izomer, dar nu și pe celălalt. Enzimele catalizează reacțiile pentru a descompune și a construi molecule legându-se de ele în moduri foarte specifice. O enzimă care descompune D-glucoza nu va putea descompune L-glucoza. Dacă am dori să folosim și să construim ambii izomeri, ar trebui să avem două seturi de enzime. Acest lucru ar necesita mai mult ADN, mai multă hrană și mult mai multă energie. Desigur, celulele vor să fie cât mai eficiente posibil, așa că a avea un set suplimentar de enzime ar fi dificil.

Dar dacă am avea acele enzime suplimentare, nu am putea obține și de două ori mai multă energie din mediu? Am putea folosi ceilalți 50% din izomeri dacă am avea enzimele care să le descompună în loc să-i risipim. Răspunsul are legătură cu evoluția și piramida alimentară.

Când viața timpurie evolua, un organism avea enzime care reacționează selectiv cu un izomer. Organismele care au mâncat această primă formă de viață ar trebui să aibă aceleași enzime selective pentru a le digera. Dacă toate alimentele tale conțin numai zaharuri D, și tu la fel! Deci, dacă partea de jos a lanțului trofic folosește numai L-aminoacizi, homochiralitatea se va răspândi la fiecare organism din lanțul trofic! Deoarece viața a trebuit să dezvolte mai întâi un set de enzime, am ajuns să fim blocați cu acea selectivitate. Presiunea selectivă din evoluție a forțat fiecare organism nou să folosească aceleași tipuri de aminoacizi și zahăr ca și cele dinaintea sa.

Deci, odată ce un izomer este ales, fiecare formă de viață îl va folosi. Dar de ce L-aminoacizi în loc de D-aminoacizi și de ce D-zaharuri în loc de L-zaharuri? Acesta este adevăratul mister. Ceva la începutul vieții trebuia să aleagă unul peste altul. Este posibil ca, în primele etape ale vieții, unele organisme să dezvolte un set de enzime, în timp ce diferite organisme să fi avut pe celălalt. Ar fi putut fi un eveniment aleatoriu care a șters o linie de enzime, dar oamenii de știință nu sunt mulțumiți de acest răspuns. Trebuie să existe un motiv pentru care L-aminoacizii și zaharurile D sunt mai bune pentru supraviețuire decât omologii lor.


Întrebări prelaboratoare

Discutați între voi următoarele. Fiți gata să vă împărtășiți gândurile cu restul clasei.

  1. Ampicilina este un derivat al antibioticului penicilina. Acesta perturbă formarea peretelui celular în celulele bacteriene, ceea ce ucide celulele. Cu toate acestea, plasmida noastră recombinată conține o genă care oferă rezistență la antibiotice prin producerea unei proteine ​​care descompune ampicilina. De ce includem ampicilina în mediul de testare?
  2. Ce se va întâmpla dacă celulele transformate nu cresc în prezența inductorului chimic?
  3. În experiment, veți adăuga grupurile de celule de control și experimentale pe diferite combinații de medii. Ce preziceți pentru fiecare condiție? Completați tabelul 1 indicând dacă prezici creșterea sau nu, iar dacă crește, va exista o creștere minimă sau o mulțime de creștere.

Citiți Procedurile de mai jos și subliniați pașii, folosind cuvinte și o diagramă de flux în caietul dvs. de laborator.


Structura proteinelor

După cum sa discutat mai devreme, forma unei proteine ​​este critică pentru funcția sa. De exemplu, o enzimă se poate lega la un substrat specific la un loc cunoscut sub numele de situs activ. Dacă acest situs activ este modificat din cauza modificărilor locale sau a modificărilor structurii totale a proteinei, enzima poate fi incapabilă să se lege de substrat. Pentru a înțelege modul în care proteina își capătă forma sau conformația finală, trebuie să înțelegem cele patru niveluri ale structurii proteinei: primar, secundar, terțiar și cuaternar.

Structura primară

Secvența unică de aminoacizi dintr-un lanț polipeptidic este structura sa primară. De exemplu, hormonul pancreatic insulina are două lanțuri polipeptidice, A și B, și sunt legate între ele prin legături disulfurice. Aminoacidul N terminal al lanțului A este glicina, în timp ce aminoacidul C terminal este asparagina (Figura (PageIndex<4>)). Secvențele de aminoacizi din lanțurile A și B sunt unice pentru insulină.

Figura (PageIndex<4>): Insulina serică bovină este un hormon proteic format din două lanțuri peptidice, A (lungime de 21 de aminoacizi) și B (lungime de 30 de aminoacizi). În fiecare lanț, structura primară este indicată prin abrevieri din trei litere care reprezintă denumirile aminoacizilor în ordinea în care sunt prezenți. Aminoacidul cisteină (cys) are o grupare sulfhidril (SH) ca lanț lateral. Două grupări sulfhidril pot reacționa în prezența oxigenului pentru a forma o legătură disulfurică (S-S). Două legături disulfurice conectează lanțurile A și B împreună, iar o a treia ajută lanțul A să se plieze în forma corectă. Rețineți că toate legăturile disulfurice au aceeași lungime, dar sunt desenate cu dimensiuni diferite pentru claritate.

Secvența unică pentru fiecare proteină este determinată în cele din urmă de gena care codifică proteina. O modificare a secvenței de nucleotide a regiunii de codificare a genei poate duce la adăugarea unui aminoacid diferit la lanțul polipeptidic în creștere, provocând o modificare a structurii și funcției proteinei. În anemia falciformă, hemoglobina &beta lanțul (din care o mică parte este prezentată în figura (PageIndex<5>)) are o singură substituție de aminoacizi, provocând o modificare a structurii și funcției proteinei. Mai exact, aminoacidul acid glutamic este substituit cu valină în &beta lanţ. Ceea ce este cel mai remarcabil de luat în considerare este că o moleculă de hemoglobină este alcătuită din două lanțuri alfa și două lanțuri beta care constau fiecare din aproximativ 150 de aminoacizi. Prin urmare, molecula are aproximativ 600 de aminoacizi. Diferența structurală dintre o moleculă normală de hemoglobină și o moleculă de celule falciforme, care scade dramatic speranța de viață, este un singur aminoacid din cei 600. Ceea ce este și mai remarcabil este că acești 600 de aminoacizi sunt codificați de trei nucleotide fiecare, iar mutația este cauzată de o schimbare de bază unică (mutație punctuală), 1 la 1800 de baze.

Figura (PageIndex<5>): Lanțul beta al hemoglobinei are o lungime de 147 de reziduuri, dar o singură substituție de aminoacid duce la anemie falciforme. În hemoglobina normală, aminoacidul din poziția șapte este glutamatul. În hemoglobina cu celule falciforme, acest glutamat este înlocuit cu o valină.

Din cauza acestei modificări a unui aminoacid din lanț, moleculele de hemoglobină formează fibre lungi care distorsionează globulele roșii biconcave, sau în formă de disc, și iau o formă de semilună sau „semilunare”, care înfundă arterele (Figura (PageIndex<6> )). Acest lucru poate duce la nenumărate probleme grave de sănătate, cum ar fi dificultăți de aer, amețeli, dureri de cap și dureri abdominale pentru cei afectați de această boală.

Figura (PageIndex<6>): în acest frotiu de sânge, vizualizat la o mărire de 535x utilizând microscopia cu câmp luminos, celulele seceră au formă de semilună, în timp ce celulele normale sunt în formă de disc. (credit: modificarea lucrării lui Ed Uthman, date de la bara de scară de la Matt Russell)

Structura secundară

Plierea locală a polipeptidei în unele regiuni dă naștere structurii secundare a proteinei. Cele mai frecvente sunt cele &alfa-helix și &beta-structuri de foi plisate (Figura (PageIndex<7>)). Ambele structuri sunt &alfa-structura helix&mdashhelix-ul menținut în formă prin legături de hidrogen. Legăturile de hidrogen se formează între atomul de oxigen din grupa carbonil dintr-un aminoacid și un alt aminoacid care este cu patru aminoacizi mai departe de-a lungul lanțului.

Figura (PageIndex<7>): &alfa-helix și &beta-foaia plisată sunt structuri secundare ale proteinelor care se formează datorită legăturilor de hidrogen dintre grupările carbonil și amino din scheletul peptidic. Anumiți aminoacizi au tendința de a forma un &alfa-helix, în timp ce alții au tendința de a forma o foaie pliată &beta.

Fiecare turn elicoidal dintr-o spirală alfa are 3,6 reziduuri de aminoacizi. Grupările R (grupurile variante) ale polipeptidei ies în afară din &alfa-lanț elicoidal. În &beta-foaia plisata, "pliurile" sunt formate prin legaturi de hidrogen intre atomi de pe coloana vertebrala a lantului polipeptidic. Grupările R sunt atașate la atomi de carbon și se extind deasupra și dedesubtul pliurilor pliului. Segmentele plisate se aliniază paralel sau antiparalel între ele și se formează legături de hidrogen între atomul de azot parțial pozitiv din grupa amino și atomul de oxigen parțial negativ din grupa carbonil a scheletului peptidic. The &alfa-helix și &beta-structurile de foițe plisate se găsesc în majoritatea proteinelor globulare și fibroase și joacă un rol structural important.

Structura terțiară

Structura tridimensională unică a unei polipeptide este structura sa terțiară (Figura (PageIndex<8>)). Această structură se datorează în parte interacțiunilor chimice care lucrează pe lanțul polipeptidic. În primul rând, interacțiunile dintre grupurile R creează structura terțiară tridimensională complexă a unei proteine. Natura grupărilor R găsite în aminoacizii implicați poate contracara formarea legăturilor de hidrogen descrise pentru structurile secundare standard. De exemplu, grupurile R cu sarcini similare sunt respinse unele de altele, iar cele cu sarcini diferite sunt atrase unele de altele (legături ionice). Când are loc plierea proteinei, grupările R hidrofobe ale aminoacizilor nepolari se află în interiorul proteinei, în timp ce grupările R hidrofile se află în exterior. Primele tipuri de interacțiuni sunt cunoscute și ca interacțiuni hidrofobe. Interacțiunea dintre lanțurile laterale ale cisteinei formează legături disulfură în prezența oxigenului, singura legătură covalentă care se formează în timpul plierii proteinelor.

Figura (PageIndex<8>): Structura terțiară a proteinelor este determinată de o varietate de interacțiuni chimice. Acestea includ interacțiuni hidrofobe, legături ionice, legături de hidrogen și legături disulfură.

Toate aceste interacțiuni, slabe și puternice, determină forma tridimensională finală a proteinei. Când o proteină își pierde forma tridimensională, este posibil să nu mai fie funcțională.

Structura cuaternară

În natură, unele proteine ​​sunt formate din mai multe polipeptide, cunoscute și sub denumirea de subunități, iar interacțiunea acestor subunități formează structura cuaternară. Interacțiunile slabe dintre subunități ajută la stabilizarea structurii generale. De exemplu, insulina (o proteină globulară) are o combinație de legături de hidrogen și legături disulfurice care fac ca aceasta să fie în mare parte aglomerată într-o formă de bilă. Insulina începe ca o singură polipeptidă și pierde unele secvențe interne în prezența modificării post-translaționale după formarea legăturilor disulfurice care țin împreună lanțurile rămase. Mătasea (o proteină fibroasă), totuși, are un &beta-structura de foita plisata care este rezultatul legaturii de hidrogen intre diferite catene.

Cele patru niveluri ale structurii proteinei (primar, secundar, terțiar și cuaternar) sunt ilustrate în figura (PageIndex<9>).

Figura (PageIndex<9>): Cele patru niveluri ale structurii proteinei pot fi observate în aceste ilustrații. (credit: modificarea lucrării de către Institutul Național de Cercetare a Genomului Uman)


Cromatografia de afinitate cu metale imobilizate (IMAC)

Suporturile, cum ar fi agaroza cu mărgele sau particulele magnetice, pot fi derivatizate cu grupări chelatoare pentru a imobiliza ionii metalici doriti, care apoi funcționează ca liganzi pentru legarea și purificarea biomoleculelor de interes. Această bază pentru purificarea prin afinitate este cunoscută sub numele de cromatografie de afinitate cu metal imobilizat (IMAC). IMAC este o metodă utilizată pe scară largă pentru purificarea rapidă a proteinelor marcate cu afinitatea polihistidinei, rezultând îmbogățiri de 100 de ori într-o singură etapă de purificare.

Chelatorii cei mai frecvent utilizați ca liganzi pentru IMAC sunt acidul nitriloriacetic (NTA) și acidul iminodiacetic (IDA). Odată ce rășina IDA-agaroză sau NTA-agaroză este preparată, aceasta poate fi „încărcată” cu metalul divalent dorit (de exemplu, Ni, Co, Cu și Fe). Folosind nichelul ca exemplu de metal, suportul de afinitate rezultat este de obicei numit rășină Ni-chelat, Ni-IDA sau Ni-NTA. Metalul special și chimia de chelare a unui suport determină proprietățile sale de legare și potrivirea pentru aplicații specifice ale IMAC.

Purificarea prin afinitate a proteinelor de fuziune marcate cu His este cea mai comună aplicație pentru suporturile de metal-chelat în cercetarea biologiei proteinelor. Metalele de nichel sau cobalt imobilizate prin chimia de chelare NTA sunt sistemele de alegere pentru această aplicație (vezi secțiunea următoare). În plus, diferite varietăți de rășină de agaroză oferă suporturi care sunt ideale pentru purificarea proteinelor marcate cu His la scară foarte mică (plăci de filtrare cu 96 de godeuri) sau la scară mare (serie de cartușe de cromatografie într-un sistem FPLC). Când sunt ambalate în coloane sau cartușe adecvate, rășinile precum Ni-NTA Superflow Agarose asigură purificarea a 1 până la 80 de miligrame de proteină marcată His per mililitru de perle de agaroză. În comparație cu cobaltul și alți liganzi utilizați pentru IMAC, nichelul oferă o capacitate mai mare de purificare a proteinelor marcate cu His. Thermo Fisher Scientific oferă HisPur Ni-NTA Superflow Agarose care prezintă o capacitate de legare dinamică ridicată într-o gamă de debite, ceea ce o face o alegere excelentă pentru purificări la scară mai mare.

Purificare cu randament ridicat, puritate ridicată, la scară medie a proteinei 6xHisTagged. Mai mult de 4 grame de 6xHis-GFP supra-exprimat au fost purificate în 3 ore utilizând coloane de 200 mL care conţin HisPur Ni-NTA Superflow Agarose. Un litru de lizat a fost încărcat la un debit de 20 mL/min, apoi a fost spălat până la momentul iniţial cu tampon de spălare conţinând 30 mM imidazol. Proteina legată a fost eluată cu tampon conţinând 300 mM imidazol. Fracţiile care conţin 6xHis-GFP purificat au fost reunite şi cuantificate utilizând Testul de proteine ​​Pierce 660 nm (Nr. Cat. 22662). Fracțiile de încărcare, curgere, spălare și eluare au fost separate prin SDS-PAGE, colorate cu Imperial Protein Stain (Nr. Cat. 24615) și evaluate folosind software-ul myImageAnalysis (Nr. Cat. 62237) pentru a determina puritatea.

Etichetele Poly-His se leagă cel mai bine la rășinile IMAC în condiții tampon aproape neutre (pH fiziologic și putere ionică). Un tampon tipic de legare/spălare constă din soluție salină tampon Tris (TBS) pH 7,2, care conține 10-25 mM imidazol. Concentrația scăzută de imidazol ajută la prevenirea legării nespecifice a proteinelor endogene care au clustere de histidină. (De fapt, anticorpii au astfel de grupuri bogate în histidină și pot fi purificați folosind o variație a chimiei IMAC.)

Concentrațiile mari de sare și anumiți denaturanți (de exemplu, haotropi precum ureea 8 M) sunt compatibile, astfel încât purificarea din probe în diferite soluții tampon de pornire este posibilă. Din acest motiv, cel mai bine este să folosiți eticheta His pentru proiectarea și exprimarea proteinelor recombinante care ar putea avea nevoie să fie purificate sub formă denaturată din corpurile de incluziune. (Contrastați cu eticheta GST, care este o enzimă care trebuie să rămână funcțională pentru a permite purificarea.) Este important de reținut că EDTA și agenții reducători precum DTT și TCEP pot afecta negativ performanța suporturilor Ni-IMAC obișnuite prin stripare. de pe metal. Dar este disponibilă o chimie Ni-IMAC special concepută, care poate tolera prezența agenților reducători și a chelatorilor, cum ar fi EDTA, la concentrații mai mari, fără a pierde performanța. Chimia Ni-IMAC compatibilă cu EDTA este disponibilă în formate de granule magnetice (Nr. Cat. A50588) și rășină (Nr. Cat. A50585). Ele sunt potrivite în mod special pentru purificarea proteinelor marcate cu His exprimate care sunt secretate în mediile de cultură celulară sau pentru purificarea proteinelor marcate cu His intracelulare care au nevoie de prezența EDTA pentru a menține stabilitatea și funcționarea.

Eluția și recuperarea proteinei marcate cu His capturate dintr-o coloană IMAC se realizează prin utilizarea unei concentrații ridicate de imidazol (cel puțin 200 mM), pH scăzut (de exemplu, glicină-HCl 0,1 M, pH 2,5) sau un exces de chelatori puternici ( de exemplu, EDTA). Imidazolul este cel mai frecvent agent de eluare.

Fiți conștienți de faptul că se știe că imunoglobulinele au mai multe histidine în regiunea lor Fc și se pot lega de suporturile IMAC. Pot rezulta un fundal ridicat și fals pozitive dacă condițiile de legare nu sunt suficient de stricte (adică, cu imidazol) și imunoglobulinele sunt abundente în raport cu proteinele de interes marcate cu His. Albuminele, cum ar fi albumina serică bovină (BSA), au, de asemenea, histidine multiple și se pot lega la suporturile IMAC în absența proteinelor marcate cu His din probă sau a imidazolului din tamponul de legare/spălare.

Thermo Scientific HisPur Cobalt Resin este o rășină de agaroză chelatatoare tetradentată încărcată cu cobalt divalent (Co2+). Rășina oferă un grad ridicat de puritate și poate recupera mai mult de 10 mg de proteină pură marcată cu His per mililitru de rășină fără contaminare cu metal sau necesitatea de a optimiza condițiile de spălare cu imidazol. .

Purificarea prin afinitate a proteinelor marcate cu His. Lizat de celule care conține proteină fluorescentă verde (GFP) etichetată cu 6xHis recombinantă supra-exprimată a fost preparat în reactiv de extracție a proteinelor bacteriene B-PER (nr. cat. 78243) și inhibitori de protează. Concentraţiile de proteine ​​au fost determinate prin Coomassie Plus Protein Assay (Cat. Nr. 23238). Lizat bacterian (1,0 mg proteină totală) a fost aplicat pe un volum de pat de 0,2 ml de rășină de cobalt HisPur într-o coloană de centrifugare. Răşina a fost spălată de trei ori cu 0,4 mL de tampon de spălare conţinând 10 mM imidazol. Proteinele marcate cu His au fost eluate de trei ori cu 0,2 mL de tampon de eluție care conține 150 mM imidazol. Benzile de gel au fost normalizate la un volum echivalent. Gelul a fost colorat cu Imperial Protein Stain (Cat. Nr. 24615). M = Marker de greutate moleculară, L = sarcină de lizat, FT = curgere.


O enzimă este o moleculă de proteină biologică alcătuită din mii de aminoacizi. Enzimele au funcții specifice în organism, cum ar fi lucrul pentru a descompune alimentele sau provocarea altor procese chimice. Enzimele nu mor niciodată, dar nu sunt considerate nici organisme vii, nici nevii. În schimb, ele sunt clasificate ca molecule naturale, biodegradabile, care se întâmplă să funcționeze ca niște mici mașini în organism și în alte organisme. Enzimele funcționează constant până când sunt dizolvate sau denaturate. Când enzimele se denaturează, acestea nu mai sunt active și nu mai pot funcționa. Temperatura extremă și nivelurile greșite de pH -- o măsură a acidității sau alcalinității unei substanțe -- pot determina denaturarea enzimelor.

Dr. Aleathea Wiggins este o scriitoare specializată în probleme de sănătate, parenting și familie. Ea este un fost profesor universitar, facilitator de curriculum și profesor. Dr. Wiggins deține diplome avansate și acreditări în jurnalism, educație, sănătate și administrarea îngrijirii copiilor. Lucrează ca scriitoare profesionistă din 2009.


Denaturarea inversă

Este adesea posibil să se inverseze denaturarea deoarece structura primară a polipeptidei, legăturile covalente care țin aminoacizii în secvența lor corectă, este intactă. Odată ce agentul de denaturare este îndepărtat, interacțiunile originale dintre aminoacizi readuc proteina la conformația sa originală și își poate relua funcția.

Cu toate acestea, denaturarea poate fi ireversibilă în situații extreme, cum ar fi prăjirea unui ou. Căldura dintr-o tigaie denaturează proteina albumină din albușul lichid de ou și devine insolubilă. Proteina din carne se denaturează și devine fermă atunci când este gătită.

Denaturarea unei proteine ​​este uneori ireversibilă(Sus) Albumina proteică din albușul de ou crud și fiert. (De jos) O analogie a agrafelor vizualizează procesul: atunci când sunt reticulate, agrafele (‘aminoacizi’) nu se mai mișcă liber structura lor este rearanjată și ‘denaturată’.

Proteinele chaperone (sau chaperonine) sunt proteine ​​auxiliare care oferă condiții favorabile pentru ca proteinele să aibă loc. Chaproninele se adună în jurul proteinei care se formează și împiedică agregarea altor lanțuri polipeptidice. Odată ce proteina țintă se pliază, chaperoninele se disociază.

Boundless verifică și organizează conținut de înaltă calitate, cu licență deschisă de pe internet. Această resursă particulară a folosit următoarele surse:


De la gură până la stomac

Cu excepția cazului în care îl consumați crud, primul pas în digestia ouălor (sau orice alt aliment proteic) implică mestecat. Dinții încep defalcarea mecanică a bucăților mari de ou în bucăți mai mici care pot fi înghițite. Glandele salivare furnizează puțină salivă pentru a ajuta la înghițire și la trecerea oului parțial zdrobit prin esofag. Bucățile de ou piure intră în stomac prin sfincterul esofagian. Stomacul eliberează sucuri gastrice care conțin acid clorhidric și enzima, pepsina, care inițiază descompunerea proteinei. Aciditatea stomacului facilitează desfacerea proteinelor care mai păstrează o parte din structura lor tridimensională după gătire și ajută la descompunerea agregatelor proteice formate în timpul gătirii. Pepsina, care este secretată de celulele care căptușesc stomacul, demontează lanțurile proteice în fragmente din ce în ce mai mici. Proteinele din ou sunt molecule globulare mari, iar descompunerea lor chimică necesită timp și amestecare. Contracțiile mecanice puternice ale stomacului transformă proteina parțial digerată într-un amestec mai uniform numit chim. Digestia proteinelor în stomac durează mai mult decât digestia carbohidraților, dar un timp mai scurt decât digestia grăsimilor. Mâncarea unei mese bogate în proteine ​​crește timpul necesar pentru a descompune suficient masa în stomac. Mâncarea rămâne în stomac mai mult timp, făcându-vă să vă simțiți sătul mai mult timp.


Ce s-ar întâmpla dacă plasăm ADN denaturat în mediu acid? - Biologie

Până la sfârșitul acestei secțiuni, veți putea face următoarele:

  • Explicați procesul de replicare a ADN-ului la procariote
  • Discutați rolul diferitelor enzime și proteine ​​în susținerea acestui proces

Replicarea ADN-ului a fost bine studiată la procariote, în primul rând datorită dimensiunii mici a genomului și datorită varietății mari de mutanți care sunt disponibili. E coli are 4,6 milioane de perechi de baze într-un singur cromozom circular și toate acestea sunt replicate în aproximativ 42 de minute, pornind de la un singur loc de-a lungul cromozomului și mergând în jurul cercului în ambele direcții. Aceasta înseamnă că se adaugă aproximativ 1000 de nucleotide pe secundă. Astfel, procesul este destul de rapid și are loc fără multe greșeli.

Replicarea ADN-ului folosește un număr mare de proteine ​​structurale și enzime, fiecare dintre acestea având un rol critic în timpul procesului. Unul dintre jucătorii cheie este enzima ADN polimeraza, cunoscut și sub denumirea de ADN pol, care adaugă nucleotide una câte una la lanțul de ADN în creștere care este complementar cu catena șablon. Adăugarea de nucleotide necesită energie, această energie este obținută din trifosfații nucleozidici ATP, GTP, TTP și CTP. Ca ATP, celălalt NTP-uri (nucleozide trifosfați) sunt molecule de înaltă energie care pot servi atât ca sursă de nucleotide ADN, cât și ca sursă de energie pentru a conduce polimerizarea. Atunci când legătura dintre fosfați este „ruptă”, energia eliberată este utilizată pentru a forma legătura fosfodiesterică între nucleotida de intrare și lanțul în creștere. La procariote, sunt cunoscute trei tipuri principale de polimeraze: ADN pol I, ADN pol II și ADN pol III. Acum se știe că ADN-ul pol III este enzima necesară pentru sinteza ADN-ului ADN-ul pol I este o enzimă accesorie importantă în replicarea ADN-ului și, împreună cu ADN-ul pol II, este necesar în primul rând pentru reparare.

Cum știe mașina de replicare de unde să înceapă? Se dovedește că există secvențe de nucleotide specifice numite originile replicării unde începe replicarea. În E coli, care are o singură origine de replicare pe un singur cromozom (ca majoritatea procariotelor), această origine de replicare are aproximativ 245 de perechi de baze și este bogată în secvențe AT. Originea replicării este recunoscută de anumite proteine ​​care se leagă de acest site. O enzimă numită helicaza desface ADN-ul prin ruperea legăturilor de hidrogen dintre perechile de baze azotate. Hidroliza ATP este necesară pentru acest proces. Pe măsură ce ADN-ul se deschide, structurile în formă de Y au numit furci de replicare sunt formate. Două furcuri de replicare se formează la originea replicării și acestea se extind bidirecțional pe măsură ce replicarea continuă. Proteinele de legare cu o singură catenă acoperă catenele simple de ADN din apropierea furculiței de replicare pentru a împiedica ADN-ul monocatenar să se întoarcă înapoi într-o dublă helix.

ADN polimeraza are două restricții importante: este capabilă să adauge nucleotide numai în direcția 5′ până la 3′ (o nouă catenă de ADN poate fi extinsă doar în această direcție). De asemenea, necesită o grupare 3′-OH liberă la care poate adăuga nucleotide prin formarea unei legături fosfodiester între capătul 3′-OH și fosfatul 5′ al următoarei nucleotide. Acest lucru înseamnă în esență că nu poate adăuga nucleotide dacă nu este disponibilă o grupare 3′-OH liberă. Atunci cum adaugă prima nucleotidă? Problema este rezolvată cu ajutorul unui primer care asigură capătul liber 3′-OH. O altă enzimă, primaza ARN, sintetizează un segment de ARN care are aproximativ cinci până la zece nucleotide lungime și complementar cu ADN-ul șablon. Deoarece această secvență amorsează sinteza ADN-ului, este numită în mod corespunzător primer. ADN polimeraza poate extinde acum acest primer ARN, adăugând una câte una nucleotidele care sunt complementare catenei șablon ((Figura)).

Art Connection

Figura 1. O furcă de replicare se formează atunci când helicaza separă catenele de ADN la originea replicării. ADN-ul tinde să devină mai puternic încolăcit înaintea furcii de replicare. Topoizomeraza rupe și reformează coloana vertebrală de fosfat a ADN-ului înaintea bifurcăturii de replicare, scăzând astfel presiunea care rezultă din această „superînvățare”. Proteinele de legare monocatenar se leagă de ADN-ul monocatenar pentru a preveni re-formarea helixului. Primaza sintetizează un primer ARN. ADN polimeraza III folosește acest primer pentru a sintetiza catena ADN fiică. Pe catena principală, ADN-ul este sintetizat continuu, în timp ce pe catena întârziată, ADN-ul este sintetizat în porțiuni scurte numite fragmente Okazaki. ADN polimeraza I înlocuiește primerul ARN cu ADN. ADN ligaza sigilează golurile dintre fragmentele Okazaki, unind fragmentele într-o singură moleculă de ADN. (credit: modificarea lucrării de Mariana Ruiz Villareal)

Întrebare: Izolați o tulpină celulară în care îmbinarea fragmentelor Okazaki este afectată și bănuiți că a avut loc o mutație într-o enzimă găsită la bifurcația de replicare. Care enzimă este cel mai probabil să sufere mutații?

Furculița de replicare se mișcă cu o viteză de 1000 de nucleotide pe secundă. Topoizomeraza previne supraînfăşurarea dublei helix a ADN-ului înaintea furcii de replicare, pe măsură ce ADN-ul se deschide, o face prin cauzarea unor tăieturi temporare în helixul ADN-ului şi apoi resigilarea acestuia. Deoarece ADN polimeraza se poate extinde doar în direcția 5′ până la 3′ și pentru că dubla helix ADN este antiparalel, există o ușoară problemă la furculița de replicare. Cele două catene de ADN șablon au orientări opuse: un fir este în direcția 5′ la 3′, iar celălalt este orientat în direcția 3′ la 5′. Doar o nouă catenă de ADN, cea care este complementară cu catena de ADN parentală de la 3′ la 5′, poate fi sintetizată continuu spre furculița de replicare. Această catenă sintetizată în mod continuu este cunoscută ca șira principală. Cealaltă catenă, complementară ADN-ului parental de la 5′ la 3′, este extinsă departe de furculița de replicare, în fragmente mici cunoscute sub numele de fragmente Okazaki, fiecare necesitând un primer pentru a începe sinteza. Noile segmente de primer sunt așezate în direcția furculiței de replicare, dar fiecare îndreptat departe de ea. (Fragmentele Okazaki sunt numite după omul de știință japonez care le-a descoperit pentru prima dată. Șuvița cu fragmentele Okazaki este cunoscută sub denumirea de șuviță întârziată.)

Șuvița principală poate fi extinsă de la un singur primer, în timp ce șuvița întârziată are nevoie de un nou primer pentru fiecare dintre fragmentele scurte Okazaki. Direcția generală a șuviței întârziate va fi de la 3′ la 5′, iar cea a firului de conducere de la 5′ la 3′. O proteină numită clemă glisantă ține ADN-polimeraza pe loc în timp ce aceasta continuă să adauge nucleotide. Clema de alunecare este o proteină în formă de inel care se leagă de ADN și menține polimeraza pe loc. Pe măsură ce sinteza continuă, primerii ARN sunt înlocuiți cu ADN. Primerii sunt îndepărtați prin activitatea exonuclează a ADN-ului pol I, care utilizează ADN-ul din spatele ARN-ului ca primer său propriu și umple golurile lăsate de îndepărtarea nucleotidelor ARN prin adăugarea de nucleotide ADN. Puncturile care rămân între ADN-ul nou sintetizat (care a înlocuit primerul ARN) și ADN-ul sintetizat anterior sunt sigilate de enzima ADN ligaza, care catalizează formarea legăturilor fosfodiester între capătul 3′-OH al unei nucleotide și 5& #8242 capătul fosfat al celuilalt fragment.

Odată ce cromozomul a fost complet replicat, cele două copii ADN se mută în două celule diferite în timpul diviziunii celulare.

Procesul de replicare a ADN-ului poate fi rezumat după cum urmează:

  1. ADN-ul se desfășoară la originea replicării.
  2. Helicaza deschide furcile de replicare care formează ADN, acestea sunt extinse bidirecțional.
  3. Proteinele de legare cu o singură catenă acoperă ADN-ul în jurul furcii de replicare pentru a preveni rebobinarea ADN-ului.
  4. Topoizomeraza se leagă în regiunea dinaintea furcăturii de replicare pentru a preveni supraînfăşurarea.
  5. Primaza sintetizează primeri ARN complementari catenei de ADN.
  6. ADN polimeraza III începe să adauge nucleotide la capătul 3′-OH al primerului.
  7. Elongația atât a firului întins, cât și a șuviței conducătoare continuă.
  8. Primerii ARN sunt îndepărtați prin activitatea exonucleazei.
  9. Golurile sunt umplute de ADN pol I prin adăugarea dNTP-urilor.
  10. Decalajul dintre cele două fragmente de ADN este sigilat de ADN ligază, care ajută la formarea legăturilor fosfodiester.

(Figura) rezumă enzimele implicate în replicarea ADN-ului procariot și funcțiile fiecăruia.

Replicarea ADN-ului procariotic: enzime și funcția lor
Enzimă/proteină Funcție specifică
DNA pol I Îndepărtează primerul ARN și îl înlocuiește cu ADN nou sintetizat
DNA pol III Enzima principală care adaugă nucleotide în direcția 5′-3′
Helicaza Deschide helixul ADN-ului prin ruperea legăturilor de hidrogen dintre bazele azotate
Ligaza Sigilează golurile dintre fragmentele Okazaki pentru a crea o singură catenă de ADN continuă
Primaza Sintetizează primerii ARN necesari pentru a începe replicarea
Clemă glisantă Ajută la menținerea ADN-polimerazei în loc atunci când se adaugă nucleotidele
Topoizomeraza Ajută la ameliorarea tensiunii asupra ADN-ului la desfășurare, provocând rupturi și apoi reetanșând ADN-ul
Proteine ​​de legare cu o singură catenă (SSB) Se leagă de ADN-ul monocatenar pentru a preveni rebobinarea ADN-ului.

Link către Învățare

Consultați procesul complet de replicare a ADN-ului aici.

Rezumatul secțiunii

Replicarea la procariote începe de la o secvență găsită pe cromozom numită originea replicării - punctul în care ADN-ul se deschide. Helicaza deschide helixul dublu al ADN-ului, rezultând în formarea furcii de replicare. Proteinele de legare cu o singură catenă se leagă de ADN-ul monocatenar din apropierea furcii de replicare pentru a menține furculița deschisă. Primaza sintetizează un primer ARN pentru a iniția sinteza prin ADN polimerază, care poate adăuga nucleotide numai la capătul 3′ al unei catene de primer sintetizate anterior. Ambele catene noi de ADN cresc conform directiilor lor 5′-3′. O catenă este sintetizată în mod continuu în direcția furcii de replicare, aceasta se numește șir principal. Cealaltă catenă este sintetizată într-o direcție îndepărtată de bifurcația de replicare, în porțiuni scurte de ADN cunoscute sub numele de fragmente Okazaki. Această șuviță este cunoscută sub denumirea de șuviță întârziată. Odată ce replicarea este finalizată, primerii ARN sunt înlocuiți cu nucleotide ADN și ADN-ul este sigilat cu ADN ligază, care creează legături fosfodiester între 3′-OH de la un capăt și 5′ fosfatul celuilalt catene.

Art Connections

(Figure) You isolate a cell strain in which the joining of Okazaki fragments is impaired and suspect that a mutation has occurred in an enzyme found at the replication fork. Which enzyme is most likely to be mutated?


Priveste filmarea: Lectia de astronomie 4 (August 2022).