Informație

Cum poate fi analizat un YAC împotriva unei biblioteci de ADNc și a unei biblioteci cosmide de ADN genomic pentru a găsi o genă?

Cum poate fi analizat un YAC împotriva unei biblioteci de ADNc și a unei biblioteci cosmide de ADN genomic pentru a găsi o genă?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

citesc fw2.2: O trăsătură cantitativă cheie pentru evoluția mărimii fructelor de tomate (doi: 10.1126/science.289.5476.85).

Autorii încearcă să găsească gena care face roșiile mai mari. Din câte am înțeles, cercetările anterioare l-au restrâns la „ceva” în regiunea genomului numită fw2.2. Ei încearcă să determine elementele genetice reale responsabile (care se dovedește a fi o genă similară cu cea umană HRAS).

Se presupune că alela fructelor mari este recesivă, iar alela fructelor mici este dominantă.

Ei spun (în secțiunea Complementare genetică cu fw2.2) acea:

  1. Au primit un YAC care conține fw2.2.
  2. Ei au „screened o bibliotecă de ADNc” cu YAC pentru a găsi transcrieri care ar fi potențial relevante. (Cum?)
  3. Ei au „cercat o bibliotecă de cosmide” de fragmente genomice pentru a găsi întinderea genomului din care provine cosmida. (Cum?)

Nu îmi este clar cum funcționează pașii 2 și 3. Poate cineva să explice cum poți lua o bibliotecă YAC, ADNc și o bibliotecă de cosmide pentru a găsi gena din interiorul regiunii responsabile pentru trăsătura ta, așa cum descriu acești cercetători?


YAC conține un segment de ADN cromozomial. Folosindu-l ca sondă, aceștia ar putea analiza biblioteca de ADNc pentru a găsi ADNc derivat din acea regiune genomică. Acest lucru s-ar face prin hibridizare pe placă sau colonie. Clonele de ADNc astfel identificate reprezintă „genele candidate”.

Ultimul pas este puțin neclar. În mod clar, identifică clone de cosmide care se mapează la segmentul de interes, dar ar putea folosi fie YAC, fie clone relevante de ADNc (ar putea fi reunite pentru această etapă în funcție de scopul lor) ca sonde. Bănuiala mea este că au folosit clone individuale de ADNc pentru a găsi fragmente de cosmide corespunzătoare, astfel încât să poată ajunge în regiunile care codifică ADNc-urile identificate.


Biblioteci genomice

Viitorul bibliotecilor genomice

Construcția bibliotecii genomice rămâne o tehnică importantă în biologia moleculară. Aceste resurse sunt critice pentru analiza funcției genelor și pentru detectarea genelor înrudite din diferite surse. Bibliotecile genomice sunt utilizate în prezent pentru a găsi noi produse naturale, cum ar fi antimicrobienele. Ele sunt, de asemenea, folosite pentru a descoperi și optimiza noi căi biochimice, cum ar fi cele necesare pentru producerea de biocombustibili și alte substanțe chimice complexe. În plus, bibliotecile genomice rămân un instrument esențial pentru asamblarea cantității mari de informații de secvență care este produsă din NGS.

Odată cu apariția biologiei sintetice, este posibil să se manipuleze fragmente care conțin milioane de perechi de baze, permițând ingineria unor căi și genomuri întregi. Punctul culminant actual al acestei tehnologii este asamblarea unui întreg genom bacterian (Laboratorul Mycoplasma) dintr-un subset al genelor sale parentale care au fost sintetizate în laborator. Cu toate acestea, instrumentele disponibile sunt încă la început, iar tehnologia este costisitoare și consumatoare de timp. Viitorul bibliotecilor genomice poate consta în metode de a construi cu ușurință cromozomi artificiali care conțin orice elemente genetice dorite, folosind „blocuri de construcție” ușor accesibile. Astfel de metode pot duce la genomi complet sintetici, preprogramați și sunt deja în dezvoltare.


Modulul #3

(3) ARN-ul este „blot” (transferat) din gel pe o membrană.

(4) ARN-ul este fixat pe membrană și hibridizat cu o sondă (sonda este marcată radioactiv sau cu enzime pentru chemiluminescență)

(5) Vizualizarea ARN-ului folosind film cu raze X sau ecran fosfoimager.

A.
răspândirea cromozomilor
b.
proteină
c.
plasmidă
d.
centromer
e.
mai multe gazde
f.
Taq polimeraza
g.
Cuantificarea ADN-ului
h.
interacțiunea proteină/ADN
i.
lacZ
j.
ADN străin
k.
ARNm
l.
Agrobacterium tumefaciens

A.
răspândirea cromozomilor
b.
proteină
c.
plasmidă
d.
centromer
e.
mai multe gazde
f.
Taq polimeraza
g.
Cuantificarea ADN-ului
h.
interacțiunea proteină/ADN
i.
lacZ
j.
ADN străin
k.
ARNm
l.
Agrobacterium tumefaciens

A.
răspândirea cromozomilor
b.
proteină
c.
plasmidă
d.
centromer
e.
mai multe gazde
f.
Taq polimeraza
g.
Cuantificarea ADN-ului
h.
interacțiunea proteină/ADN
i.
lacZ
j.
ADN străin
k.
ARNm
l.
Agrobacterium tumefaciens

A.
răspândirea cromozomilor
b.
proteină
c.
plasmidă
d.
centromer
e.
mai multe gazde
f.
Taq polimeraza
g.
Cuantificarea ADN-ului
h.
interacțiunea proteină/ADN
i.
lacZ
j.
ADN străin
k.
ARNm
l.
Agrobacterium tumefaciens

Identificarea variantelor de enzime de restricție

Screening pentru tulburări genetice

Screening de diagnostic pentru organismele infecțioase

marker selectabil, cum ar fi rezistența amp

A.
răspândirea cromozomilor
b.
proteină
c.
plasmidă
d.
centromer
e.
mai multe gazde
f.
Taq polimeraza
g.
Cuantificarea ADN-ului
h.
interacțiunea proteină/ADN
i.
lacZ
j.
ADN străin
k.
ARNm
l.
Agrobacterium tumefaciens

(2) fag: un virus care conține ADN-ul de interes infectează bacteriile este mai eficient decât transformarea plasmidei și poate transporta

(3) cosmidă: tip de plasmidă hibridă care conține secvențe de plasmidă plus secvențele COS din fag pentru ambalarea capsidei pentru transducția fagilor cosmidele formează colonii, nu plăcile pot transporta până la

1/5000bp este tăiat (3e9/5000) = 600.000 tăieturi
8 freza de bază = (1/4)^8 = 1e-5

toate genele sunt reprezentate în mod egal în biblioteca genomică, în timp ce biblioteca ADNc reflectă nivelul de exprimare al unei gene într-un anumit tip de celulă sau țesut

1. secvență foarte repetitivă (10%): Este o porțiune negenică, conține 1. Repetări în tandem: ex: ADN satelit (ADN mini/microsatelit) prezent în principal în regiunile centromerice și telomerice (heterocromatină). 2.Repetări dispersate:ex: LINII și SINES

2. secvență moderat repetitivă (20%) : Familii de gene (Familie de gene omogene sau familie de gene heterogene) Ex: cluster de gene r-ARN, cluster de gene Histone.

3. secvență nerepetitivă (70%): Aproape toate genele structurale.

secvențe repetitive prezente în principal în regiunile heterocromatine, în principal regiuni necodante. regiuni nerepetitive prezente în regiunea eucromatinei, în principal regiuni de codificare.


[8] Selecția directă de ADNc folosind ținte mari de ADN genomic

Selecția directă a ADNc este o metodologie de clonare pozițională care poate fi utilizată pentru a efectua identificarea țintită și detaliată a genelor într-un interval genomic mare. Poate fi utilizat cu eficiență ridicată pe conturi de mai multe megabaze de lungime și, astfel, poate fi folosit atunci când intervalul țintă genetic este definit doar pe scară largă. Acest capitol prezintă protocoale pentru scalarea acestui proces până la un întreg cromozom uman. Ca o metodă de derivare a genelor rămase în genomul uman, selecția directă de ADNc cu un cromozom uman întreg poate fi utilizată pentru a genera biblioteci de ADNc specifice cromozomului. Capitolul prezintă o tehnică pentru extinderea unui număr mare de ADNc selectate direct în masă prin capturarea cercurilor de ADNc monocatenar după selecție, dar înainte de donare. Selecția directă a ADNc este o tehnică bazată pe expresie utilizată pentru a obține hărți de transcripție și gene candidate din regiuni genomice mari. Se bazează pe hibridizarea soluției și captura ulterioară a cADN-urilor amplificabile prin reacția în lanț a polimerazei (PCR) folosind șabloane genomice biotinilate.


Titlu: O metodă directă pentru clonarea pozițională a cADN-urilor prin hibridizare in situ și microdisecție a cromozomilor în metafază

Am dezvoltat o nouă strategie pentru donarea rapidă a cADN-urilor pentru genele conținute în regiuni citogenetice definite ale genomului. O bibliotecă de ADNc este preparată prin RT-PCR a ARN folosind primeri cu 3 la 5 secvențe formate din 4 nucleotide specifice, urmate de 5 nucleotide aleatorii și apoi 20 de nucleotide specifice. Această bibliotecă este hibridizată cu cromozomi metafazici fixați cu acid imobilizați pe sticlă peste slips. Regiunea cromozomială de interes este microdisecată, iar ADNc-urile hibridizate cu fragmentele cromozomiale disecate sunt amplificate prin PCR utilizând primeri corespunzători secvenței specifice de 20 de nucleotide prezente la 5. sfârşitul primerilor utilizaţi pentru a genera biblioteca ADNc originală. Produsele PCR obținute pot fi apoi analizate pentru modificări genetice, cum ar fi mutații punctuale, rearanjamente, deleții sau amplificare. Această strategie a fost testată prin clonarea cADN-urilor din cromozomii dublu minute ai liniei celulare de carcinom de colon Colo320, despre care se știe că posedă copii amplificate ale genelor MYC și PVT. Microdisecția și PCR a unui număr mic de cromozomi dublu minute (5-15) au produs cADN care conțin secvențe ale ambelor aceste gene, precum și alte câteva gene necunoscute anterior, dar probabil legate, amplificate în linia Colo320. Această strategie pare mai mult să ofere o metodă rapidă și generală pentru izolarea ADN-ului pentru genele candidate care se află la pozițiile diferitelor anomalii citogenetice sau care se mapează la anumite regiuni din genom. « mai putin


↵ * K.S., T.S. și M.R. au contribuit în mod egal la această lucrare.

↵ † Adresa actuală: The Salk Institute for Biological Studies, Plant Biology Lab, 10010 N. Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037.

↵ ‡ Adresă actuală: Max-Delbrück-Laboratorium in der Max-Planck-Gesellschaft, Carl-von-Linné-Weg 10, D-50829 Köln, Germania.

↵ § Cui trebuie adresate cererile de retipărire. e-mail: acolompiz-koeln.mpg.de .

Depunerea datelor: Secvența raportată în această lucrare a fost depusă în baza de date GenBank (nr. acces AF098674).


Asemănări între vectorul de clonare și vectorul de expresie

  • Atât vectorii de donare, cât și de expresie sunt utilizați în introducerea de segmente de ADN străine într-o celulă țintă cunoscută sub numele de celulă gazdă.
  • Atât vectorii de donare, cât și vectorii de expresie au caracteristici comune, cum ar fi originea replicării, situsuri de restricție unice și gena marker selectabilă în secvența lor vectorială.
  • Atât vectorii de donare, cât și vectorii de expresie sunt capabili să se replice independent în interiorul celulei gazdă.

Mulțumiri

Autorii sunt recunoscători proiectului Australia-India Strategic Research Fund (AISRF) finanțat de Departamentul de Știință și Tehnologie (DST) și proiectului Tropical Legumes I (TLI) finanțat de Fundația Bill și Melinda Gates (BMGF) prin Programul CGIAR-Generation Challenge. (GCP http://www.generationcp.org/). Departamentul de Biotehnologie (DBT) este foarte recunoscut pentru acordarea grantului și a bursei primului autor. Această activitate a fost realizată ca parte a Programului de cercetare CGIAR privind leguminoasele din cereale și cerealele uscate. ICRISAT este membru al Consorțiului CGIAR.


Tehnologia ADN recombinant | Genetica

Tehnologia ADN-ului recombinant a revoluționat științele vieții, deschizând noi perspective pentru cercetarea în biologie moleculară. Permite manipularea genetică folosind tehnici de sintetizare, amplificare și purificare a genelor individuale din orice tip de celulă.

Genomica a apărut ca o extensie a tehnologiei ADN recombinant pentru cartografierea și caracterizarea de înaltă rezoluție a genomurilor întregi și a produselor genetice la scară largă, denumită analiză globală.

Aceste discipline care avansează rapid promit noi perspective asupra datelor secvențe, organizarea, exprimarea și reglarea materialului genetic. Ingineria genetică este o consecință naturală a acestor tehnici, explorând aplicarea în domeniul medical, al industriei biotehnologice și al agriculturii.

Succesul tehnologiei ADN recombinant se bazează pe câteva descoperiri cheie: enzime de restricție care pot tăia și uni fragmente de ADN (foarfece moleculare) pentru manipulări într-o eprubetă utilizarea plasmidelor și ADN-ului bacteriofag ca vectori (vehicule) pentru ADN străin care se poate replica în copii identice și produc clone care conțin ADN recombinant introducerea tehnicii Southern blotting și dezvoltarea reacției în lanț a polimerazei pentru amplificarea unei secvențe specifice.

Moleculele de ADN recombinant pot fi purificate și investigate pentru înțelegerea structurii și secvenței genei și pot fi inserate într-un alt genom.

Moleculele de ADN recombinant sunt construite artificial prin încorporarea ADN din două surse diferite într-o singură moleculă recombinată. Procesul este diferit de recombinare, care este un proces natural în organismele care se reproduc sexual, prin care un singur individ primește o combinație de gene de la două organisme parentale.

Recombinarea naturală implică reunirea secvențelor de nucleotide similare în ADN-ul cromozomial, ruperea și schimbul de segmente corespunzătoare și reunirea. Acest tip de recombinare, în special, produce noi aranjamente de alele și apare de obicei la specii strâns înrudite. Nu are loc în organisme neînrudite din cauza barierelor naturale.

Endonucleaze de restricție:

Endonucleazele de restricție sunt o clasă de enzime care pot recunoaște și se pot lega de secvențe specifice de ADN de patru până la opt nucleotide, apoi scindează coloana vertebrală zahăr-fosfat a fiecăreia dintre cele două catene la locul de legare. Toate enzimele de restricție taie ADN-ul între carbonul 3′ și fragmentul fosfat al coloanei vertebrale fosfodiester.

Prin urmare, fragmentele produse prin digestia cu enzime de restricție au 5′ fosfați și 3′ hidroxili. Majoritatea enzimelor de restricție sunt prezente în bacterii, doar una a fost găsită în alga verde Chlorella. La bacterii, enzimele de restricție protejează bacteria împotriva ADN-ului străin, cum ar fi cel din viruși, prin tăierea ADN-ului viral invadator. Astfel, ele restricționează intrarea ADN-ului străin în celula bacteriană.

Bacteria își modifică propriile locuri de restricție prin metilare, astfel încât propriul său ADN este protejat de enzima de restricție pe care o produce. Trei oameni de știință care au descoperit enzimele de restricție și aplicațiile lor și anume, Adams, Nathan și Smith, au primit Premiul Nobel în 1978.

Au fost izolate peste 400 de enzime de restricție diferite. Enzima de restricție EcoRI (de la E. coli) recunoaște următoarea secvență de șase perechi de baze de nucleotide în ADN-ul oricărui organism: 5′-GAATTC-3′ și 3′-CTTAAG-5′.

Se spune că acest tip de secvență de nucleotide este simetric, numit palindrom deoarece ambele catene au aceeași secvență de nucleotide în orientare antiparalelă. Mai multe enzime de restricție diferite recunosc palindromuri specifice. Multe enzime de restricție, inclusiv EcoRI, taie secvența producând capete eșalonate. EcoRI taie între G și A (Fig. 23.1).

Tăieturile eșalonate dau naștere unei perechi de “capete lipicioase”, lungi, identice, cu cinci nucleotide. Capetele constau dintr-o bucată de ADN monocatenar, care se spune că este lipicioasă, deoarece pot perechi de baze prin legături de hidrogen la o secvență complementară. Capetele lipicioase produse de enzimele de restricție sunt de dorit în tehnologia ADN recombinant.

Dacă două molecule ADN diferite sunt tăiate cu aceeași enzimă de restricție, fragmentele fiecăreia vor avea aceleași capete lipicioase care sunt complementare, permițându-le să hibridizeze unele cu altele în condiții adecvate. Unele enzime de restricție, cum ar fi tăierea mică a secvenței țintă în mijloc, produc capete contondente cărora le lipsesc capete lipicioase.

Acestea pot fi, de asemenea, utilizate pentru a face molecule de ADN recombinant cu ajutorul enzimelor care unesc capete contondente sau alte enzime speciale care sintetizează capete lipicioase scurte monocatenar pe catena 3′ expusă a capătului contonat.

Digestia ADN-ului de către o enzimă de restricție produce fragmente de lungimi diferite. De exemplu, ADN-ul bacteriofag λ tăiat cu enzima de restricție EcoRI produce șase fragmente cu dimensiuni cuprinse între 3,6 și 21,2 kilo baze în lungime (un kilo-bază sau kb = 1.000 perechi de baze). Aceste fragmente pot fi separate după mărime prin electroforeză pe gel (Fig. 23.2, 3) sau prin alte metode.

Fragmentele împreună oferă o hartă a situsurilor EcoRI din ADN-ul fagului λ. Dacă sunt utilizate mai multe endonucleaze de restricție diferite, locațiile situsurilor lor de clivaj pot fi utilizate pentru a genera hărți detaliate de restricție ale moleculei de ADN.

Electroforeza pe gel pentru separarea fragmentelor de ADN:

Celulele sunt omogenizate și nucleele izolate pentru extragerea ADN-ului. Pentru a liza nucleele și a elibera ADN-ul, se folosește un detergent încărcat negativ dodecil sulfat de sodiu (SDS). Următorul pas implică purificarea ADN-ului de contaminanți precum ARN și proteine. Pentru a elimina proteinele, amestecul este agitat cu fenol sau cloroform.

Fenolul face proteinele insolubile și le precipită din soluție. Deoarece fenolul și soluția salină tamponată sunt nemiscibile, ele formează două faze separate. Centrifugarea dă ADN sau ARN în faza apoasă superioară, în timp ce precipitatul proteic formează granița dintre cele două faze.

Faza apoasă care conține acidul nucleic este îndepărtată din tub și agitată cu fenol, urmată de centrifugare. Procesul se repetă până când nicio altă proteină nu poate fi îndepărtată din soluție. Etanolul rece este apoi stratificat deasupra soluției apoase de ADN, iar ADN-ul este scos cu o baghetă de sticlă la interfața dintre etanol și soluție salină. ARN formează un precipitat care se depune pe fundul vasului.

Pentru ca preparatul de ADN să fie liber de ARN, ADN-ul este tratat cu ribonuclează. Ribonucleaza este distrusă prin tratament cu protează, iar proteaza este îndepărtată prin utilizarea fenolului. ADN-ul purificat este apoi reprecipitat cu etanol.

Electroforeza depinde de capacitatea moleculelor încărcate de a migra într-un câmp electric. Fragmentele mici de ADN de câteva sute de nucleotide sau mai puțin, produse de o endonuclează de restricție, pot fi separate prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă (PAGE). Fragmentele de ADN mai mari, variind în dimensiune de la câteva sute de perechi de baze până la aproximativ 20 kb, pot fi separate pe geluri de agaroză.

Mecanismul de separare a fragmentelor de ADN implică migrarea moleculelor de ADN prin porii gelului matricial. Agaroza constă dintr-o rețea complexă de molecule polimerizate, a cărei dimensiune a porilor este determinată de compoziția tamponului și concentrația de agar utilizat.

Vizualizarea prin microscopie cu fluorescență a arătat că în timpul electroforezei moleculele de ADN se întind în direcția câmpului aplicat și apoi se contractă în bile dense. Mărimea bilei de ADN trebuie să fie mai mică decât dimensiunea porilor din gel pentru a trece. Dacă volumul bilei de ADN îl depășește pe cel al dimensiunii porilor din gel, atunci molecula de ADN poate trece doar printr-o mișcare serpentină asemănătoare cu cea a unui șarpe.

Moleculele de ADN de până la 20 kb pot migra prin porii din gel prin acest mecanism. Studiile au arătat că atât lungimea fragmentului, cât și greutatea moleculară determină rata de migrare a moleculelor de ADN într-un gel. Pentru determinarea exactă a mărimii unei molecule de ADN, probe de ADN marker de mărime cunoscută sunt supuse electroforezei în același gel.

Procedura pentru electroforeza pe gel de poliacrilamidă este următoarea. Un amestec de fragmente de ADN liniare de diferite dimensiuni sunt conduse de curentul prin gelul compus din molecule organice de acrilamidă. Legătura încrucișată a moleculelor de acrilamidă formează o sită moleculară într-o placă subțire de gel de poliacrilamidă între două plăci de sticlă. Placa de gel este suspendată între două compartimente care conțin tampon în care sunt scufundați electrozii pozitivi și negativi (Fig. 23.2).

Proba care conține molecule liniare de ADN (fragmente) este plasată în godeuri de-a lungul vârfului gelului, lângă catodul câmpului electric. Tensiunea aplicată între compartimentele tampon permite curentului să curgă peste placa. Datorită grupărilor sale de fosfat încărcate negativ, ADN-ul migrează către electrodul pozitiv (anod) la viteze invers dependente de dimensiunea lor. Adică fragmentele mai mici migrează cel mai rapid.

Toate moleculele de ADN, indiferent de lungimea lor, au o densitate de sarcină similară, adică numărul de sarcini negative pe unitatea de masă și, prin urmare, toate au un potențial echivalent de migrare în câmpul electric. Cu cât masa moleculară a fragmentului de ADN este mai mare, cu atât se mișcă mai lent prin gel. Prin urmare, cu cât fragmentul este mai mic, cu atât migrează mai departe în gel.

Prin urmare, dacă există clase de mărime distincte în amestecul de fragmente de ADN, aceste clase vor forma benzi distincte pe gel. Fragmentele de diferite dimensiuni sunt astfel separate unele de altele (Fig. 23.3). Benzile pot fi vizualizate prin colorarea ADN-ului cu bromură de etidio.

Migrarea fragmentelor de ADN poate fi comparată cu un set de standarde de dimensiune de control care au fost încărcate în același gel, pentru a determina dimensiunea exactă a fiecărui fragment din amestec. Mai mult, dacă benzile sunt bine separate, o singură bandă poate fi tăiată din gel și proba de ADN poate fi extrasă și purificată.

Fragmentele de ADN mai mari, care nu trec prin porii poliacrilamidei, sunt fracţionate pe geluri de agaroză care au porozitate mai mare. Agaroza este o polizaharidă de iarbă de mare, se dizolvă în tampon fierbinte și se toarnă în matriță și se pune un pieptene în agaroza topită. Scăderea temperaturii solidifică agaroza sub formă de gel. Pieptene este îndepărtat producând godeuri în gel. Probele de ADN sunt încărcate în godeuri.

Gelurile cu o concentrație de 0,3% de agaroză sunt folosite pentru a separa fragmente mai mari de ADN. După rularea gelului, fragmentele de ADN pot fi identificate folosind o sondă marcată, pentru un fragment specific. Alternativ, gelul poate fi colorat cu o soluție de bromură de etidio care se intercalează în bazele din dublu helix. Benzile ADN pot fi vizualizate sub lumină ultravioletă folosind un trans-iluminator.

Electroforeză pe gel cu câmp de puls:

Separarea moleculelor de ADN mai mare de 20 kb, până la 10 Mb poate fi realizată prin utilizarea electroforezei pe gel cu câmp de impuls (PFGE). În PFGE, orientarea câmpului electric în raport cu gelul este schimbată în mod regulat, ceea ce face ca ADN-ul să-și modifice periodic direcția de migrare pe gel.

De fiecare dată când are loc o schimbare a orientării câmpului electric, axa ADN-ului trebuie să se realinieze înainte de a începe migrarea în noua direcție. Diferența dintre direcția de migrare a ADN-ului indusă de câmpurile electrice succesive determină unghiul prin care ADN-ul trebuie să se rotească pentru a-și schimba direcția de migrare. Pentru ca proba să ruleze în linii drepte, au fost concepute metode îmbunătățite de alternare a câmpului electric. PFGE este utilizat pe scară largă în laboratoarele de biologie moleculară.

Southern Blotting:

Când ADN-ul genomic este supus digestiei cu enzime de restricție, rezultă un număr foarte mare de fragmente. Un gel colorat care conține numeroase fragmente separate prin electroforeză prezintă un frotiu continuu de ADN în loc de benzi distincte. Tehnica Southern blotting dezvoltată de E. M. Southern permite identificarea unui singur fragment de ADN sau a unei gene specifice în acest amestec.

Aceasta este o tehnică utilizată pe scară largă, care se bazează pe etichetarea ADN-ului și hibridizarea pe membrane. Este denumită tehnică de blotting deoarece implică transferul acizilor nucleici din geluri pe un suport solid al unei membrane și imobilizarea ADN-ului pe membrană. Detectarea fragmentului de ADN se face prin utilizarea unei catene complementare de ADN sau ARN care se numește sondă (ceva care detectează este o sondă) care hibridizează cu fragmentul de ADN.

Transferul ADN-ului de la gel la membrană se realizează prin fluxul de tampon prin fitil, gel, membrană și mai sus pe straturi de hârtie adsorbantă. Gelul este suprapus pe un fitil de hârtie de filtru (3 până la 4 foi) care se scufundă în tamponul conținut într-un vas (Fig. 23.4). Membrana de hibridizare este plasată deasupra gelului.

Un teanc de prosoape de hârtie vine deasupra membranei. Prosoapele de hârtie adsorbante servesc la atragerea tamponului prin gel prin acțiune capilară. Fluxul de tampon transportă moleculele de ADN din gel pe membrană (nitroceluloză sau membrană de nailon). Membranele de nailon sunt considerate superioare prin faptul că au o capacitate mai mare de legare a acizilor nucleici și sunt mai puternice decât membranele formate din nitroceluloză.

Fragmentele mari de ADN necesită un timp mai lung pentru a fi transferate din gel decât fragmentele mai scurte. Pentru a depăși astfel de diferențe de timp, ADN-ul electroforezat de pe gel este pretratat pentru depurinare, care denaturează, de asemenea, fragmentele în catene simple, făcându-le accesibile pentru hibridizare cu sonda.

După transferul din gel, fragmentele de ADN sunt atașate (fixate permanent) de membrană prin încălzire la 80°C în cuptor sau prin reticulare folosind radiații UV. Fragmentele de ADN devin fixate sau imprimate pe membrană în aceleași locații ca și în gel (replică).

Cu alte cuvinte, aranjamentul spațial al ADN-ului în gel este păstrat în foaie. După fixare, membrana este incubată într-o soluție care conține ADN monocatenar marcat sau o sondă de ARN care este complementară cu secvența de ADN transferată pe blot care urmează să fie detectată. În condiții adecvate, sonda de acid nucleic marcată hibridizează cu ADN-ul de pe membrană.

După hibridizare, membrana este spălată pentru a îndepărta sondele nelegate, astfel încât singurele molecule marcate rămase sunt cele care s-au hibridizat cu ADN-ul țintă. Membrana este apoi plasată în contact cu filmul cu raze X pentru autoradiografie care va dezvălui poziția fragmentului de ADN dorit.

Prin utilizarea controalelor de calibrare a mărimii, poate fi determinată dimensiunea oricărui fragment din amestecul de fragmente. Variațiile Southern blotting se numesc Dot și Slot blots. Proba se tamponează direct pe foaia de nailon sau nitroceluloză fără separare prealabilă pe gel.

Această tehnică este similară cu tehnica Southern blotting și este utilizată pentru identificarea unei molecule specifice de ARN dintr-un amestec de ARN separat pe un gel. Moleculele de ARN separate de pe un gel sunt tamponate pe o membrană și sondate în același mod în care ADN-ul este blotat și sondat în Southern blot. O genă donată având o secvență complementară cu ARN-ul căutat poate fi utilizată ca sondă.

Pe scurt, este o combinație a tehnicilor remarcabile recente care își găsesc aplicații pe scară largă. Generarea fragmentelor de restricție, electroforeza pe gel, tehnicile de blotting, clonarea, împreună cu hibridizarea acidului nucleic permit analizarea unei secvențe specifice de ADN într-un întreg genom.

Pentru a identifica o genă individuală, ADN-ul din organism este purificat și scindat de enzimele de restricție. Fragmentele de restricție sunt separate prin electroforeză pe gel. Fragmentele sunt denaturate pentru a obține catene simple, apoi marcate cu o sondă radioactivă.

Sonda constând din ADN sau ARN monocatenar trebuie să aibă o secvență care să poată perechi bazele cu gena de interes. Sonda hibridizează cu secvența sa complementară în condiții adecvate de temperatură, sare și pH. Expunerea la filmul cu raze X indică legarea sondei prin prezența semnalului radioactiv.

Molecule de ADN recombinant:

Generarea de molecule de ADN recombinant este un proces de inserare a unei gene de interes sau ADN donor într-o moleculă de ADN dintr-o sursă diferită care acționează ca un vector sau vehicul pentru ADN-ul donor. Primul pas este obținerea ADN-ului donatorului, adică izolarea genei de interes. ADN-ul genomic din organismul donor este izolat, purificat și tăiat cu o endonuclează de restricție care face tăieturi eșalonate cu capete lipicioase în ADN-ul donor.

Capetele lipicioase constau din cozi monocatenare acoperite sau coezive. Astfel, ADN-ul donor va fi tăiat într-un set de fragmente de restricție în funcție de locațiile situsurilor de restricție. ADN-ul vector, care ar putea fi o plasmidă bacteriană sau un genom al bacteriofagului λ (descris mai târziu), este, de asemenea, tăiat cu aceeași enzimă de restricție care a fost utilizată pentru ADN-ul donor.

Fragmentele astfel produse ar avea aceleași capete complementare lipicioase sau coezive, permițându-le să hibridizeze cu capete lipicioase din fragmentele de ADN donor. Moleculele hibridizate produse nu au schele vertebrale complete de fosfat de zahăr unite covalent. Pentru a sigila coloana vertebrală, se folosește enzima ADN ligaza care face legături fosfodiester și leagă cele două covalent pentru a forma o moleculă de ADN recombinant (Fig. 23.5).

Alte surse de ADN donator:

Pe lângă ADN-ul genomic de la un organism donator, este posibil să se utilizeze secvențe de ARN ca donatori. Primul pas este de a sintetiza o copie ADN a ARN-ului folosind enzima transcriptaza inversă. ADN-ul complementar sau ADNc obținut poate fi utilizat ca ADN donor prin încorporarea acestuia în ADN-ul vector și realizarea unei molecule de ADN recombinant.

În studiile care necesită caracterizarea transcriptului genei, adică ARNm, se prepară un ADNc utilizând ARNm ca matriță pentru transcriptază inversă. Acest lucru este util în special deoarece ARNm este de scurtă durată și nu sunt disponibile tehnici pentru izolarea moleculelor individuale de ARNm. ADNc-urile pot fi utilizate pentru a afla despre varietatea de ARNm dintr-o celulă și numărul de copii ale diferitelor ARNm prezente într-o celulă.

Dacă secvența care trebuie inserată pentru realizarea unei molecule de ADN recombinant nu poate fi izolată din ADN-ul genomic natural și nici ca ADNc, atunci poate fi utilizat ADN-ul sintetizat chimic. Sinteza chimică a oligonucleotidelor, adică fragmente de ADN cu lungimea de 15 până la 100 de nucleotide, poate fi dezvoltată prin tehnici extrem de automatizate.

Vectori pentru generarea de ADN recombinant:

Un vector trebuie să fie o moleculă mică capabilă de replicare independentă într-o celulă gazdă vie trebuie să aibă situsuri de restricţie convenabile care pot fi utilizate pentru inserarea ADN-ului de donat trebuie să permită identificarea şi recuperarea uşoară a moleculei recombinate. Vectorii sunt denumiți și vehicule de clonare sau repliconi. Sistemele de vectori de bază folosesc ca vectori plasmidă bacteriană sau ADN bacteriofag λ.

Plasmidele sunt molecule circulare mici de ADN care se reproduc independent de cromozomul bacterian. Moleculele plasmide sunt împărțite cu precizie la celulele fiice. Majoritatea plasmidelor există ca molecule de ADN dublu catenar.

Dacă ambele catene ale ADN-ului sunt cercuri intacte, molecula este descrisă ca un ADN cu cerc închis covalent (ADN CCC), dacă doar o catenă este intactă, atunci ADN cu cerc deschis (ADN OC). Nu toate plasmidele sunt circulare, unele există ca molecule liniare, cum ar fi cele din Streptomyces și Borrelia.

ADN-ul plasmidic are o lungime de 2 până la 4 kb și are o secvență care este originea replicării, care semnalează ADN polimeraza celulei gazdă pentru a replica molecula de ADN. Plasmidele au avantajul de a transporta gene de rezistență la antibiotice, astfel încât bacteriile purtătoare de fenotip de rezistență la antibiotice (plasmide) pot fi selectate.

Să presupunem că vrem să inserăm gena X în genomul uman într-un vector plasmid. Fragmentele de ADN uman sunt preparate prin tăierea cu o enzimă de restricție, de exemplu EcoRI, și aceeași enzimă de restricție este utilizată pentru a tăia ADN-ul plasmid (Fig. 23.3).

Capetele lipicioase vor avea capete complementare coezive monocatenare care s-ar hibridiza unele cu altele. Dintre numărul mare de fragmente produse din ADN-ul uman, doar o fracțiune foarte mică ar avea gena X.

Pentru a izola fragmentul cu gena X, plasmidele și digerele de restricție ADN uman sunt incubate împreună, împreună cu ADN ligaza. În timpul incubației, capetele lipicioase ale celor două tipuri de ADN se leagă de hidrogen între ele, capetele lor rupte sigilate de ligază pentru a forma molecule circulare de ADN recombinant.

Acum ar exista un număr mare de molecule de ADN recombinat diferite, fiecare conținând o plasmidă bacteriană cu un fragment de ADN uman. Pentru a izola acele plasmide care au gena umană X, trebuie făcut procesul de clonare a ADN-ului.

Vectorii bacteriofagi λ pot transporta inserții de ADN străine de până la 15 kb. Există două tipuri de bază de vectori fagi λ, vectori de inserție și vectori de înlocuire. ADN-ul fagului λ de tip sălbatic conține mai multe situsuri țintă pentru majoritatea endonucleazelor de restricție utilizate în mod obișnuit, prin urmare nu este adecvat ca vector.

Derivatives of the wild type phage have, therefore, been produced that either have a single target site at which foreign DNA can be inserted (insertional vectors), or have a pair of sites defining a fragment that can be removed and replaced by foreign DNA (replacement vectors).

Since phage DNA can accommodate only about 5% more than its normal complement of DNA, vectors are constructed with deletions to increase space within the genome. The shortest λ DNA molecules generally used are 25% deleted.

Foreign DNA is first ligated to phage DNA (Fig. 23.6). The recombinant molecules are then introduced into E. coli cells. DNA replication produces numerous phage progeny containing the foreign DNA fragment. This fragment can be isolated from the rest of phage DNA by restriction endonuclease digestion and gel electrophoresis.

Phagemids are plasmid vectors that carry the origin of replication from the genome of a single-stranded filamentous bacteriophage such as M13 or f1. Phagemids combine the best features of plasmids and single-stranded bacteriophage vectors.

They have two separate modes of replication: as a double-stranded DNA plasmid, and as a template to produce single-stranded copies of one of the phagemid strands. A phagemid can therefore, be used in the same way as a plasmid vector, or it can be used to produce filamentous bacteriophage particles that contain single-stranded copies of cloned segments of DNA.

Some studies require large fragments of foreign DNA to be inserted for which phage λ vectors are not suitable. Artificially prepared cosmid and yeast artificial chromosome (YAC) vectors are useful for this purpose. Foreign DNA up to 45 kb in length can be accommodated in cosmid vectors. Cosmid vectors can exist as plasmids but they also contain the complementary overhanging single-stranded ends of phage λ.

The presence of bacteriophage λ sequences in cosmid vectors permit packaging of the recombinant DNA into phage particles. The λ phage then introduces these large sized recombinant DNA molecules into recipient E. coli cells. Cosmids also contain origins of replication and genes for drug-resistance, so that they can replicate as plasmids in bacterial cells (Fig. 23.7).

However, because cosmid vectors lack the essential phage sequences necessary to form progeny phage particles, the recombinant DNA molecule depends on the plasmid sequences in the cosmid. Once inside the recipient E. coli cell, the recombinant cosmids form circular molecules that replicate extra-chromosomally in the same manner as plasmids.

The YAC vectors can accommodate still larger fragments, from a hundred to a thousand kilo-bases in length, that is one million base pairs. As the name implies, YACs are artificial versions of normal yeast chromosomes and replicate as chromosomes in yeast cells.

They contain all the elements of a yeast chromosome that are required for replication during S phase, one or more origins of replication, and segregation to daughter cells during mitosis, telomeres at the ends of the chromosome, as well as centromere to which spindle fibres can attach during chromosome separation.

In addition to these elements, YACs are constructed to contain the following: a gene whose encoded product allows those cells containing the YAC to be selected from those that lack the element the DNA fragment to be cloned. Yeasts can take up DNA from the medium, allowing YACs to be introduced into host yeast cells.

For introducing such large-sized DNA fragments (100 to 1000 kb in length), it is necessary to use restriction enzymes that recognise particularly long nucleotide sequences, 7 to 8 nucleotides containing CG di-nucleotides.

For example, the restriction enzyme NotI recognises the 8 nucleotide sequence GCGGCCGC, which cleaves mammalian DNA into fragments approximately one million base pairs long. These fragments can then be incorporated into YACs and cloned within host yeast cells. YAC technology has been used extensively in the Human Genome Project.

Bacterial artificial chromosomes (BACs) are based on the F factor of E. coli, and are among the most widely used vectors for very large DNA fragments of up to 300 kb. BAC vectors are 6 to 8 kb in length and include genes for essential functions such as replication (genes repE, and oriS), genes for regulating copy number (parA and parB), and genes for resistance to the antibiotic chloramphenicol.

Genomic DNA Libraries:

Collections of DNA fragments obtained by DNA cloning from the entire genome of an organism constitute a DNA library. Basically, the genomic library is a collection of bacteria, typically E. coli, each carrying a fragment of DNA from the genome. In one approach for making a DNA library, all the DNA from an organism is cut into fragments with a restriction enzyme.

Each segment is inserted into a different copy of the vector, thereby creating a collection of recombinant DNA molecules, which collectively represent the entire genome. These are then used to transform separate recipient bacterial cells, where they are amplified. The resulting collection of recombinant DNA-bearing bacteria is called a genomic library.

If the cloning vector used could accommodate an average insert size of 10 kb, and if the entire genome size is 100,000 kb, then we can expect 10,000 independent recombinant clones to represent the library of the whole genome.

In another approach, genomic DNA is cleaved by one or two restriction enzymes that recognize very short nucleotide sequences such as Sau3A (recognises GATC) and HaeIII (recognises GGCC). The enzymes are used in low concentration so that only a small percentage of target sites are actually cleaved.

One can expect that the small-sized tetra-nucleotide sequence would occur by chance at very high frequency, so that every portion of the DNA could yield fragments. After partial digestion of DNA, the fragments are separated by gel electrophoresis. Fragments about 20 kb in length are incorporated into phage λ heads from which about half a million plaques are generated, to ensure that every portion of the genome is represented (Fig. 23.8).

The important point in this method is that, due to low concentration of the restriction enzyme, the DNA is randomly fragmented, and each and every target site is not cleaved. The phage recombinants produced constitute a permanent collection of all the DNA sequences in the genome.

Whenever a particular sequence is required for isolation from the library, phage can be grown in bacteria. Each of the plaques produced would have originated from infection of a single recombinant phage, and can be screened for the presence of a particular sequence.

Positional Cloning or Chromosome Walking:

When there is no biological information about a gene, but its position can be mapped relative to other genes or markers, it is called positional cloning. The approach involves cloning a gene from its known closest markers. It requires only the mapped position of the gene. On the basis of this information, researchers can locate the nearest physical markers.

The closest linked marker is used to probe the genomic library. DNA cleaved randomly, as described above, generates overlapping fragments that can be used in the analysis of regions of the chromosome extending out in both directions from a particular sequence, the gene of interest. These extended regions or linked markers serve as starting points for the process of chromosome walking (Fig. 23.11).

Using a small sequence at the end of the linked marker, let us call it M1, as a labelled probe, find a clone in the library. The positive clone that is found will lead to identification of an adjacent gene segment which is now a second marker. Isolate the end sequence of second marker (M2) and use it to probe library and find another adjacent genomic segment which becomes the third marker.

Isolate end of third marker (M3) and use it to again probe for the next adjacent segment, and so on. Using the new fragments as labelled probes the process is repeated in successive screening steps, leading to isolation of more and more of the original DNA molecule. Because this process consists of steps, hence the name chromosome walking. This approach allows study of the organisation of linked sequences over a considerable length of the chromosome.

Chromosome jumping is a variation of chromosome walking using larger high capacity vectors to bridge un-clonable gaps. Whereas in chromosome walking each step is an overlapping DNA clone, in chromosome jumping each jump is from one chromosome location to another without “touching down” on the intervening DNA.

The gene for cystic fibrosis (CF), a severe autosomal recessive disorder in humans, was identified by chromosome walking and jumping. Cloning of the CF gene was a breakthrough for studying the biochemistry of the disorder (abnormal chloride channel function), for designing probes for prenatal diagnosis, and for potential treatment by somatic gene therapy or other means.

The method described above for making genomic DNA libraries can also be used for generating cDNA libraries. A cDNA library would contain hundreds of thousands of independent cDNA clones, representating collections of cDNA inserts. It may be recalled that cDNA is produced from the mRNA by using reverse transcriptase.

If a specific gene that is being actively transcribed in a particular tissue is desired for study, then it is considered useful to convert its mRNA into cDNA and make a cDNA library from that sample. A cDNA library represents a subset of the transcribed regions of the genome, hence the cDNA library would be smaller than a complete genomic library.

Screening DNA Library for a Specific Clone:

Any sequence for which a probe is available can be isolated from a recombinant library. Two types of probe can be used, those that recognise a specific DNA sequence and those that recognise part of a specific protein.

Probes for DNA Sequences:

A probe that consists of a single strand of DNA would be able to find and bind to other complementary denatured (single-stranded) DNAs in the library and specifically hybridise with it. The procedure for identification of a specific clone in a library is carried out in two steps. First, the recombinant phages are plated on E.coli, and each phage replicates to produce a plaque on the lawn of bacteria.

The pattern of plaques of the library on the petri dish are transferred to an absorbent nitrocellulose membrane by laying the membrane directly on the surface of the medium. When the membrane is peeled off, the plaques remain clinging to its surface, are lysed in situ and DNA is denatured. The membrane is incubated in a solution containing radiolabeled probe that is specific for the sequence being searched (Fig. 23.9).

Generally, the probe is a cloned piece of DNA that has a sequence homologous to that of the desired sequence. The single-stranded probe will bind to the DNA of the clone being searched. To determine the position of the positive clone, the position of the radioactive label can be found out by placing the membrane on the X-ray film.

Emissions from the decay of radioactive label will reduce the grains in X-ray film, seen as a dark spot after developing the film. The procedure is called autoradiography, the exposed film an autoradiogram. The probe used for finding sequence of interest in a library can also be labelled with a fluorescent dye.

In that case the membrane is exposed to a particular wavelength of light that would excite fluorescence and a photograph of the membrane is taken. The position of the spot of label (radioactive or fluorescent) indicates the location of the DNA segments containing sequences complementary to the probe.

Probes for Protein Products of Genes:

The protein product of a gene can be used to find the clone of its corresponding gene in a library. This can be accomplished if the amino acid sequence of the protein product is known, and the protein can be isolated in a purified form. Antibodies that bind specifically with unique protein molecules are used as probes to screen an expression library. These libraries are special cDNA libraries generated by using expression vectors.

An expression vector is a cloning vector containing the regulatory sequences necessary to allow transcription and translation of a cloned gene. Expression vector produces the protein encoded by a cloned gene in the transformed host. Expression vectors are essentially derivatives of a phage or plasmid cloning vector that has been modified by addition of a promoter specific to the host.

The cloned gene in such an expression vector is placed under the control of the promoter that ensures transcription of the cloned gene in the appropriate host cell. Expression vectors designed in this manner can yield high levels of recombinant protein in host cells that can be purified for structural and functional characterisation.

To make the cDNA library, the cDNA to be cloned is inserted into the special phage vector downstream from the bacterial promoter, in the correct triplet reading frame which ensures that the foreign DNA is transcribed and translated during infection.

Phages that have incorporated the gene of interest form plaques that contain the protein encoded by that gene. A membrane is laid over the surface of the medium and removed with some cells of each colony attached to the membrane.

The locations of these cells are identical to their positions in the original petri dish (replica plating). The membrane is dried, and immersed in a solution containing antibody. The antibody will bind only to the protein product of the gene of interest.

For detection of positive clones, a second antibody is prepared that is specifically against the bound antibody and labeled radioactively or with a fluorochrome. The plaque having the gene of interest is thus located on the replica plate through detection of bound antibody.

It is frequently considered useful to express high levels of a cloned gene in eukaryotic cells rather than in bacteria. The reason is that post-translational modifications of the protein (such as addition of carbohydrates or lipids) that take place in eukaryotic cells would take place normally.

One system frequently used for protein expression in eukaryotic cells involves infection of insect cells by baculovirus vectors, which yield very high levels of protein product of a gene. High levels of protein expression can also be achieved by using appropriate vectors in mammalian cells.


Mulțumiri

We thank Drs. E. D. Earle, A. Frary, S. R. McCouch, J. C. Steffens, and J. Xiao for critical reading of the manuscript, and H. Ku for technical assistance. This work was supported in part by grants from the National Research Initiative Cooperative Grants Program, U.S. Department of Agriculture Plant Genome Program and by the Binational Agricultural Research and Development Fund. K.B.A. was supported in part by the Cornell National Science Foundation/Department of Energy/Department of Agriculture Plant Science Center.