Informație

Genotip -/- vs delta/delta

Genotip -/- vs delta/delta



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

În https://doi.org/10.1016/j.neuron.2018.07.033, Pan și colab. utilizați denumirea TMC1^delta/delta pentru a descrie o tulpină de șoarece lipsită de o genă TMC1 funcțională. Dacă există diferența dintre superscriptul delta/delta și superscriptul -/- în acest context?


Delta se referă la a alela mutantă, în acest caz un mutant punctual de cisteină. -/- se referă la un homozigot alela nulă, în acest caz un knockout.


O investigație a relației dintre TMPRSS6 expresia genelor, variantele genetice și constatările clinice în cancerul de sân

Cancerul de sân este unul dintre cele mai frecvente tipuri de cancer în rândul femeilor din întreaga lume. The TMPRSS6 Gena (Transmembrane Serine Protease 6) codifică matriptaza-2, care joacă un rol important în hemostaza fierului ca regulator al hepcidinei și poate juca un rol în susceptibilitatea cancerului de sân. În acest studiu, am examinat nivelurile de expresie ale TMPRSS6 gena în țesuturile sănătoase și țesuturile tumorale ale pacienților cu cancer de sân și relația dintre aceste niveluri și constatările patologice. Relația dintre TMPRSS6 polimorfisme (rs733655, rs5756506, rs2413450, rs855791, rs2235324, rs4820268) și parametrii hematologici ai pacienților. Studiul de expresie genică a cuprins 47 de pacienți cu cancer de sân, iar studiul de polimorfism genic a constat din 181 de pacienți cu cancer de sân și 100 de martori sănătoși. Analiza expresiei genelor a fost efectuată prin qRT-PCR. Genotiparea TMPRSS6 polimorfismele au fost efectuate prin RT-PCR. TMPRSS6 Nivelurile de expresie a genelor în țesuturile tumorale s-au dovedit a fi de 1,88 ori mai mari decât nivelurile de expresie în țesuturile de control. Am examinat relația dintre TMPRSS6 nivelurile expresiei genelor și datele patologice, s-a găsit o relație semnificativă statistic între receptorul de estrogen al pacientului (ER) și constatările HER2 și TMPRSS6 expresia genei (respectiv p = 0,02, p = 0,002). Când relația dintre TMPRSS6 a fost investigată distribuția genotipurilor legate de polimorfismele genelor și constatările hematologice, a fost identificată o relație semnificativă între parametrul concentrației medii a hemoglobinei corpusculare (MCHC) și polimorfismul doar al rs733655. Conform constatărilor noastre, creșterea în TMPRSS6 expresia genelor în țesuturile canceroase arată că matriptaza-2 poate fi eficientă în procesul de cancer. Prin urmare TMPRSS6 polimorfismele genelor pot afecta procesul bolii prin afectarea parametrilor sanguini ai pacienților.


Fundal

Virusul hepatitei delta (HDV) este un mic virus ARN defect, cu un genom cu catenă negativă. Este nevoie ca un virus helper, virusul hepatitei B (HBV), să furnizeze proteine ​​de înveliș (HBsAgs) pentru a completa asamblarea și secreția virionului [1-3]. Genomul HDV are o lungime de aproximativ 1.700 de nucleotide și are o formă circulară, pare să formeze o structură asemănătoare tijei neramificate datorită unui grad ridicat de împerechere de baze complementare intramoleculare [4,5]. Secvența genomului HDV este împărțită într-o secvență asemănătoare viroizului și o secvență care codifică proteine ​​[1,6]. S-a emis ipoteza că HDV a rezultat din recombinarea ARN între o secvență viroidă și un ARNm celular care codifică o proteină DIPA (delta interacting protein) [6,7]. Analiza secvențelor HDV din întreaga lume a dezvăluit că cele din Africa au cea mai mare diversitate, ceea ce sugerează că primul HDV ar fi putut apărea în Africa [8,9]. După izolarea suplimentară a noilor secvențe HDV din Africa, clasificarea HDV a fost schimbată de la una care include genotipurile I la III într-una care implică cladele 1 până la 8 [8].

În ultimele trei decenii, studiile intensive de biologie moleculară au dezvăluit în mare măsură funcțiile și rolurile proteinelor codificate HDV în replicare. În timpul replicării HDV, secvența de codificare este tradusă în două antigene delta (HDAgs), o formă mică și una mare (SDAg și LDAg), din același cadru de citire aceștia au o lungime de 195 și respectiv 214 aminoacizi [10,11] . Producția de LDAg se face printr-un proces cunoscut sub numele de editare a ARN, care este efectuat de ADAR celular [12,13], care convertește codonul stop chihlimbar (UAG) al SDAg într-un codon triptofan (UGG), rezultând un plus de 19 sau 20 de amino. acizi la capătul C-terminal al LDAg [14]. SDAg este esențial pentru replicarea HDV, în timp ce LDAg antagonizează funcția SDAg și este necesar să interacționeze cu HBsAg în timpul asamblării și maturării virionului [15,16]. Există o cutie CaaX (211 CRPQ 214, 211 CTPQ 214 și 211 CTQQ 214 în diferite genotipuri HDV, vezi Fig. ​ Fig.1A) 1A) la capătul C al LDAg, care acționează ca un semnal al izoprenilare. Mutația semnalului de izoprenilare a LDAg duce la o defecțiune a asamblarii și secreției virionilor [17-19].

Caracteristicile secvențelor de aminoacizi LDAg ale HDV și oligonucleotidelor sintetice care codifică peptida de 13 aminoacizi a LDAg. (A) Alinierea aminoacizilor (în simboluri cu o literă) a lungimii complete a LDAg din cele trei genotipuri. Genotipul I este de la tulpina americană (numărul de acces <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"M28267","term_id":"602445","term_text":"M28267">> M28267), genotipul II din tulpina Taiwan-3 (număr de acces <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"U19598","term_id":"1480437","term_text":" U19598">> U19598) și genotipul III din tulpina Peru (numărul de acces <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"L22063","term_id":"410182","term_text ":"L22063">> L22063). Domeniile presupuse de legare la clatrină sunt afișate prin casete dreptunghiulare, iar ultimii 19 sau 20 de aminoacizi ai LDAg sunt evidențiați cu litere aldine. Aminoacizii de consens pentru modificarea post-translațională sunt indicați după cum urmează: Ac (acetilare) la aminoacidul 72, Pi (fosforilarea) la pozițiile 2, 123 și 177 și Py (izoprenilare) la poziția 211. Pozițiile aminoacizilor sunt indicate prin cifre. (B) Două oligonucleotide complementare au fost proiectate pentru exprimarea secvențelor scurte de aminoacizi corespunzătoare (așa cum este indicat în simbolurile cu o literă de deasupra oligonucletidelor) ale LDAg. Capăturile 5’ și 3’ ale oligonucleotidelor au fost proiectate să includă situsurile de restricție EcoRI și Saleu, respectiv. Site-ul de restricție imediat lângă Saleu sunt EcoRV, care a fost conceput special pentru a permite selecția rapidă a clonelor.

În plus față de secvența semnalului de izoprenilare, a fost identificat și un semnal de export nuclear (NES) la capătul C-terminal al LDAg [20]. În cadrul secvenței comune de 195 de aminoacizi a SDAg și LDAg, au fost identificate două motive presupuse de leucină-fermoar, un motiv de legare a ARN și două semnale de localizare nucleară [21-24]. Atât SDAg cât și LDAg sunt fosfoprotien cu un grad diferit de modificare [25]. După ce au fost fie fosforilați de PKC [26], CKII [18,26], PKR [27] sau ERK1/2 [28], ele afectează replicarea HDV sau sunt țintite spre petele SC-35 [18,26-28] . S-a demonstrat de asemenea că atât acetilarea HDAg la lizină-72, cât și metilarea SDAg la arginina-13 influențează replicarea HDV [29-31]. Conservarea acestor situsuri post-translaționale ale HDAg printre toate genotipurile HDV cunoscute sugerează că enzimele celulare responsabile pentru modificările post-translaționale ale HDAg sunt cel puțin parțiale, dacă nu toate, implicate în replicarea HDV.

Co-infecția și suprainfecția HDV cu HBV cauzează de obicei o boală hepatică mai severă decât o singură infecție cu HBV [32]. Diferitele genotipuri HDV prezintă distribuții geografice diferite și sunt asociate cu diferite modele de boală [7,33]. Genotipul I de HDV este distribuit în întreaga lume și a fost legat de un spectru larg de boli, variind de la hepatita fulminantă până la boala hepatică cronică asimptomatică. Genotipul II se găsește în principal în Asia, inclusiv în Japonia, Taiwan și Siberia și pare să dea naștere unei boli mai puțin severe decât genotipul I. Genotipul III se găsește în principal în partea de nord a Americii de Sud și produce o formă severă de hepatită fulminantă. 33]. Mecanismul patogenezei HDV pare să rezulte din interacțiuni complicate între HDV, HBV și/sau factorii gazdă și nu este complet înțeles.

Două studii recente au indicat că LDAg mai degrabă decât SDAg ar putea juca un rol semnificativ în patogenia HDV [34,35]. Un studiu a demonstrat o legare directă a LDAg la Smad-3, care modulează semnalizarea TGF-β pentru a activa expresia inhibitorului-1 activator al plasminogenului și cascadele de semnal induse de c-Jun, aceasta ar părea să conducă la ciroză hepatică [35]. Celălalt studiu a demonstrat că forma citoplasmatică a LDAg se leagă de lanțul greu al clatrinei (CHC) și a sugerat în continuare că această interacțiune LDAg-CHC este necesară pentru asamblarea HDV. În plus, interacțiunea LDAg-CHC ar părea să interfereze cu endocitoza și exocitoza mediate de clatrină, care ar putea duce în cele din urmă la deteriorarea hepatocitelor [34]. Cu toate acestea, cutia de clatrină (199 LFPAD 203) identificată în LDAg al genotipului I nu este conservată în aceeași poziție în genotipul II și III (Fig. ​ (Fig. 1A). 1A). Acest studiu a fost realizat cu scopul de a verifica dacă activitatea de legare a clatrinei este conservată în cele trei genotipuri majore de LDAg.


Clasificare

HDV a fost recunoscut de Comitetul Internațional pentru Taxonomia Virușilor (ICTV), ca o nouă specie de virus de la vertebrate, singurul reprezentant al Deltaviridae familie, Deltavirus genul [17]. Deși HDV este destul de similar din punct de vedere structural și în modul său de replicare cu fitopatogeni, viroizi și virusoizi, este suficient de diferit pentru a fi atribuit unui gen separat. HDV este în mod obișnuit clasificat ca un virus satelit al HBV, deoarece se bazează pe principiul biologic conform căruia HDV este incapabil de infectare în absența HBV [14, 18].


Discuţie

Studii recente din laboratorul nostru 10,26,27 și altele 28,29, au legat expresia SGTA modificată de proliferarea celulelor tumorale și/sau prognosticul cancerului. Acest lucru nu este surprinzător, având în vedere că SGTA a fost implicat în ciclul celular și apoptoză 5,45,46 și în co-chaperoning moleculară a numeroși clienți de proteine ​​pentru a asigura plierea, compartimentarea și/sau traficul lor corecte 1 . Fiecare dintre aceste procese, dacă este defect, are potențialul de a contribui la tumorigeneză. În afară de rolul în patofiziologia mai multor stări de boală 10,18,26,27,28,29,30,31, se știe puțin despre rolul fiziologic normal al SGTA.

In vitro, SGTA knockdown-ul în celulele renale (NBE) 34 , cancerul de col uterin (HeLa) 5 și cancerul de prostată (C4-2B) 26 reduce proliferarea și viabilitatea datorită mitozei afectate 5,34 , în asociere cu citokineza defectuoasă 34 și finalizarea eșuată a alinierii cromozomiale 5. Din cauza asta şi a faptului că Sgta este exprimată omniprezent și sunt documentate o gamă largă de interacțiuni ale proteinelor cu SGTA1, am emis ipoteza că Sgta ar fi vital pentru viață și că ablația sa la șoareci s-ar dovedi letală. Dimpotrivă, însă, am demonstrat aici că viabil Sgta −/− animalele au fost produse din reproducere Sgta-șoarecii deficienți, așa cum este cazul în knockout / down al ortologilor SGTA conservați 32,33 în C. elegans, D. melanogaster și S. cerevisiae 14,15,33. Tendința pe care am observat-o pentru un număr redus de Sgta -/- descendenții în comparație cu moștenirea mendeliană așteptată este în concordanță cu cea a mutanților pentru proteina similară care conține TPR, FKBP52 (Fkbp4) 47,48 . Având în vedere dovezi considerabile că SGTA este implicat în inserția proteinei ancorate în coadă (TA) 16,22,49 și deoarece biogeneza TA este esențială pentru dezvoltarea timpurie și ablația genetică care perturbă acest proces a fost legată de letalitatea embrionară 50,51, este posibil ca procesarea aberantă a proteinei TA poate contribui la randamentul redus al animalelor mutante. Cauza mortalității prenatale rămâne nedeterminată, cu toate acestea, în cazul FKBP52 -/-, fondul genetic a contribuit la penetrarea acțiunii FKBP52. Adică, generarea independentă de șoareci FKBP52 -/- pe fundalurile C57BL/6J 47 și 129SvEv 48 a produs letalitate la 50% și, respectiv, 30% din embrioni din împerecheri heterozigote. Mai mult, încrucișarea mutanților FKBP52-129SvEv cu tulpina C57BL/6 a amplificat letalitatea la aproape 100% 52, evidențiind avertismentul că genetica de bază a unui model mutant influențează fenotipul prezentat. Fie că un fenotip mai pronunțat de Sgta −/− ar fi fost observat dacă ar fi fost caracterizat pe o tulpină de fundal diferită de șoareci, rămâne de determinat. Spre deosebire de FKBP52 -/-, ștergerea proteinei similare, FKBP51 (Fkbp5), nu a avut niciun efect asupra supraviețuirii timpurii și nu a provocat nicio modificare aparentă a fenotipului la șoareci 53 , deși FKBP51 knockout (fondul C57BL/6J) în combinație cu ștergerea FKPB52 (fondul 129SvEv) a provocat letalitate completă în viața embrionară timpurie 54 . Acest lucru evidențiază faptul că există redundanță în sistemul de co-însoțire. În concordanță cu această noțiune, bărbații FKBP52 −/− au dezvoltat testicule normale, dar au prezentat hipospadias penian 53 . Expresia crescută a mRNA FKBP51 și a proteinei în testicul FKBP52 -/-, dar nu și în penis, poate preveni în mod activ disgeneza testiculului. În contextul homozigotului Sgta ablație, este posibil să intervină o proteină(e) care conține TPR asemănătoare din punct de vedere structural, îndeplinind rolul SGTA în absența acestuia. A crescut Dnajc7 (TPR2) ARNm în ovar poate servi acestui scop, totuși expresia ARNm a 7 proteine ​​care conțin TPR a fost neschimbată în prostată, testicul și glanda mamară. Dacă modificările în expresia proteinei și/sau localizarea proteinelor care conțin TPR compensează pierderea SGTA în fiziologia normală merită investigații suplimentare și ar putea explica de ce doar o ușoară Sgta-fenotipul nul a fost observat în studiul curent. Un fenotip mai evident poate fi indus prin aplicarea unui factor de stres Sgta-mutanții nuli, deoarece co-chaperoni sunt esențiali pentru plierea/replierea optimă și traficul de proteine ​​ale clientului afectate de stres 55 . În drojdie nulă pentru ortolog SGTA, Sgt-2, doi factori de stres celulari distincți au redus viabilitatea drojdiei 15 , creșterea și formarea de colonii 20 în comparație cu drojdia de tip sălbatic. Acest lucru susține în continuare că SGTA este esențială în anumite condiții celulare și este probabil ca pierderea sa să fie compensată pentru a preveni disfuncția atunci când apar aceste condiții.

În Sgta-șoarecii nuli, dimensiunea corporală redusă cuprinzând o scădere proporțională a greutății corporale și a lungimii a fost cea mai evidentă modificare fenotipică observată și a fost limitată la mutanții homozigoți. Alimentația inadecvată poate duce la pipernicie Sgta −/− creștere, mai ales că diferențele de greutate au coincis cu o fază în care dependența de alăptare este diminuată. Acesta pare să nu fie cazul, deoarece eficiența furajului a rămas neschimbată în Sgta -/- șoareci, deși capacitatea lor de a absorbi și de a utiliza nutrienți din alimentele consumate rămâne necunoscută. Dacă Sgta ablația a determinat schimbări în semnalizarea mediatorilor de creștere hormonali a justificat investigații, mai ales că miostatina 23 și GHR 12 sunt proteine ​​client SGTA. Dezvoltarea defectuoasă și masa alterată a mușchilor scheletici ar fi prezisă dacă Sgta deficiența a influențat maturizarea și semnalizarea miostatinei, un regulator negativ al masei musculare 56, totuși nici patologia musculară, nici masa nu au fost afectate. GH, care acționează prin GHR, este esențială pentru creșterea somatică, diferențierea celulară 57 și producția paracrină de IGF-1 36 . Semnalizarea aberantă a GHR și rezistența la GH determină încetarea producției de IGF-1 și încetinirea creșterii. În ciuda faptului că atât GH, cât și GHR sunt exprimate în mod normal în embriogeneza timpurie, modificările de creștere datorate semnalizării GH modificate sunt observate numai de la d14-21 postnatal la șoareci 36,58. Piticizarea la 3 săptămâni la șoarecii GHR-null este asociată cu GH crescut și niveluri scăzute de IGF-1 în circulație 36,58. De asemenea, scăderea IGF-1R funcțional la șoareci (IGF-1Rneo) duce la oprirea creșterii de la vârsta de 4-9 săptămâni, corespunzând unui platou în dimensiune, care se menține 59 . Analog cu deficitul GHR/IGF-1R 58,59, Sgta- mutanții nuli au apărut ca fiind fizic mai mici decât WT la

6 săptămâni, moment în care femelele reprezentau 93% și masculii 87% din greutatea animalelor WT. Similar cu GH/GHR, SGTA este detectat prenatal în embrion, dar funcționalitatea sa în timpul dezvoltării timpurii nu este cunoscută. Având în vedere interacțiunea sa cu motivul de endocitoză dependent de ubiquitină al precursorului și al GHR matur, s-a speculat că SGTA previne interacțiunea GHR cu mașinile ubiquitinei, în timp ce este transportat de la reticulul endoplasmatic, unde rezidă precursorul GHR, la membrana celulară, unde funcționează GHR matur57. . Traficul aberant de GHR/IGF-1R și degradarea GHR potențial mediată de ubiquitină ar putea fi declanșate de Sgta ablatie. Emitem ipoteza că acest lucru poate contribui la încetinirea creșterii observată în Sgta −/− șoareci, cu condiția ca pierderea SGTA să nu fie compensată de un alt co-chaperon. Niveluri scăzute de ARNm din ser și țesut IGF-1 în Sgta -/- animalele pot reflecta semnalizare defectuoasă a GHR, în timp ce creșterea GH seric și creșterea GHR în ovar în Sgta -/- poate indica o compensare pentru semnalizarea deficitară GH/IGF-1, totuși, aceasta din urmă necesită confirmare la nivel de proteine.

Spre deosebire de deleția homozigotă FKBP52 care a făcut șoarecii sterili 53 , Sgta deficiența a provocat doar subfertilitate ușoară în acest studiu. Disgeneza în organele sexuale dependente de androgeni/dezvoltarea AR a fost cauza principală a reproducerii defectuoase FKBP52 -/- masculine 53 , în timp ce eșecul implantării uterine dependente de receptorul de progesteron a conferit sterilitate la femeile FKBP52 -/- 48 . Măsuri surogat crescute (AGD, dimensiunea penisului și glandei prepuțiale) pentru semnalizarea androgenilor in uter, atât în ​​perioada prepuberală cât și la pubertate, integral sau parțial Sgta deficiența sugerează o semnalizare AR alterată și/sau hiperandrogenizare. Cu toate acestea, alte câteva organe dependente de androgeni nu au fost afectate de Sgta ablația la bărbați și femele, așa cum a fost expresia ARNm Ar și gene care răspund la AR. Indiferent, un efect de Sgta ablația pe producția de steroizi sexuali nu poate fi exclusă.În plus față de reglementarea AR, SGTA prezintă, de asemenea, specificitate de reglementare pentru receptorii de progesteron și glucocorticoizi 1,60, astfel încât influența ablației SGTA asupra proceselor biologice controlate de semnalizarea progesteronului și glucocorticoizilor justifică, de asemenea, investigații viitoare. Imunoreactivitate nucleară AR redusă fără o creștere concomitentă a citoplasmei în Sgta +/− prostată, sugerează Sgta, ca și alte proteine ​​care conțin TPR TPR2/Dnajc7 și CHIP/Stub1, jucând un rol în stabilizarea și/sau degradarea AR 61 . Acesta pare să fie cazul pentru GHR 12 , unde stabilizarea sa nu este compensată într-un mediu parțial. Sgta deficienta.

Pe scurt, acest studiu a oferit o primă privire intrigantă asupra rolului cu mai multe fațete al SGTA in vivo. Ablația completă, dar nu parțială, a SGTA a conferit subfertilitate și a limitat viabilitatea și creșterea descendenților. Interacțiunea complexă a co-chaperonelor moleculare și importanța redundantei în rolurile lor fiziologice, în special în maturizarea și semnalizarea receptorilor hormonali, este evidențiată de descoperirile actuale. Acest Sgta-modelul nul este susceptibil de a studia în continuare mai multe tulburări clinice, inclusiv boli dependente de hormoni și boli β-amiloide, în care a fost implicat un rol pentru SGTA.


3. REZULTATE

3.1 Mușchiul scheletic TRα1 definește compoziția de tip fibre în mușchii cu contracție lentă, dar este în mare parte dezpensată pentru capacitatea de exercițiu și homeostazia energetică

Pentru a studia rolul semnalizării receptorilor de hormoni tiroidieni în mușchiul scheletic asupra metabolismului energetic al întregului corp, am generat un TRα specific mușchilor scheletici.1 model de șoarece cu pierdere a funcției (TRα HSACre) (Figura S1A-C). Nu au fost observate diferențe în ceea ce privește greutatea corporală, grăsimea și masa slabă sau toleranța la glucoză între genotipuri (Figura 1B-D). Capacitatea de alergare exhaustivă pe banda de alergare și alergarea voluntară pe roți, măsurate timp de 6 săptămâni, nu au fost, de asemenea, diferite între genotipuri (Figura 1E, F).

O altă cohortă de animale a fost hrănită cu HFD timp de 22 de săptămâni. Am observat o traiectorie de creștere în greutate mai lentă pentru șoarecii TRα HSACre în comparație cu șoarecii WT, ca răspuns la provocarea alimentară (Figura 1H), care nu a putut fi explicată prin diferențele de aport de alimente (Figura 1I). După 18 săptămâni de expunere la HFD, șoarecii TRα HSACre au cântărit la fel ca și șoarecii WT. Nu s-au găsit diferențe de genotip în compoziția corpului, toleranța la glucoză sau temperatura corpului ca răspuns la o provocare moderată la rece (14°C timp de 4 ore) la șoarecii hrăniți cu HFD cu greutate (Figura 1J-L). În special, șoarecii TRα HSACre au prezentat o creștere a fibrelor de tip I și o scădere a fibrelor de tip IIA în mușchiul soleus cu contracție lentă (SOL) în comparație cu șoarecii WT (Figura 1N). Această diferență, totuși, nu a fost prezentă în mușchiul extensor lung al degetelor (EDL) cu contracție rapidă (Figura 1O). Comutarea de tip fibre în mușchiul cu contracție lentă a fost însoțită de o creștere (72%) a factorului de diferențiere a creșterii circulante 15 (GDF15), un marker sistemic al stresului celular și mitocondrial (Figura 1P).

3,2 TRα1 în mușchiul scheletic este necesar pentru consumul de energie indus de T3, dar este dispensabil pentru creșterea indusă de T3 a temperaturii corpului

Pentru a studia importanța mușchilor scheletici TRα1 pe cheltuiala energetică indusă de hormoni tiroidieni, cinci cohorte diferite de șoareci TRα HSACre și WT littermate au fost tratate zilnic fie timp de 5, 7 sau 14 zile cu s.c. injecții de T3 sau vehicul. Concentrațiile plasmatice ale T3 și T4 au fost similare între controalele slabe tratate cu vehicul și DIO TRα HSACre și WT (Figura 2A-C, F-H). După cum era de așteptat, tratamentul cu T3 a dus la creșterea concentrațiilor plasmatice de T3, dar a scăzut T4 după 7 zile de tratament cu T3 (100 nmol/kg) și fără diferențe între genotipuri (Figura 2B, C, G, H). Calorimetria indirectă a evidențiat o creștere a consumului de energie ca răspuns la tratamentul cu T3 la șoarecii WT slabi și obezi (Figura 2D, E, I, J, Figura S2A, B). Tratamentul cu T3 nu a crescut semnificativ cheltuiala de energie la șoarecii slabi TRα HSACre (Figura 2D, E). La șoarecii DIO WT efectul T3 asupra ratei metabolice a fost mai pronunțat decât la șoarecii WT slabi, sugerând că efectul termogenic al T3 este legat de masa grăsime. În acest context, este posibil ca absența TRα funcțională1 în mușchi va avea un impact mai mic asupra consumului de energie la șoarecii DIO, decât la un șoarece slab. În consecință, în timpul zilei, creșterea mediată de T3 a ratei metabolice a fost similară la șoarecii WT și TRα HSACre, în timp ce în timpul fazei întunecate, creșterea mediată de T3 a cheltuielilor de energie a fost observată doar la șoarecii WT (Figura 2I, J). Creșterea consecutivă a cheltuielilor de energie stimulată de T3 la șoarecii DIO este similară cu ceea ce am observat anterior în acest model alimentar. 11

Pentru a descifra efectul specific muscular al T3 asupra respirației mitocondriale la șoarecii WT și TRα HSACre, mușchii cu contracție lentă (SOL) și rapid (EDL) au fost excizați de la șoarecii tratați cu T3 și au fost evaluați pentru capacitatea respiratorie mitocondrială (Figura 2K, L). În SOL, respirația de scurgere (starea 2) a fost similară între genotipuri, dar, în contextul tratamentului T3, respirația a crescut doar la șoarecii WT, oglindind datele calorimetriei indirecte ale întregului corp (Figura 2K). Capacitatea de fosforilare oxidativă cu substratul legat de complexul I a relevat o respirație afectată în SOL în starea nestimulată la șoarecii TRα HSACre în comparație cu șoarecii WT. Evaluarea respirației legate de complexul I și complexul I + II a identificat că stimularea T3 în TRα HSACre a crescut respirația într-o măsură similară cu cea a șoarecilor WT. Nu au fost observate diferențe în respirația mitocondrială în EDL (Figura 2L).

Mecanismele prin care hormonii tiroidieni cresc temperatura corpului sunt evazive. Pentru a testa un posibil rol al mușchilor TRα1 în creșterea temperaturii corporale mediată de T3, am măsurat temperatura corpului central la șoareci WT și TRα HSACre tratați zilnic fie cu T3, fie cu vehicul timp de 7 zile. În acord cu studiile anterioare, tratamentul cu T3 a crescut semnificativ temperatura corpului la șoarecii WT atât la temperatura camerei ambiante (22 ° C), cât și în condiții termoneutre (30 ° C) (Figura 2M, N). În special, șoarecii TRα HSACre tratați cu T3 au răspuns similar șoarecilor WT tratați cu T3 în ceea ce privește creșterea temperaturii corpului atât la 22 ° C, cât și la 30 ° C (Figura 2M, N). În plus, nu au fost observate diferențe compensatorii în greutatea BAT sau expresia proteinei UCP1 în BAT și iWAT la șoarecii DIO TRα HSACre în raport cu șoarecii DIO WT ca răspuns la 14 zile de tratament cu T3 sau vehicul (Figura S2C-G). Împreună, aceste constatări sugerează că 1) semnalizarea hormonilor tiroidieni în mușchiul scheletic nu contribuie la pirexia indusă de T3 și 2) creșterea mediată de hormoni tiroidieni a cheltuielilor de energie și pirexia indusă de T3 nu sunt procese în întregime interconectate.

3.3 Căile structurale și metabolice domină transcriptomul ca răspuns la activarea TRα mediată de T31 în muşchiul soleus

Pentru a diseca bazele mecaniciste ale inducției legate de mușchi în cheltuiala energetică a întregului corp ca răspuns la tratamentul cu T3, am efectuat secvențierea ARN (ARN-seq) a WT și TRα HSACre SOL atât din condițiile tratate, cât și din cele netratate. Aceste analize au arătat că 788 de transcrieri au fost exprimate diferențiat între WT SOL și TRα HSACre SOL (Figura 3A). În condiții nestimulate, mai multe gene legate de compoziția tipului de fibre și morfologia mușchilor au fost exprimate diferențial la șoarecii TRα HSACre în comparație cu șoarecii WT (Figura 3A). În plus, genele asociate cu termogeneza musculară, cum ar fi sarcolipina și MSS51, au fost diferite între genotipuri. Ca răspuns la tratamentul cu T3, profilarea expresiei a identificat o îmbogățire a genelor cu termenii de ontologie „biosinteza NADP” și „metabolismul aminoacizilor cu lanț ramificat (BCAA)” care urmează să fie reglate diferențiat la șoarecii WT în raport cu șoarecii TRα HSACre (Figura 3B). Expresia relativă a transcriptelor de top care răspund la T3 în SOL de la șoarecii WT în comparație cu șoarecii TRα HSACre a dezvăluit o distincție clară în reglarea transcripțională (Figura 3C, Figura S3A). În special, un răspuns transcripțional clar în SOL la administrarea sistemică de T3 a rămas în ciuda mutației TRα.1 în muşchi. Acest lucru ar putea reflecta efectele sistemice ale T3 care introduc ulterior efecte secundare asupra transcriptomului muscular. Evaluarea genelor cheie implicate în termogeneza musculară (Figura 3D) și morfologia tipului fibrei musculare (Figura 3E) a demonstrat expresia diferențială între șoarecii WT și șoarecii TRα HSACre atât în ​​condiții nestimulate, cât și induse de T3. În special, creșterea nestimulată a ARNm de sarcolipină la șoarecii TRα HSACre a fost, de asemenea, evidentă în mușchii EDL, gastrocnemius și cvadriceps (Figura S3B). Markerii asociați cu termogeneza BAT și semnalizarea hormonilor tiroidieni în BAT au fost examinați pentru a determina specificitatea TRα1-modificări transcripționale musculare legate (Figura 3E). În timp ce T3 are un impact clar asupra transcrierilor implicate în termogeneza BAT, nu a fost observată nicio expresie diferențială între șoarecii TRα HSACre față de șoarecii WT, ceea ce implică faptul că mutația specifică mușchilor nu are nicio „reversare” sistemică la programele metabolice în alte țesuturi termogenice (Figura 3F) .


Analiza variației genetice în CD40 și CD40L: Relația cu expresia relativă a ARNm și proteinele solubile în sindromul coronarian acut

1 Instituto de Investigación en Ciencias Biomédicas (IICB), Centro Universitario de Ciencias de la Salud (CUCS), Universidad de Guadalajara (UdeG), Sierra Mojada #950, Colonia Independencia, C.P, 44340 Guadalajara, Jalisco, Mexic

2 Doctorado en Ciencias Biomédicas, Centro Universitario de Ciencias de la Salud (CUCS), Universidad de Guadalajara (UdeG), Guadalajara, Jalisco, Mexic

3 Doctorado en Genética Humana, Centro Universitario de Ciencias de la Salud (CUCS), Universidad de Guadalajara (UdeG), Guadalajara, Jalisco, Mexic

4 Specialidad en Cardiología, Unidad Médica de Alta Especialidad, Centro Médico Nacional de Occidente (CMNO), Departamento de Cardiología, Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS), Guadalajara, Jalisco, Mexic

Abstract

Sindromul coronarian acut (SCA) poate fi declanșat de prezența factorilor inflamatori care promovează activarea celulelor imune de către molecule costimulatoare precum CD40 și ligandul său CD40L. Factorii de mediu și genetici sunt implicați în etiologia SCA. Scopul acestui studiu a fost de a explora expresia genelor și proteinelor asociate cu CD40 și CD40L variante genetice la pacienții cu SCA din populația vestică a Mexicului. Au fost recrutați un total de 620 de persoane din vestul Mexicului: au fost evaluați 320 de pacienți cu SCA și 300 de persoane fără antecedente de cardiopatie ischemică. Genotipul a fost determinat folosind testele de genotipizare TaqMan SNP. CD40 și CD40L expresiile la nivel de ARNm au fost cuantificate folosind testele de expresie genetică TaqMan. Izoformele de proteine ​​solubile au fost măsurate prin test imunosorbent legat de enzime. Nu am găsit dovezi de asociere între CD40 (rs1883832, rs4810485 și rs11086998) și CD40L (rs3092952 și rs3092920) variante genetice și susceptibilitatea la SCA, deși rs1883832 și rs4810485 au fost asociate semnificativ cu niveluri plasmatice ridicate de sCD40. Nivelurile plasmatice ale sCD40L pot fi afectate de sex și de spectrul clinic al sindromului coronarian acut. Rezultatele noastre nu sugerează un rol funcțional al CD40 și CD40L variante genetice în SCA. Cu toate acestea, ele ar putea reflecta procesul inflamator și activarea trombocitelor la pacienții cu SCA, chiar și atunci când sunt sub terapie farmacologică. Datorită rolurilor importante ale sistemului CD40-CD40L în patogeneza SCA, sunt necesare studii longitudinale pentru a determina dacă nivelurile solubile de CD40 și CD40L ar putea fi markeri utili din punct de vedere clinic ai unui eveniment cardiovascular recurent după un SCA.

1. Introducere

Boala cardiovasculară este principala cauză de deces la nivel mondial [1], în special sindromul coronarian acut (SCA) caracterizat prin reducerea acută a fluxului sanguin coronarian și ischemie sau necroză miocardică. Se disting trei entități clinice: infarctul miocardic cu supradenivelare a segmentului ST (STEMI), infarctul miocardic fără supradenivelare a segmentului ST (NSTEMI) și angina instabilă (UA), cu o etiologie comună, totuși, pot avea rezultate diferite [2]. Din acest motiv, prognosticul precoce și stratificarea riscului reprezintă prima linie de acțiune pentru reducerea riscului de episoade recurente sau chiar de deces după un SCA [3].

În etiologia SCA sunt implicați factori metabolici, genetici, de mediu și, printre alți, afecțiuni care pot crește inflamația și disfuncția endotelială, elemente cheie în dezvoltarea aterosclerozei [4, 5]. S-a estimat că procentul de ereditabilitate este de 40-55% din variația interindividuală a riscului de SCA susținând influența genetică substanțială [6].

CD40 este o moleculă costimulatoare care este exprimată constitutiv în limfocitele B și exprimată în alte celule, cum ar fi monocite, macrofage, celule endoteliale (EC) și celule musculare netede (SMC) [7]. Ligandul său, CD40L, este exprimat în principal pe suprafața trombocitelor (95%), limfocitelor T, EC, SMC și macrofage [7, 8].

Interacțiunea dintre CD40 și CD40L este implicată în imunopatogeneza ACS [9] datorită participării sale la activarea bidirecțională a celulelor prin căile de semnalizare c-Jun, NF-κB și ERK 1/2, promovând creșterea moleculelor de adeziune, secreția de citokine proinflamatorii și activarea trombocitelor [7]. Cu toate acestea, formele solubile ale CD40 și CD40L au fost asociate cu disfuncția endotelială sau ca markeri ai evenimentelor cardiovasculare adverse la pacienții cu SCA [10, 11] sugerându-le ca ținte potențiale ale agenților terapeutici [9].

În acest sens, polimorfismele cu un singur nucleotide (SNP) au fost identificate în CD40 și CD40L gene care pot crește susceptibilitatea pentru dezvoltarea SCA, prin studii de asociere la nivel de genom [7] și studii de gene candidate [12-16]. Aceste variante genetice au fost asociate cu boli inflamatorii și autoimune [17, 18], cu modificări ale CD40 și CD40L Expresia ARNm [19–25] precum și reglarea formelor solubile modificându-le funcția [15, 20] care au efect în inițierea, dezvoltarea și progresia aterosclerozei [26, 27].

Inflamația și disfuncția endotelială sunt factori care promovează dezvoltarea aterosclerozei, cu toate acestea, interacțiunile celulare și moleculare subiacente, care leagă factorii de risc existenți cu procesul aterosclerotic, nu sunt bine caracterizate. Din cunoștințele noastre, nu există studii care să evalueze contribuția CD40 și CD40L polimorfisme în populația din vestul Mexicului asociate cu boli cardiovasculare în special cu SCA.

În consecință, scopul acestui studiu a fost de a explora asocierea dintre polimorfismele cu un singur nucleotide în CD40 (rs1883832 (c.-1C>T), rs4810485 (c.51+914G>T) și rs11086998 (c.679C>G)) și CD40L (rs3092952 (g.1615A>G) și rs3092920 (18656G>T)) și susceptibilitatea la ACS. De asemenea, explorăm asocierea dintre aceste polimorfisme cu CD40 și CD40L expresie în leucocite din sângele periferic și niveluri solubile cuantificate în probe de plasmă obținute de la pacienți cu SCA și subiecți fără cardiopatie ischemică incluși într-un grup de control (CG).

2. Materiale și metode

2.1. Pacienți și subiecți cu SCA din grupul de control

Cohorta de studiu a constat din 320 de pacienți diagnosticați cu SCA clasificați conform Colegiului American de Cardiologie [28] și 300 de subiecți cu factori de risc SCA, dar fără antecedente de cardiopatie ischemică (determinată prin chestionar) ca CG. Toate persoanele incluse în studiu din vestul Mexicului au fost recrutate de la Hospital de Especialidades del Centro Medico Nacional de Occidente del Instituto Mexicano del Seguro Social (CMNO-IMSS). Perioada studiului a fost din februarie 2016 până în iunie 2018.

2.2. Considerații etice

Studiul a fost realizat în conformitate cu Declarația de la Helsinki din 2013. Toți indivizii au fost de acord să participe la studiu și au semnat consimțământul informat în scris. Aprobarea etică a fost obținută de Centro Universitario de Ciencias de La Salud (CUCS), UdeG (CI/065/2014).

2.3. Genotiparea și controlul calității

Variantele genetice au fost genotipări folosind testele TaqMan pentru CD40 (rs1883832 (C__11655919_20), rs4810485 (C___1260190_10) și rs11086998 (C___1260325_10)) și pentru CD40L (rs3092952 (C__26154899_10) și rs3092920 (C__27452204_10)) folosind TaqMan Genotyping Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA), urmând protocolul producătorului. Ca control al calității, a fost efectuată o genotipizare dublu-orb a 25% din probe pentru toate polimorfismele, fără variații în atribuirea genotipului.

2.4. Analiza PCR în timp real

ARN-ul total a fost extras din leucocite din sângele periferic folosind reactiv TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului pentru a obține ARN total conform metodei lui Chomczynski și Sacchi [29]. Un microgram de ARN total a fost transcris invers folosind reactivi de transcripție inversă pentru a obține ADNc urmând protocolul producătorului (Promega Corporation, SUA). PCR în timp real a fost efectuată folosind sonde TaqMan: gliceraldehidă 3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) (Hs02786624_g1), CD40 (Hs01002915_g1) și CD40L (Hs00163934_m1) conform condițiilor indicate în Protocolul de testare a expresiei genetice TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA) folosind un sistem Roche LightCycler 96®. Expresia relativă a fost normalizată la nivelul de expresie folosind GAPDH ca control intern și a fost evaluată folosind metodele 2 -ΔΔCq și 2 -ΔCq [30]. Rezultatele sunt exprimate ca o creștere relativă de ori în comparație cu controlul și respectiv unitatea relativă de expresie (URE). Metoda 2 -∆∆Cq a fost calculată așa cum sugerează Livak și Schmittgen [30], scopul acestei metode este de a compara măsurile de expresie ale genelor de interes prin normalizarea la o genă de referință în acest caz GAPDH. Folosind următoarea ecuație:

, unde calibratorul ∆Cq se referă la media ∆Cq a grupului de control. Am determinat expresia relativă a ARNm CD40 în leucocitele din sângele periferic de la pacienții cu SCA (

). Pentru evaluarea nivelurilor de expresie, caracteristicile cohortei au fost următoarele: vârsta (

), sex (raport femeie/bărbați SCA: 1,7, CG: 1,6) și prezența factorilor de risc similar și același număr de pacienți a fost inclus pentru fiecare dintre cele trei entități clinice ale SCA (14 UA, 14 NSTEMI și 14 STEMI). ).

2.5. Detectarea sCD40, sCD40L și IFN-γ

Nivelurile de sCD40, sCD40L și IFN-γ au fost determinate pe probe de plasmă folosind teste imunosorbente legate de enzime (ELISA) (Human CD40 Quantikine ELISA Kit, Human CD40 Ligand Quantikine și Human IFN-gamma Quantikine ELISA Kit, R&D Systems) conform protocolului producătorului. Sensibilitatea testului pentru sCD40, sCD40L și IFN-γ a fost de 5,56 pg/mL, 10,1 pg/mL, respectiv 8 pg/mL.

2.6. Analize statistice

Analiza statistică a fost efectuată utilizând software-ul SPSS versiunea 22 (SPSS Inc., Chicago, IL, SUA). Datele au fost prezentate ca interval median și intercuartil (IQR), dacă nu se indică altfel. Mann-Whitney

testul și testul Kruskal-Wallis au fost utilizate pentru a compara diferențele dintre grupuri. Genotipul și frecvențele alelelor CD40 și CD40L Variantele genetice au fost comparate între pacienții cu SCA și grupul de control. Ratele de cote (OR) și intervalele de încredere (IC) de 95% au fost calculate utilizând testele Chi-pătrat și exacte ale lui Fisher, atunci când este cazul. Corecția lui Bonferroni a fost aplicată pentru a reduce eroarea statistică de tip 1 (pc) în comparații multiple. Echilibrul Hardy-Weinberg a fost calculat din distribuția genotipului, iar dezechilibrul de legătură (LD) dintre polimorfisme a fost calculat utilizând metoda lui Lewontin.

între markerii genetici. Haplotipurile și frecvențele lor au fost estimate folosind platforma software SHEsis (http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php). Un model de regresie multiliniar a fost utilizat pentru a estima asocierea factorilor de risc comuni (comorbidități, sex, aportul de medicamente etc.) cu nivelurile de expresie sCD40, sCD40L și ARNm. Analiza corelației a fost stabilită prin corelația lui Spearman.

3. Rezultate

3.1. Caracteristici clinice

Informațiile clinice ale celor 320 de pacienți cu SCA și 300 de subiecți de control au fost înregistrate în Tabelul 1. Pacienții cu SCA și subiecții CG au avut o vârstă medie de 62 (±11 abatere standard (SD)) și, respectiv, 55 (±10 SD). În grupul ACS, există cu 3,32 mai mulți bărbați decât femei, în timp ce în CG, raportul bărbați/femei a fost de aproape 1/1. Pacienții cu SCA au prezentat niveluri ridicate de markeri ai funcției cardiace, inclusiv CK, CK-MB și troponina I în raport cu valorile de referință, parametrii biochimici sunt semnificativ crescuți la pacienții cu SCA comparativ cu controlul, așa cum se arată în tabelul 1. Factorii de risc cu cea mai mare prevalență în SCA au fost hipertensiunea arterială, fumatul și diabetul zaharat tip 2. Reinfarctul a fost găsit în 49 de cazuri (15,3%). Aportul de medicamente a inclus antiplachetare (acid acetilsalicilic, clopidogrel), statine, anticoagulante (heparină și enoxaparină) și agenți antihipertensivi (captopril, enalapril, spironolactonă și furosemid).

test ACS: sindrom coronarian acut Apo AI: apolipoproteina AI Apo B: apolipoproteina B CG: grupul de control CK: creatinina kinaza CK-MB: creatinina kinaza muschilor si creierului CRP: proteina C reactiva HDL-c: lipoproteina de inalta densitate IQR: interquartil intervalul LDL-c: lipoproteine ​​cu densitate joasă STEMI: infarct miocardic fără supradenivelare a segmentului ST NA: nu este cazul UA: angină instabilă STEMI: infarct miocardic cu denivelare a segmentului ST (STEMI). Datele au fost exprimate ca interval median și intercuartil (Q25-Q75), dacă nu se indică altfel. a Datele furnizate în

3.2. Analiza genotipului și alelelor

Genotipul și frecvențele alelelor CD40 (rs1883832, rs4810485 și rs11086998) și CD40L (rs3092952 și rs3092920) polimorfismele sunt prezentate în tabelele 2–4. Distribuțiile genotipului au fost de acord cu așteptările de echilibru Hardy-Weinberg (

valoare pentru modelul alelic între genuri.

SAU: raportul de cote. Haplotipul este reprezentat de rs1883832, rs4810485 și, respectiv, rs11086998.

Nici genotipul, nici distribuția alelelor de trei CD40 polimorfismele au fost diferite din punct de vedere statistic atunci când au fost comparate SCA și grupurile de control.

pentru că CD40L este situat pe cromozomul X, am efectuat analiza pe gen (Tabelul 3). Este demn de menționat că nu am găsit diferențe pentru frecvențele alelelor pe CD40L variante între sexe (rs3092952 A/G:

). Distribuția genetică a ambelor polimorfisme a fost similară între pacienți și controale, fie reunite (datele nu sunt afișate), fie separate de sex.

3.3. Analiza haplotipului CD40 și CD40L

Am analizat asocierea dintre haplotipurile găsite în cohorta noastră vestică a genelor CD40/CD40L și ACS. Analiza a arătat că rs1883832, rs4810485 și rs11086998 din CD40 erau în dezechilibru de legătură ( , , ). Am găsit un haplotip major (CCG) care a reprezentat 67,1% și, respectiv, 65,5% la pacienții cu SCA și, respectiv, la subiecții de control. De asemenea, am găsit un haplotip protector (CTC, OR: 0,22) (Tabelul 4).

CD40L polimorfismele nu au fost în LD ( ), indicând că 3092952 și rs3092920 trebuie analizate separat.

3.4. CD40 Expresia ARNm

Pacienții cu SCA au prezentat o expresie mediană mai mare a CD40 ARNm în leucocitele din sângele periferic în comparație cu martorii (de 0,82 ori mai mult), totuși, această comparație nu a fost semnificativă. În mod similar, stratificarea după diagnosticul clinic în grupul ACS (UA, NSTEMI și STEMI) nu a indicat nicio diferență în nivelul de exprimare a ARNm a CD40. Apoi, am analizat datele de la pacienții cu SCA și CG, stratificând rezultatele prin purtarea genotipurilor rs1883832, rs4810485 și rs11086998. Din cauza frecvențelor scăzute ale alelelor minore, am presupus modelul dominant de asociere (rs1883832: C/C vs. C/T+TT, r4810485: G/G vs. G/T+TT și rs11086998: C/C vs. .C/G+G/G), deși nu am găsit diferențe în nivelul de CD40 expresia dintre variantele genetice din oricare grup (datele nu sunt prezentate).

3.5. CD40L Expresia ARNm

Analiza prin metoda 2 -ΔΔCq a arătat că CD40L Expresia ARNm la pacienții cu SCA a fost de 1,25 de ori mai mare decât cea din CG (Figura 1(a)), această diferență a fost constatată în mod semnificativ prin metoda 2 -ΔCq (p=0,035) (Figura 1(b)). Pe entități clinice, nu am găsit nicio diferență (datele nu sunt prezentate).

). ACS: sindrom coronarian acut CG: grup martor.

Având în vedere locația pe cromozomul X și concluzia altor studii care CD40L Expresia ARNm poate fi afectată de gen [20], am analizat separat pentru fiecare gen în ambele grupuri de studiu fără nicio dovadă de asociere. În funcție de sex, pacienții de sex feminin sau de sex masculin au avut tendința de a prezenta mai multă expresie în comparație cu grupul de control (Figura 2(a)). Când am stratificat după diagnosticul clinic al SCA și al sexului, pacienții de sex feminin UA au prezentat cea mai mare expresie (5,12 URE), deși niciuna dintre comparații nu a fost semnificativă statistic (pacienți de sex masculin, pacienți de sex feminin, ) (Figura 2 (b)).

Este important de menționat că am explorat ARNm CD40L exprimarea în ambele grupuri de studiu în funcție de variantele genetice (rs3092952 și rs3092920), urmând modelul dominant însă, nu am găsit diferențe.

3.6. Asocierea dintre sCD40 și sCD40L cu ACS

Am evaluat nivelurile plasmatice ale CD40 și CD40L în ambele grupuri de studiu. Am descoperit că pacienții cu SCA prezintă niveluri semnificativ mai mari de sCD40 ( ) în comparație cu grupul de control (843,3 vs. 492 pg/mL). Un model de regresie multiliniară denotă că această asociere ar putea fi mascată de clopidogrel ( ). Diagnosticul ACS pare să nu fie asociat cu sCD40 (UA: 677,1 pg/mL NSTEMI: 661,7 pg/mL și STEMI: 782,4 pg/mL, ).

Diferențele dintre nivelurile sCD40 dintre variantele genetice CD40 au fost, de asemenea, analizate presupunând modelul dominant de asociere. După cum se arată în Figura 3, purtătorii C/C au avut niveluri plasmatice de sCD40 mai mari decât rs1883832 C/T+T/T (561 vs. 475,7 pg/mL, ). În mod similar, purtătorii homozigoți ai rs4810485 au prezentat o concentrație mai mare de CD40 solubil decât purtătorii G/T+T/T (562,5 față de 489,7 pg/mL, ).

La pacienții cu SCA, nu a existat o astfel de asociere a acestor variante genetice CD40 și nici o asociere a CD40 polimorfismul rs11086998 cu niveluri plasmatice de CD40 în ambele grupuri de studiu presupunând modelul dominant de asociere C/C vs. C/G+G/G (ACS: 846 pg/mL vs. 725 pg/mL, CG: 509 pg/mL vs. 540 pg/mL, ) (Figura 4).

În ceea ce privește nivelurile plasmatice de sCD40L, pacienții prezintă niveluri mai mari de sCD40L în comparație cu martorii, totuși, această comparație nu a atins semnificație statistică (1080 vs. 868,9 pg/mL, ). Conform diagnosticului ACS și sCD40L stratificat în funcție de sex, pacienții de sex feminin cu STEMI au avut niveluri mai ridicate în comparație cu pacienții de sex feminin UA (1489,5 vs. 533,8 pg/mL, ). Pacienții de sex masculin UA au prezentat niveluri mai mari de sCD40L în comparație cu pacienții de sex feminin UA (1714,3 vs. 533,8 pg/mL, , Figura 5). Când au fost reunite, nivelurile de sCD40L au fost similare prin diagnosticul ACS (, datele nu sunt prezentate).

Medicamentul nu a avut un efect semnificativ asupra sCD40L plasmatic în grupul SCA atunci când a fost introdus în modelul de regresie multiplă (

: 0,003, ), adică diferențele dintre pacienții cu ACS de sCD40L nu sunt determinate de medicamente.

Am analizat asocierea dintre variantele genetice pe CD40L și nivelurile plasmatice ale sCD40L în ambele grupuri de studiu fără nicio dovadă de asociere.

În cele din urmă, am observat o corelație liniară pozitivă între sCD40L și IFN-γ la pacienții cu SCA ( , ) (Figura 6).

4. Discutie

CD40 și CD40L au funcții importante care cuprind activarea celulară și producerea de citokine proinflamatorii. Aceasta favorizează inflamația care poate accelera procesele de ateroscleroză și are un rol funcțional în dezvoltarea bolilor cardiovasculare [8]. Prin urmare, variantele genetice au fost de interes pentru relația lor cu riscul crescut de boli cardiovasculare [14, 15].

SNP pe CD40 gena, rs1883832, a fost asociată cu SCA în prezența alelei C majore și a fost asociată cu niveluri scăzute de sCD40 în prezența alelei minore T și riscul de boli cardiovasculare [31, 32]. Într-o cohortă din vestul Mexicului, acest lucru nu a fost identificat ca un factor de risc genetic pentru artrita reumatoidă (AR) [25]. Acest polimorfism a fost asociat cu expresia ARNm diminuată a CD40 [21, 22] rs1883832 a fost găsit în LD mare cu rs4810485, acesta din urmă fiind asociat semnificativ cu formarea leziunilor de arteră coronară la o populație taiwaneză [33]. Având în vedere localizarea în regiunea 5 UTR și respectiv intronul 1 a acestor SNP-uri, acestea au fost asociate cu modificări ale expresiei ARNm, deoarece sunt în LD aproape complet ( ) cu rs6074022, care rezidă în promotorul CD40 și afectează nivelurile de ARNm [20]. ]. Altfel, după cunoștințele noastre, rs11086998 nu a fost asociat ca factor de risc genetic în bolile cardiovasculare, dar se știe că are legătură în modularea nivelurilor de citokine proinflamatorii, TNF.α și IL-6, deoarece se află pe exonul 9 care codifică proteina din domeniul intracelular implicată în căile de semnalizare ale CD40 [34].

Aceste polimorfisme au fost identificate anterior ca markeri genetici ai bolilor cardiovasculare, în principal la populația chineză și europeană: Li și colab. a studiat 160 de pacienți cu SCA și 92 de martori într-o populație chineză Han [12] Tian și colab. a analizat 248 de pacienți cu SCA și 206 martori într-o populație chineză [13] Wang și colab. au raportat analiza la 474 de pacienți cu plăci de ateroscleroză coronariană și 225 de martori într-o populație chineză [14] și García-Bermúdez și colab. au analizat 290 de pacienți cu artrită reumatoidă (AR) cu evenimente cardiovasculare și 1285 de pacienți cu artrită reumatoidă, dar fără evenimente cardiovasculare [17]. Cu toate acestea, în studiul nostru, nu putem sprijini această asociere. Acest lucru ar putea fi explicat prin diferențele genetice între populații [35]. Cele trei variante ale CD40 au fost găsite în LD, ceea ce înseamnă că trebuie analizate împreună cel puțin în populația noastră. În acest context, am constatat că blocul haplotip rs1883832 (C)-rs4810485 (T)-rs11086998 (C) este asociat cu un risc scăzut de SCA (OR: 0,22) și poate fi un factor de protecție al SCA în vestul mexican. populație, deși nu se poate exclude faptul că alte SNP din apropiere din blocul LD sunt asociate cu susceptibilitatea bolii [21].

Analiza variației genetice a cromozomului X în boli este un domeniu de interes. În conformitate cu cele de mai sus, în CD40L, am evaluat două SNP-uri situate în 5 UTR (rs3092952) și 3 UTR (rs3092920), acestea sunt localizate în diferite blocuri de haplotip și au un LD slab [36] așa cum am coroborat. rs3092952 a fost descris ca o variantă funcțională prin modularea nivelurilor de sCD40L în probele de plasmă. În timp ce rs3092920 a fost studiat ca un marker genetic al bolilor cardiovasculare la pacienții cu RA și infarct miocardic, unele studii nu au găsit o astfel de asociere [15, 17], ceea ce este în concordanță cu rezultatele noastre, deoarece nu am găsit o asociere între variantele genetice pe cel CD40L gena și riscul de SCA.

Cu toate acestea, alți factori pot crește riscul de SCA și pot influența evenimentele adverse [5] rezultatele noastre nu arată un rol semnificativ al acestor polimorfisme în evenimentele coronariene acute. Cu toate acestea, mecanismele celulare și moleculare care stau la baza efectului acestor variante genetice și ACS ar putea fi mediate de modificări ale expresiei genelor și proteinei CD40 și CD40L.

Alte studii analizate CD40/CD40L Nivelurile de expresie a ARNm în boala coronariană (CHD), în urma separării celulelor mononucleare din sângele periferic și qRT-PCR și au găsit niveluri de expresie semnificativ crescute ale ambelor gene în grupul CHD comparativ cu grupul de control [24].

Nu am găsit diferențe între CD40 Nivelurile de ARNm în leucocite totale din sângele periferic ale pacienților cu SCA și subiecților de control. Acest lucru se poate datora faptului că principala sursă de CD40 în sângele periferic sunt celulele B [21]. Field și colab. nu a găsit o asociere între genotip și expresia ARNm CD40 măsurată în sângele integral, totuși, genotipul C/C rs1883832 a fost asociat cu o expresie mai mare a CD40 în celulele B [21]. Sugerăm că trebuie efectuate studii suplimentare care analizează aceste subpopulații pentru a înțelege funcționalitatea acestor variante genetice în expresia genei ARNm CD40.

Lipsa de asociere între polimorfismele genetice și expresia CD40 este de acord cu cea raportată de Jacobson și colab. [22], deoarece sugerează că varianta genetică rs1883832, care se află într-un dezechilibru mare de legătură cu rs4810485 (

), acţionează mai degrabă la nivelul translaţiei decât al transcripţiei, exercitându-şi efectele ca polimorfism funcţional în etiologia bolii prin reglarea eficienţei translaţiei, în absenţa oricărui efect genotip asupra nivelurilor de ARNm. În aceeași linie, SNP-ul rs4810485 a fost asociat cu expresia proteinei CD40 pe monocite CD14 + și celule B CD19 + de la pacienții cu lupus eritematos evaluați prin citometrie în flux [18]. Alte studii au raportat niveluri crescute de sCD40 la subiecții care poartă alela minoră a polimorfismelor rs1883832 și rs4810485 [25, 32].

Am observat niveluri crescute de sCD40 în probele de plasmă de la pacienții coronarieni acut, comparativ cu grupul de control ( ). În timpul proceselor inflamatorii, sCD40 are proprietăți biologice descrise ca imunomodulatoare, deoarece inhibă răspunsurile imune [37]. Răspunsul sistemic proinflamator are un rol cheie în patofiziologia acestui sindrom contribuind la deznodământul cardiovascular în acest sens, sCD40 reprezentând un element potențial prin care sistemul CD40-CD40L poate fi modulat prin efectul său antagonist împotriva activării CD40 [38].

Entitățile clinice ale SCA nu diferă în nivelurile plasmatice de sCD40 ( ) chiar și atunci când au rezultate diferite, iar sCD40 este implicat în mai multe stadii de dezvoltare a SCA [39]. Subliniem că rezultatele noastre trebuie luate cu prudență, deoarece clopidogrelul a explicat 25% din variabilitatea totală a nivelurilor plasmatice de CD40 în SCA și concentrațiile crescute de lipide din sânge au apărut ca predictori semnificativi ai nivelurilor sCD40 (notate prin regresie liniară, ). Scăderea sintezei colesterolului prin terapia farmacologică utilizată la pacienții cu SCA a fost asociată cu niveluri crescute de sCD40 [40]. Este important de clarificat faptul că clopidogrelul este unul dintre medicamentele care constituie piatra de temelie în schema de tratament a acestor pacienți, deci aceasta este o variabilă de intervenție care ar trebui luată în considerare în studiile viitoare. Din păcate, numărul de pacienți care nu sunt tratați cu clopidogrel este destul de mic, împiedicând comparațiile robuste.

Terapia farmacologică poate avea un efect asupra nivelurilor plasmatice ale CD40 [41], circumstanță care ar explica lipsa de asociere între polimorfismele de pe CD40 locus și nivelurile solubile ale probelor de plasmă la pacienții cu SCA. Un argument în favoarea acestui lucru îl reprezintă constatările din grupul de control în care am constatat că purtătorii homozigoți ai alelei majore rs1883832 și rs4810485 au avut niveluri semnificativ mai mari de sCD40 (Figura 3).

Pacienții cu SCA au avut un nivel crescut de CD40L ARNm comparativ cu martori. Important, niveluri ridicate de CD40L Expresia ARNm pe limfocitele T este legată de evenimentele coronariene acute [42]. Deși nu am găsit diferențe semnificative între ACS și CG în nivelurile plasmatice de sCD40L, am observat că pacienții aveau niveluri mai mari de sCD40L și o corelație liniară pozitivă între sCD40L și IFN-γ a fost găsit (Figura 6), astfel, se poate specula că pacienții cu evenimente coronariene acute au răspunsuri îmbunătățite ale celulelor T care promovează disfuncția endotelială și inflamația sistemică [43, 44].

Un raport anterior a concluzionat că CD40L Expresia ARNm poate fi afectată de sex [20] în plus, un nivel scăzut de ARNm CD40L și creșterea concentrațiilor de sCD40L ar putea reflecta o activitate mai mare a trombocitelor care susține funcția CD40L în imunopatologia SCA [7]. În consecință, am găsit doar o concentrație mai mare de sCD40L în plasmă la pacienții cu SCA. Pe entitățile clinice, femeile cu UA au avut o concentrație mai mică decât cele cu STEMI, efectul opus a fost observat la bărbați. De remarcat, cele trei spectre clinice de SCA au adesea aceeași simptomatologie [45] și comunitatea științifică este îndemnată să găsească biomarkeri care să completeze diagnosticul.

Mai mult, s-a raportat că 4% până la 30% dintre pacienții cu boli ischemice cardiovasculare au un răspuns slab la terapia antiplachetă etichetată drept „răspuns scăzut” sau „neresponders” [46], în special, pacienții de sex masculin au fost raportați a fi de 2,9 ori mai probabil să nu răspundă la terapia antiplachetă decât femeile [47] și au fost legate de evenimente cardiovasculare recurente, cum ar fi decesul din cauza bolii coronariene, un eveniment coronarian major nefatal (infarct miocardic, spitalizare pentru angină instabilă sau stop cardiac resuscitat) sau ischemie fatală. accident vascular cerebral [48].

Persistența reactivității plachetare chiar și cu utilizarea agenților antiplachetari a trezit interesul pentru strategiile capabile să identifice subiecții cu risc crescut de evenimente cardiovasculare recurente după un SCA. În acest sens, concentrația plasmatică a CD40L a fost asociată ca un marker al leziunii miocardice și prezice în mod independent moartea și IM recurent la pacienții cu SCA [10]. Prin urmare, ajustarea terapiei antiplachetare utilizate în SCA în funcție de sex și factori de risc ar putea reduce riscul de evenimente adverse și ar putea îmbunătăți rezultatul pacienților.

Cu toate acestea, avem în vedere că rezultatele noastre ar trebui interpretate cu prudență și replicate din cauza efectului mărimii eșantionului în cadrul analizei stratificate.

În cele din urmă, analiza asocierii celor două variante genetice ale CD40L nu este corelată cu expresia ARNm și concentrația proteinei. Sunt necesare studii suplimentare, luând în considerare factori modificabili care pot modifica expresia genelor pentru a înțelege efectul funcțional al acestor polimorfisme în exprimarea CD40 și CD40L.

5. Concluzii

Analizate individual, variante genetice ale CD40 și CD40L nu sunt markeri de susceptibilitate ai SCA în această cohortă mexicană. Cu toate acestea, haplotipul CTC al CD40 a fost asociat cu risc scăzut de SCA.

Pacienții cu SCA au prezentat mai mult CD40L Expresia relativă a ARNm decât martorii.

Nivelurile solubile de CD40 au fost crescute la pacienții cu SCA, totuși, acestea sunt afectate de terapia cu clopidogrel.

La martori, purtătorii de genotip rs1883232 C/C și rs4810485 G/G au prezentat niveluri mai mari de CD40 solubile.

Pacienții de sex feminin cu STEMI au avut niveluri mai mari de sCD40L comparativ cu UA. În caz contrar, pacienții de sex masculin UA au prezentat niveluri mai mari de sCD40L comparativ cu UA. Medicamentul nu a avut un efect semnificativ asupra sCD40L plasmatic.

Aceste rezultate ar putea reflecta procesul inflamator și activarea trombocitelor la pacienții cu SCA, chiar și atunci când sunt sub tratament antiplachetar și antiinflamator. Datorită rolurilor importante ale sistemului CD40-CD40L în procesele imunologice în patogeneza SCA, sunt necesare studii longitudinale pentru a determina dacă nivelurile solubile de CD40 și CD40L ar putea fi markeri utili din punct de vedere clinic ai unui eveniment cardiovascular recurent după un SCA.

Disponibilitatea datelor

Datele folosite pentru a susține concluziile acestui studiu sunt incluse în articol.

Conflicte de interes

Autorii declară că nu există conflict de interese cu privire la publicarea acestui articol.

Mulțumiri

Autorii apreciază foarte mult participarea fiecărei persoane la acest studiu. Această lucrare a fost susținută parțial de PROSNI 2017 și PROSNI 2018 acordate YV de către Universitatea din Guadalajara.

Referințe

  1. A. Gisterå și G. K. Hansson, „Imunologia aterosclerozei”, Nature Reviews Nefrologie, vol. 13, nr. 6, pp. 368–380, 2017, publicare online anticipată. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  2. J. L. Anderson și D. A. Morrow, „Infarct miocardic acut”, New England Journal of Medicine, vol. 376, nr. 21, pp. 2053–2064, 2017. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  3. R. S. Rosenson, H. B. Brewer și D. J. Rader, „Lipoproteins as biomarkers and therapeutic targets in the setting of acute coronary syndrome,” Cercetarea circulației, vol. 114, nr. 12, p. 1880–1889, 2014. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  4. M. K. Reriani, A. J. Flammer, A. Jama, L. O. Lerman și A. Lerman, „Factori de risc funcționali noi pentru predicția evenimentelor cardiovasculare la pacienții vulnerabili în urma sindromului coronarian acut”, Jurnal de circulație, vol. 76, nr. 4, pp. 778–783, 2012. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  5. M. Franchini, „Genetica sindromului coronarian acut”, Analele medicinei translaționale, vol. 4, nr. 10, p. 192, 2016. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  6. R. Elosua, C. Lluis și G. Lucas, „Estudio del componente genético de la cardiopatía isquémica: de los estudios de ligamiento al genotipado integral del genoma,” Revista Española de Cardiología Suplementos, vol. 9, nr. 2, pp. 24–38, 2009. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  7. N. A. Michel, A. Zirlik și D. Wolf, „CD40L și receptorii săi în aterotromboză-o actualizare”, Frontiere în medicina cardiovasculară, vol. 4, p. 40, 2017. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  8. E. Lutgens, D. Lievens, L. Beckers, M. Donners și M. Daemen, „CD40 and its ligand in atherosclerosis,” Tendințe în medicina cardiovasculară, vol. 17, nr. 4, pp. 118–123, 2007. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  9. C. Antoniades, C. Bakogiannis, D. Tousoulis, A. S. Antonopoulos și C. Stefanadis, „The CD40/CD40 ligand system: linking inflammation with atherothrombosis,” Jurnalul Colegiului American de Cardiologie, vol. 54, nr. 8, pp. 669–677, 2009. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  10. N. Varo, J. A. de Lemos, P. Libby et al., „Soluble CD40L: risk prediction after acute coronary syndromes”, Circulaţie, vol. 108, nr. 9, pp. 1049–1052, 2003. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  11. M. T. Rondina, J. M. Lappé, J. F. Carlquist et al., „Ligandul CD40 solubil ca predictor al bolii coronariene și al rezultatelor clinice pe termen lung la pacienții stabili supuși angiografiei coronariene”, Cardiologie, vol. 109, nr. 3, pp. 196–201, 2008. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  12. Y. Li, C.-X. Tian, ​​M. Wang și Z.-E. Xia, „Corelarea polimorfismelor genei CD40 cu sindromul coronarian acut, hipertensiunea arterială și diabetul”, Zhonghua Yi Xue Za Zhi, vol. 87, nr. 10, pp. 690–694, 2007. Vizualizare la: Google Scholar
  13. C. Tian, ​​W. Qin, L. Li, W. Zheng și F. Qiu, „Un polimorfism comun în secvența Kozak CD40 (-1C/T) este asociat cu sindromul coronarian acut,” Biomedicina si Farmacoterapia, vol. 64, nr. 3, pp. 191–194, 2010. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  14. C. Wang, J. Yan, P. Yang, R. Du și G. Chen, „Relația dintre polimorfismul genei CD40 și plăcile coronariene instabile aterosclerotice”, Cardiologie clinică, vol. 33, nr. 6, pp. E55–E60, 2010. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  15. A. Mälarstig, B. Lindahl, L. Wallentin și A. Siegbahn, „Nivelurile de CD40L solubile sunt reglementate de polimorfismul -3459 A>G și prezic infarctul miocardic și eficacitatea tratamentului antitrombotic în sindromul coronarian acut fără supradenivelare ST”, Arterioscleroză, tromboză și biologie vasculară, vol. 26, nr. 7, pp. 1667–1673, 2006. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  16. K. P. Burdon, C. D. Langefeld, S. R. Beck și colab., „Variantele genei CD40, dar nu ale genei CD40L sunt asociate cu calcificarea arterei coronare în Studiul Diabetes Heart (DHS)” Jurnalul american al inimii, vol. 151, nr. 3, pp. 706–711, 2006. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  17. M. García-Bermúdez, C. González-Juanatey, R. López-Mejías și colab., „Studiul asocierii polimorfismelor genei CD40-CD154 cu susceptibilitatea bolii și riscul cardiovascular la pacienții cu artrită reumatoidă spaniolă” PLUS UNU, vol. 7, nr. 11, p. e49214, 2012. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  18. V. M. Vazgiourakis, M. I. Zervou, C. Choulaki și colab., „Un SNP comun în regiunea CD40 este asociat cu lupusul eritematos sistemic și se corelează cu expresia alterată a CD40: implicații pentru patogeneză,” Analele bolilor reumatice, vol. 70, nr. 12, pp. 2184–2190, 2011. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  19. K. S. Gandhi, F. C. McKay, M. Cox și colab., „Transcriptomul ARNm din sângele întreg al sclerozei multiple și asociațiile genetice indică dereglarea căilor specifice celulelor T în patogeneză.” Genetica moleculară umană, vol. 19, nr. 11, pp. 2134–2143, 2010. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  20. M. Wagner, M. Sobczyński, M. Bilińska și colab., „Alela de risc MS rs1883832T este asociată cu scăderea expresiei ARNm a CD40”, Journal of Molecular Neuroscience, vol. 56, nr. 3, pp. 540–545, 2015. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  21. J. Field, F. Shahijanian, S. Schibeci et al., „Alela de risc MS a CD40 este asociată cu expresia redusă legată de membrană celulară în celulele prezentatoare de antigen: implicații pentru funcția genei”, Plus unu, vol. 10, nr. 6, p. e0127080, 2015. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  22. E. M. Jacobson, E. Concepcion, T. Oashi și Y. Tomer, „Polimorfismul dintr-o singură nucleotidă a secvenței Kozak asociată bolii lui Graves îmbunătățește eficiența traducerii genei CD40: un caz pentru patofiziologia translațională” Endocrinologie, vol. 146, nr. 6, pp. 2684–2691, 2005. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  23. Z.-L. Liu, J. Hu, S.-P. Zhao, X.-Z. Xiao și M.-S. Yang, „The CD40 rs1883832 Polimorfismul afectează susceptibilitatea la sepsis și nivelurile sCD40L. BioMed Research International, vol. 2018, ID articol 7497314, 8 pagini, 2018. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  24. J. Chen, J.-H. Li, S.-J. Zhao, D.-Y. Wang, W.-Z. Zhang și W.-J. Liang, „Semnificația clinică a moleculelor costimulatoare CD40/CD40L și CD134/CD134L în boala coronariană”, Medicament, vol. 96, nr. 32, articolul e7634, 2017. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  25. I. V. Román-Fernández, D. F. Ávila-Castillo, S. Cerpa-Cruz et al., „Polimorfismele genelor funcționale CD40 și expresia ARNm la pacienții cu artrită reumatoidă din vestul Mexicului”, Genetică și cercetare moleculară, vol. 15, nr. 4, 2016. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  26. P. Gururajan, P. Gurumurthy, P. Nayar et al., „Concentrațiile serice crescute ale ligandului CD40 solubil ca marker de prognostic la pacienții cu sindrom coronarian acut”, Jurnalul indian de biochimie clinică, vol. 24, nr. 3, pp. 229–233, 2009. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  27. D. Engel, T. Seijkens, M. Poggi et al., „Imunobiologia interacțiunilor CD154-CD40-TRAF în ateroscleroză”, Seminarii de imunologie, vol. 21, nr. 5, pp. 308–312, 2009. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  28. CP Cannon, RG Brindis, BR Chaitman et al., „2013 ACCF/AHA elemente de date cheie și definiții pentru măsurarea managementului clinic și a rezultatelor pacienților cu sindroame coronariene acute și boală coronariană: un raport al Fundației American College of Cardiology/ Grupul operativ al Asociației Americane de Inimă privind standardele de date clinice (comitet de redactare pentru a dezvolta standarde de date clinice pentru sindroamele coronariene acute și boala coronariană)” Circulaţie, vol. 127, nr. 9, pp. 1052–1089, 2013. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  29. P. Chomczynski și N. Sacchi, „Metoda într-o singură etapă de izolare a ARN prin extracție cu tiocianat de guanidiniu acid-fenol-cloroform: la douăzeci și ceva de ani,” Protocoale naturii, vol. 1, nr. 2, pp. 581–585, 2006. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  30. K. J. Livak și T. D. Schmittgen, „Analiza datelor despre expresia genelor relative utilizând PCR cantitativă în timp real și metoda 2(-delta delta C(T))” Metode San Diego California, vol. 25, nr. 4, pp. 402–408, 2001. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  31. M. Wang, Y. Li, W. Li, Z. Xia și Q. Wu, „Polimorfismul genei CD40 rs1883832 este asociat cu riscul de sindrom coronarian acut într-un studiu de caz-control chinez”, ADN și biologie celulară, vol. 30, nr. 3, pp. 173–178, 2011. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  32. J.-M. Chen, J. Guo, C. D. Wei și colab., „Asocierea polimorfismelor CD40 cu nivelurile serice de CD40 și riscul de lupus eritematos sistemic”, BMC Genetica, vol. 16, nr. 1, 2015. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  33. H.-C. Kuo, M. C. Chao, Y. W. Hsu și colab., „Polimorfismele genei CD40 asociate cu susceptibilitatea și leziunile arterei coronare ale bolii Kawasaki în populația taiwaneză”, Jurnalul Scientific World, vol. 2012, ID articol 520865, 5 pagini, 2012. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  34. A. L. Peters, R. M. Plenge, R. R. Graham și colab., „Un nou polimorfism al receptorului CD40 uman cu funcție îmbunătățită”, Sânge, vol. 112, nr. 5, p. 1863–1871, 2008. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  35. R. Rubi-Castellanos, G. Martínez-Cortés, J. Francisco Muñoz-Valle et al., „Demografia mesoamericană prehispanică aproximează strămoșii actuali ai mestizoși pe tot teritoriul Mexicului,” Jurnalul american de antropologie fizică, vol. 139, nr. 3, pp. 284–294, 2009. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  36. S. Chadha, K. Miller, L. Farwell și colab., „Structura haplotipului TNFRSF5-TNFSF5 (CD40-CD40L) și analiza asocierii în lupusul eritematos sistemic”, Jurnalul European de Genetică Umană, vol. 13, nr. 5, pp. 669–676, 2005. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  37. C. van Kooten și J. Banchereau, „Ligandul CD40-CD40”, Jurnalul de biologie a leucocitelor, vol. 67, nr. 1, pp. 2–17, 2000. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  38. B. D. Hock, J. L. McKenzie, N. W. Patton și colab., „Nivelurile circulante și semnificația clinică a CD40 solubil la pacienții cu malignități hematologice”, Cancer, vol. 106, nr. 10, pp. 2148–2157, 2006. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  39. M. Tsuzuki, I. Morishima, T. Yoshida et al., „Corelația inversă între ligand CD40 solubil și CD40 solubil este absentă la pacienții cu angină instabilă”, Vasele Inimii, vol. 20, nr. 6, pp. 245–250, 2005. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  40. M. Luomala, H. Päivä, R. Laaksonen et al., „CD40 solubil în plasmă este legat de metabolismul colesterolului la pacienții cu hipercolesterolemie moderată”, Jurnalul Cardiovascular Scandinav, vol. 40, nr. 5, pp. 280–284, 2006. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  41. T. Sexton, E. Wallace și S. Smyth, „Efectele antitrombotice ale statinelor în sindroamele coronariene acute: la intersecția trombozei, inflamației și interacțiunilor trombocite-leucocite”, Recenzii curente de cardiologie, vol. 12, nr. 4, pp. 324–329, 2016. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  42. S. X. Anand, J. F. Viles-Gonzalez, J. J. Badimon, E. Cavusoglu și J. D. Marmur, „CD40L și sCD40L asociate membranei în boala aterotrombotică”, Tromboza si hemostaza, vol. 90, nr. 09, pp. 377–384, 2003. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  43. J. F. McDyer, T. J. Goletz, E. Thomas, C. H. June și R. A. Seder, „CD40 ligand/CD40 stimulation regulates the production of IFN-γ din celulele mononucleare din sângele periferic uman într-o manieră dependentă de IL-12 și/sau CD28”, Jurnal de Imunologie, vol. 160, nr. 4, pp. 1701–1707, 1998. Vizualizare la: Google Scholar
  44. K. Y. Stokes, L. Calahan, C. M. Hamric, J. M. Russell și D. N. Granger, „CD40/CD40L contribuie la inflamația microvasculară indusă de hipercolesterolemie”, Jurnalul American de Fiziologie-Fiziologia Inimii și Circulatorii, vol. 296, nr. 3, pp. H689–H697, 2009. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  45. Troponină cardiacă de înaltă sensibilitate pentru diagnosticarea rapidă a sindromului coronarian acut în departamentul de urgență: o evaluare clinică și a rentabilității, Agenția Canadiană pentru Medicamente și Tehnologii în Sănătate, Ottawa, 2013, Raportul de utilizare optimă CADTH, nr. 2.1A.
  46. T. K. W. Ma, Y.-Y. Lam, V. P. Tan și B. P. Yan, „Variabilitatea ca răspuns la clopidogrel: cât de importante sunt farmacogenetica și interacțiunile medicamentoase?” Br. J. Clin. Pharmacol., vol. 72, nr. 4, pp. 697–706, 2011. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  47. R. E. J. Roach, S. C. Cannegieter și W. M. Lijfering, „Riscuri diferențiate la bărbați și femei pentru tromboza venoasă primară și recurentă: rolul genelor și al mediului” Jurnalul de tromboză și hemostază, vol. 12, nr. 10, pp. 1593–1600, 2014. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  48. G. G. Schwartz, C. M. Ballantyne, P. J. Barter și colab., „Asocierea lipoproteinei (a) cu riscul de evenimente ischemice recurente în urma sindromului coronarian acut: analiza studiului clinic randomizat dal-Outcomes,” Cardiologie JAMA, vol. 3, nr. 2, pp. 164–168, 2018. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic

Drepturi de autor

Copyright © 2019 D. E. Martínez-Fernández și colab. Acesta este un articol cu ​​acces deschis distribuit sub Licența de Atribuire Creative Commons, care permite utilizarea, distribuirea și reproducerea fără restricții pe orice mediu, cu condiția ca lucrarea originală să fie citată corespunzător.


Metode

Participanții

Participanții au fost 105 bărbați caucazieni cu vârsta cuprinsă între 18 și 77 de ani (M = 28,51, SD = 13,82) care au fost recrutați de la Universitatea Stony Brook și comunitățile învecinate prin fluturași, ziare și reclame online. Participanții au fost verificați telefonic pentru eligibilitate. Toți participanții nu au raportat niciun diagnostic prealabil de tulburări psihologice sau utilizarea vreunui medicament înrudit. Detalii despre alte criterii de excludere sunt date în fișierul suplimentar 1. Măsurile timpurii de viață și stresul cronic, genotipul 5-HTTLPR și metilarea ADN-ului (a se vedea mai jos) au fost disponibile de la toți acești participanți. Un subset (N = 71) au participat la TSST (M vârstă = 29,79, SDvârstă = 15,24). Date suplimentare despre simptomele depresive recente, expresia genelor și răspunsul cortizolului la TSST au fost disponibile de la acești participanți. Studiul a fost aprobat de Consiliul de revizuire instituțional al Universității Stony Brook, iar participanții au furnizat consimțământul scris înainte de participarea la sesiunile experimentale. La sfârșitul fiecărei sesiuni, participanții au fost informați oral și în scris și au fost compensați cu 100 USD plus rambursare pentru orice costuri de transport public.

Sesiuni experimentale

Pentru standardizarea măsurilor biologice sub influența variației diurne, toate sesiunile experimentale au început între orele 12:00 și 14:00. Participanții au fost instruiți să nu mănânce, să bea (altele decât apă) și să facă exerciții fizice cu cel puțin 1 oră înainte de sosire. Procedura totală, care a durat aproximativ 4 ore, a inclus consimțământul, completarea chestionarelor, TSST, un interviu cu evenimente de viață și informare. Participanții au furnizat, de asemenea, probe de sânge pentru genotiparea și analizele de metilare a ADN-ului, una la începutul sesiunii (45 min înainte de TSST) și una la sfârșit (105 min după TSST). Nivelurile de cortizol au fost evaluate folosind probe de salivă colectate la nouă momente diferite de-a lungul sesiunii.

Evaluarea stresului timpuriu al vieții

Stresul timpuriu a fost evaluat cu Childhood Trauma Questionnaire (CTQ) [47], care este o măsură frecvent utilizată a maltratării în copilărie constând din 28 de itemi cu subscale de abuz fizic, sexual și emoțional și neglijare fizică și emoțională. Fiecare subscală constă din cinci itemi, plus trei itemi care servesc la controlul negării maltratării. Itemii sunt evaluați pe o scară Likert de 5 puncte (1 la 5), ​​cu scoruri mai mari indicând niveluri mai mari de maltratare. Scorurile sunt adunate pentru a calcula scorul total CTQ, care poate varia de la 25 la 125.

Evaluarea stresului cronic și a simptomelor depresive recente

Stresul cronic din ultimele 3 luni a fost evaluat cu Trier Inventory of Chronic Stress (TICS) [48,49]. TICS este o măsură de auto-raportare cu 12 articole privind frecvența comportamentelor legate de stresul cronic, cum ar fi „Îmi fac griji că nu voi putea să-mi îndeplinesc sarcinile” și „Am prea multe de făcut”. evaluat de la 0 (niciodată) la 4 (foarte des), iar elementele sunt adunate pentru a calcula scorul total de stres cronic, care poate varia de la 0 la 48.

Participanții care au efectuat TSST au completat, de asemenea, Beck Depression Inventory II BDI-II [50] pentru evaluarea simptomelor depresive recente. BDI-II este o măsură de auto-raportare cu 21 de itemi a simptomelor depresive recente (ultimele 2 săptămâni), cum ar fi tristețea, lipsa de speranță și autoînvinovățirea. Fiecare item este evaluat pe o scară de la 0 la 3, iar scorurile pot varia de la 0 la 63. Scorurile mai mari indică simptome depresive mai mari.

Evaluarea nivelului de cortizol și a reactivității la stres

Pentru evaluarea nivelurilor de cortizol ca răspuns la TSST, probele de salivă ale participanților au fost colectate folosind salivettes (Sarstedt, Rommelsdorf, Germania). Patruzeci și cinci de minute după prima extragere de sânge și chiar înainte de începerea TSST, participanții au furnizat mostre de salivă de bază și au fost apoi duși în camera TSST. TSST a fost efectuat așa cum este descris în Kirschbaum et al. [22]. Pe scurt, sarcina a constat într-o fază de pregătire (5 min), care a fost urmată de un discurs public (5 min) despre motivul pentru care participantul ar fi cel mai bun candidat pentru jobul său de vis și o sarcină de numărare inversă (5 min). . Sarcina a avut loc în fața unui comitet format din două persoane care nu a oferit feedback verbal sau non-verbal. Membrul activ al comitetului, care a dat instrucțiuni subiectului în timpul TSST, a fost întotdeauna de sex opus (femeie), iar membrul inactiv al comitetului, care nu a comunicat cu participantul, a fost întotdeauna de același sex (bărbat) ca și participantul. După TSST, participanții s-au întors în camera de testare inițială și au furnizat o al doilea eșantion de salivă imediat după TSST și au completat o scală vizuală analogică (VAS) cu 8 articole, evaluând experiența lor cu TSST, cum ar fi găsirea acestuia stresant, amenințător, sau provocatoare. Au fost colectate probe suplimentare de salivă la 10, 20, 30, 45, 60, 90 și 105 minute după TSST. Probele de salivă au fost păstrate la -20°C imediat după sesiune până când au fost expediate la Universitatea Brandeis, Boston, pentru analiza concentrației de cortizol. Fiecare probă a fost testată în duplicat utilizând un imunotest cu chemiluminiscență disponibil comercial (RE62019) cu o sensibilitate de 0,16 ng/ml (IBL International, Toronto, ON, Canada). Coeficienții de variație inter- și intra-testare au fost mai mici de 7% și, respectiv, 4%. Creșterea maximă a cortizolului a fost evaluată ca diferență între nivelul maxim de cortizol după TSST și valoarea de bază, așa cum a fost utilizată în studiile anterioare [23,24]. Pentru toți participanții, cel mai mare răspuns după TSST a fost observat în decurs de 10 până la 20 de minute după TSST. Am folosit răspunsul de vârf, mai degrabă decât aria sub curbă, ca măsură a reactivității cortizolului, deoarece primul este potențial mai strâns asociat cu modificările expresiei genelor, în timp ce cel din urmă poate fi asociat mai strâns cu producția hormonală generală [51].

Prelucrarea probelor de sânge

Pentru a începe cu un grup uniform de celule, celulele mononucleare din sângele periferic (PBMC) au fost izolate din sânge imediat după extragerea sângelui, folosind tuburi Leucosep® (Greiner Bio-One Inc., Monroe, NC, SUA) și Ficoll-Paque. (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, SUA) mediu de separare conform protocolului producătorului. Peletele izolate de PBMC au fost depozitate la -80°C pentru procedurile ulterioare de extracție a ADN și ARN.

Extracțiile de ADN și ARN din pelete PBMC au fost efectuate de kit-ul AllPrep DNA/ARN/Protein Mini (Qiagen, Valencia, CA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Cantitatea și calitatea ADN-ului și ARN-ului au fost evaluate prin NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, SUA), probele de ADN au fost stocate la -20 ° C, iar probele de ARN au fost depozitate la -80 ° C.

Genotiparea 5-HTTLPR și rs25531

Genotipul 5-HTTLPR a fost determinat prin amplificarea PCR a 25 ng de ADN la o temperatură de recoacere de 67,5°C utilizând primeri folosiți în lucrările anterioare [5]. Un subset aleatoriu de 24 de eșantioane a fost procesat de două ori de către un tehnician nevăzut de rezultatele inițiale pentru a stabili fiabilitatea testului-retestare, care a fost de 100%. Ca rezultat al genotipării, indivizii au fost genotipați ca S/S, S/L sau L/L.

Pentru genotiparea A/G SNP (rs25531), 6 μl din produsele PCR 5-HTTLPR au fost digerate cu 5 unități de HpaEnzima de restricție II (New England Biolabs, Ipswich, MA, SUA) timp de 3 ore la 37°C. Ca rezultat, indivizii au fost genotipați ca S/S, S/LA, S/LG, LA/LA, LA/LG, și euG/LG. Având în vedere această expresie a lui LG alela a fost sugerată a fi similară cu alela S [52], trialelic (S, LA, LG) schema de clasificare grupată S/LG și euG/LG indivizi ca „S/S” și LA/LG indivizi ca „L/S”. Distribuțiile genotipului au fost în echilibru Hardy-Weinberg în conformitate cu schemele de clasificare bialelice și trialelice (P > .05).

Analize de metilare a ADN-ului

Pentru analiza metilării ADN-ului, 500 ng ADN de la fiecare participant la momentul inițial au fost tratați cu bisulfit utilizând kitul Epitect Bisulfite (Qiagen, CA) conform instrucțiunilor producătorului și stocat la -20 ° C până când este utilizat în analizele de metilare. În plus, în toate analizele de metilare, probele de ADN uman nemetilate (0%) și complet metilate (100%) de 500 ng (Zymo Research, Irvine, CA, SUA) au fost tratate cu bisulfit împreună cu probele participanților pentru a fi utilizate ca conversie a bisulfitului. controale.

Metilarea globală a ADN-ului

Metilarea elementului nuclear lung intercalat-1 (LINIA 1) a fost utilizată ca măsură a metilării globale atât pentru investigarea asociilor cu ELS (similar cu [39]), cât și pentru controlul metilării globale atunci când se investighează metilarea specifică genei (similar cu [31]). LINIA 1 Metilarea a fost cuantificată în duplicat utilizând kitul PyroMark Q96 CpG LINE-1 (Qiagen, CA) într-un sistem PyroMark Q96 MD la Stony Brook University Genomics Core Facility, conform protocolului producătorului și cu primerii comerciali furnizați cu kit. Detaliile procedurii sunt prezentate în Fișierul suplimentar 1.

SLC6A4 Metilarea ADN-ului insulei CpG

Metilarea insulei CpG în amonte de SLC6A4 a fost cuantificată de sistemul Sequenom Epityper MassArray (San Diego, CA, SUA). Două seturi de primeri au fost proiectate pentru a amplifica cele 79 de situsuri CpG din insula CpG în doi ampliconi similari cu Philibert et al. [40] prin utilizarea software-ului Epityper (Sequenom, CA). Cu această tehnică, metilarea Unități CpG este analizat, care poate consta din unul sau mai multe site-uri CpG adiacente. Un total de 37 de unități CpG au fost acoperite de cei doi ampliconi, constând din 79 de site-uri CpG. Toate probele au fost prelucrate în trei exemplare. După preprocesare, datele de metilare de la 26 de unități CpG din ampliconii 1 și 2 au fost incluse în toate analizele (Figura 1). Detalii despre procedură, secvențele de primer și analiza datelor sunt oferite în fișierul suplimentar 1.

SLC6A4 Ampliconi insulă CpG pentru analiza metilării ADN-ului. Unitățile CpG analizate sunt numerotate de la 1 la 26. Exonul netradus se întinde pe Unitățile CpG de la 12 la 15 și 5-HTTLPR este situat în amonte de insula CpG. Asteriscurile arată unitățile CpG aparținând factorilor 1, 2 și 3 (de la F1 la F3). Încărcările factorilor F1 au variat de la .35 la .83, încărcările factorilor F2 au variat de la .37 la .76, iar încărcările factorilor F3 au variat de la .73 la .87.

Analiza expresiei genelor

Pentru fiecare participant, două mostre de ARN au fost utilizate pentru analizele expresiei genelor, una cu 45 de minute înainte de TSST (linia de bază) și alte 105 minute după TSST (răspuns). Înainte de cuantificarea expresiei genelor, integritatea probelor de ARN a fost evaluată utilizând Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SUA). Numerele de integritate ARN (RIN) ale probelor au fost mari (M = 7,94, SD = 1,32), iar RIN-urile probelor înainte și după TSST nu au diferit semnificativ (P = .853). Ulterior, 1 μg de ARN din fiecare punct de timp a fost convertit în cADN utilizând Kitul de transcripție inversă QuantiTect conform protocolului producătorului (Qiagen, CA). Probele de ADNc au fost apoi diluate de cinci ori și 1 μl de ADNc diluat a fost utilizat pentru analiza expresiei genelor a genelor candidate prin PCR cantitativă (qPCR), folosind kitul Qiagen SYBR Green PCR + UNG (Qiagen, CA) și gena -primeri specifici proiectați de pe site-ul web Roche Universal Probe Library (http://www.roche-applied-science.com/sis/rtpcr/upl/ezhome.html). Reacțiile qPCR au fost efectuate în trei exemplare în sistemul Roche 480 LightCycler (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, SUA) la o temperatură de recoacere de 60°C.

Pentru a identifica cele mai bune gene de referință în PBMC, expresia a șase gene de referință candidate a fost analizată din probe de ARN a cinci indivizi, obținute la punctele de referință și de timp de răspuns. Această metodă a identificat HPRT1 (hipoxantin fosforiboziltransferaza 1) și GAPDH (gliceraldehidă 3-fosfat dehidrogenază) ca cele mai bune gene de referință în PBMC. CT valorile care au fost obținute prin qPCR au fost apoi utilizate pentru a evalua modificarea expresiei genelor între probele de referință și de răspuns, folosind delta-delta-CT metoda [53]. Modificările în expresia genelor pentru fiecare probă, normalizate pentru genele de referință, sunt afișate ca valori ale modificării pliului, reprezentând schimbarea orificiului în SLC6A4 și NR3C1 după TSST relativ la valoarea de bază. Detalii despre analizele qPCR și secvențele de primer sunt date în fișierul suplimentar 1.

Analize statistice

Toate analizele statistice au fost efectuate folosind SPSS pentru Windows versiunea 16.0 (Chicago, IL, SUA), cu nivelul de semnificație setat la α = .05. Pentru a evalua dacă TSST a evocat cu succes un răspuns de cortizol, am folosit un ANOVA cu măsuri repetate pentru cele nouă probe de salivă colectate de-a lungul experimentului. Înainte de toate analizele, datele despre cortizol au fost testate pentru distribuția normală prin testul Kolmogorov-Smirnov. Din cauza încălcării normalității pentru probe în mai multe momente (P < .05), transformarea log a fost aplicată tuturor datelor despre cortizol. Din cauza încălcării sfericității (P < .05), a fost aplicată corecția Greenhouse-Geisser.

Pentru a examina corelațiile dintre variabilele de interes, coeficientul de corelație al lui Pearson (r) a fost utilizat pentru variabilele distribuite normal, iar coeficientul rho al lui Spearman (rs) a fost utilizat pentru variabilele nedistribuite normal. Corelațiile parțiale au fost utilizate după cum este necesar pentru a controla efectele unor variabile precum vârsta și LINIA 1 metilare.

Pentru a înțelege modelele de metilare de-a lungul insulei CpG și pentru a reduce numărul de variabile investigate, a fost efectuată o analiză factorială care acoperă cele 26 de unități CpG de pe insulă, similar cu Olsson. et al. [41]. Măsura Kaiser-Meyer-Olkin a adecvării eșantionării (.834) și testul Bartlett al sfericității (P < .001) a sugerat că analiza factorială este potrivită pentru setul de date. Ca rezultat al analizei, au apărut cinci factori care explică 75% din varianță. Cu toate acestea, deoarece mai puțin de trei variabile au fost încărcate în ultimii doi factori, au fost luați în considerare doar primii trei factori: Factorul 1 (F1), Factorul 2 (F2) și Factorul 3 (F3). Procentul de varianță explicat prin F1, F2 și F3 a fost 37, 15 și, respectiv, 12. Încărcările pe acești factori au fost astfel încât F1 a inclus în principal unități CpG la începutul insulei CpG până la începutul exonului, în timp ce F2 le-a inclus pe cele de la sfârșitul insulei și F3 a inclus o regiune mai scurtă spre sfârșitul insulei ( Figura 1).


INTRODUCERE

Controlul calității proteinelor (PQC) este esențial pentru menținerea homeostaziei proteinelor în celulele eucariote. Au fost identificate căi PQC specifice pentru mai multe compartimente celulare, inclusiv cele dedicate proteinelor pliate greșit în citosol (Eisele și Wolf, 2008 Heck et al., 2010 Nillegoda et al., 2010), nucleu (Gardner et al., 2005), membrana plasmatică (Zhao et al., 2013), și membrana reticulului endoplasmatic (Vembar și Brodsky, 2008). Într-adevăr, există chiar și căi PQC care atacă produsele de traducere defecte pe măsură ce ies din ribozom (Bengtson și Joazeiro, 2010 Brandman). et al., 2012 Defenouillere et al., 2013 Verma et al., 2013). Cu toate acestea, având în vedere diversitatea enormă a structurii și a localizării proteinelor, este probabil ca înțelegerea noastră a PQC să fie departe de a fi completă.

Analizând peisajul provocărilor cu care se confruntă biogeneza proteinelor, ne-am referit la ribozom ca o țintă interesantă pentru investigarea mecanicistă a PQC. Formarea ribozomilor în drojdie este un proces complicat care necesită transcripția ARNr 35S și 5S, procesarea ARNr primar 35S, translația și importul nuclear a 79 de proteine ​​ribozomale diferite și asamblarea ARNr-urilor și proteinelor ribozomale procesate în nucleol (Kressler). et al., 2010). Asamblarea ribozomilor nu este doar complexă, dar monopolizează și o fracțiune impresionantă a capacității biogene. În celulele de drojdie cu creștere rapidă, 60% din transcripția totală este dedicată ARNr-ului și 50% din transcripția ARN polimerazei II și 90% din splicing-ul ARNm sunt dedicate proteinelor ribozomale (Warner, 1999). Acest flux extraordinar pune o primă pe mecanismele PQC eficiente pentru a minimiza formarea și acumularea de componente inutilizabile. Cu toate acestea, în ciuda unei extinderi rapide a înțelegerii noastre a mecanismelor de reglare homeostatice pentru ribozomii asamblați, mecanismele homeostatice care monitorizează asamblarea ribozomilor și ajută celulele să facă față erorilor sau dezechilibrelor în procesul de asamblare rămân prost înțelese.

O întrebare simplă, dar profundă despre ansamblul ribozomilor se referă la modul în care celula controlează expresia genei ribozomale pentru a asigura producția stoichiometrică a tuturor proteinelor. Mai multe studii au sugerat că unele proteine ​​ribozomale pot fi produse în exces, iar celula menține un nivel adecvat al acestor proteine ​​prin degradarea celor neasamblate. Existența unui astfel de mecanism este susținută de mai multe linii de dovezi. De exemplu, proteinele ribozomale nou sintetizate sunt degradate rapid atunci când procesarea ARNr este afectată (Gorenstein și Warner, 1977 Warner, 1977). În plus, în celulele care adăpostesc copii suplimentare ale unei gene a proteinei ribozomale, supraproducția proteinei corespunzătoare nu poate fi detectată decât dacă se efectuează marcarea pulsului extrem de scurt (~45 s) (Abovich et al., 1985). Pe baza acestor observații, s-a propus ca unele proteine ​​ribozomale să fie sintetizate în mod normal la niveluri peste ceea ce necesită celulele, dar cantitățile în exces sunt degradate rapid, astfel încât să nu se acumuleze detectabil. Cu toate acestea, mecanismul prin care proteinele ribozomale supraproduse sunt degradate nu a fost explorat. Această ipoteză este susținută de două studii mai recente. Experimentele cu marcarea izotopilor stabili pulsați cu aminoacizi în cultura celulară demonstrează că proteinele ribozomale umane nou sintetizate sunt importate rapid în nucleol pentru a fi asamblate cu ARNr, iar excesul este degradat de proteazom (Lam). et al., 2007). În plus, în timp ce achiziția unui cromozom suplimentar în drojdie duce la creșteri proporționale ale nivelurilor de ARNm și proteine ​​pentru majoritatea genelor de pe cromozomul suplimentar (Torres et al., 2007, 2010), majoritatea proteinelor ribozomale nu cresc proporțional cu numărul de copii, ci sunt atenuate posttranslațional printr-un mecanism neidentificat (Dephoure). et al., 2014). Mecanisme multiple ar putea media degradarea excesului de proteine ​​ribozomale. În timp ce studiile la om implică proteazomul, nu a fost determinat dacă degradarea subunităților ribozomale observată de Lam et al. (2007) a fost legat de statutul de asamblare sau dependent de ubiquitinare. În celulele de drojdie, alte două mecanisme au fost legate de metabolismul ribozomilor. Celulele de drojdie lipsite de aminoacizi încapsulează ribozomii maturi existenți în autofagozomi într-un proces numit ribofagie (Kraft et al., 2008). În plus, celulele de drojdie supuse șocului termic formează granule de stres care conțin subunități 40S, iar acestea sunt, de asemenea, eliminate prin autofagie (Grousl et al., 2009).

În acest studiu, investigăm soarta proteinelor ribozomale care sunt produse în exces stoichiometric față de alte subunități ribozomale. Demonstrăm că proteinele ribozomale supraproduse nu se adună în mare parte în ribozomi și, în schimb, sunt rapid ubiquitinate și degradate în nucleu într-o manieră dependentă de proteazom.


Autorii îi mulțumesc lui GS și familiei sale pentru colaborarea lor activă și prietenoasă, O. Sthandier și M. Marchioni pentru ajutor tehnic, D. Cacchiarelli pentru sfatul științific, V. Silenzi pentru citirea manuscrisului, Telethon Network Genetic Biobanks (GTB12001F) pentru biologic mostre și SMART de Servier (https://smart.servier.com/) pentru designul figurii. Această lucrare a fost susținută parțial de granturi de la ERC-2019-SyG (855923-ASTRA), Telethon (GGP16213), Parent Project Italia, AIRC (IG 2019 Id. 23053) și PRIN 2017 (2017P352Z4) către I.B. Ministerul Spaniol al Economiei, Industriei și Competitivității (MEIC) (BFU2016-75008-P) către L.D.C.și Apeluri de cercetare Sapienza (RM118164363B1D21) către J.M.

Conceptualizarea și proiectarea lucrării au fost realizate de JM, LDC și IB. Experimentele au fost efectuate și analizate de JM, ML, FC, AR, VDC, DM, TS și LP. Analiza datelor bioinformatice a fost efectuată de EB, AS și AC. Schița originală a manuscrisului a fost scrisă de JM și IB. Proiectul a fost revizuit și editat de toți autorii.


Priveste filmarea: Taijutsu. Boruto: Naruto Next Generations (August 2022).