Informație

1.4.15.14: Putting It Together- Nevertebrate - Biologie

1.4.15.14: Putting It Together- Nevertebrate - Biologie



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

După cum am văzut, nevertebratele includ o gamă largă de animale, de la cele mai simple animale - bureții - până la complexele artropode și anelide. Amintiți-vă: animalele sunt grupate în funcție de structura și aspectul lor.

Animale simple

Acest videoclip ne prezintă „cel mai simplu” dintre animale. Diferențiem animalele după numărul de straturi de țesut pe care le au și după complexitatea acelor straturi.

Un element YouTube a fost exclus din această versiune a textului. Îl puteți vizualiza online aici: pb.libretexts.org/bionm2/?p=428

Animale complexe

Acest videoclip continuă explorarea noastră a nevertebratelor. Discutăm despre anelide și artropode mai complexe.

Un element YouTube a fost exclus din această versiune a textului. Îl puteți vizualiza online aici: pb.libretexts.org/bionm2/?p=428


Capitolul 15 Prelucrarea picăturilor

Protocoalele cu o singură celulă pe bază de picături urmăresc izolarea fiecărei celule în interiorul propriei picături într-o emulsie apă-în-ulei, astfel încât fiecare picătură să servească drept cameră de reacție în miniatură pentru prepararea bibliotecii cu multiplexări (Macosko și colab. 2015 Klein și colab. 2015). La secvențiere, citirile sunt atribuite celulelor individuale pe baza prezenței codurilor de bare specifice picăturilor. Acest lucru permite o creștere masivă a numărului de celule care pot fi procesate în experimente tipice scRNA-seq, contribuind la dominația 3 a tehnologiilor precum platforma 10X Genomics (Zheng et al. 2017). Cu toate acestea, deoarece alocarea celulelor la picături nu este cunoscută dinainte, analiza datelor necesită câțiva pași speciali pentru a determina ce conține de fapt fiecare picătură. Acest capitol explorează unele dintre cele mai comune proceduri de preprocesare care ar putea fi aplicate matricelor de numărare generate din protocoalele de picături.


Disclaimer: Acest răspuns conține linkuri TVTropes. Fii pregătit să pierzi câteva ore din timpul tău.

Cele două propoziții chiar înainte de cele pe care le-ați citat indică acest lucru au fost trimise cel puțin două (se folosește pluralul) și probabil mai multe („înconjurate”) Balrogs a opri Fëanor: Aceasta ne dă o limită inferioară.

Așa a fost că el (Fëanor) a tras mult înaintea dubei gazdei sale și, văzând asta, slujitorii lui Morgoth s-au întors spre golf și de acolo au ieșit din Angband Balrogs pentru a-i ajuta. Acolo, în limitele Dor Daedeloth, țara Morgoth, Fëanor a fost înconjurat, cu puțini prieteni în jurul lui. Silmarillionul

Problema principală constă în determinarea limitei superioare, deoarece populația totală de Balrogs a variat foarte mult în timpul redactării a ceea ce avea să devină ulterior Silmarillion, de la sute la cel mult șapte:

Au venit lupi și lupți, au venit o mie de Balrog, și au venit viermi și draci și Glaurung, Tatăl Dragonilor. Războiul Bijuteriilor, Analele Gri - Anul 472

230

Ideea că Morgoth a dispărut de o „gazdă” de Balrog a rezistat mult timp, dar într-o notă târzie tatăl meu a spus că doar foarte puțini au existat vreodată – „cel mult șapte”. Cartea poveștilor pierdute, Tomul 2, Căderea lui Gondolin

Limita superioară a numărului de Balrog lupți de Fëanor (inclusiv Gothmog) este, prin urmare, „trei până la o mie” (dar probabil nu mai mult de o duzină de top, vezi următorul rațional)

În continuare, să ne concentrăm asupra numărului de Balrog pe care i-a învins. as spune "niciuna", deoarece nu este menționată nicio ucidere în text, iar cei doi Balrog învinși de Echtelion și, respectiv, Glorfindel sunt văzuți ca mari afaceri în restul publicatului Silmarillion, care vizează o anumită coerență (vezi prefațele cărții).

De fapt, se pare că Balrogs respectă regula ConservationOfNinjutsu. În funcție de populația lor totală la momentul redactării, un singur Balrog ar putea fi considerat narativ ca orice, de la EliteMook la PhysicalGod:

Concepția timpurie a Balrog-urilor îi face mai puțin îngrozitori și cu siguranță mai distruși decât au devenit ulterior: au existat în „sute” (p. 170) și au fost uciși de Tuor și Gondothlim în număr mare: astfel cinci au căzut înaintea marelui lui Tuor. toporul Dramborleg, trei înaintea sabiei lui Ecthelion, și două zeci au fost uciși de războinicii casei regelui. Cartea poveștilor pierdute, Tomul 2, Căderea lui Gondolin


Utilizarea definițiilor

Utilizați foaia de calcul Excel&trade furnizată pentru a vă documenta răspunsurile. Toate calculele trebuie efectuate folosind formulele din foaia de calcul, acolo unde este cazul. Asigurați-vă că vă verificați foaia de lucru înainte de a trimite sarcina pentru a vă asigura că atunci când cititorul face clic într-o celulă, formula utilizată pentru a calcula răspunsul este vizibilă în bara de funcții.

Calcularea unui FTE

Amintiți-vă, un FTE se bazează pe numărul de ore desemnat necesar pentru a acoperi un anumit număr de ture într-o anumită perioadă de timp. Perioada de timp poate fi pe săptămână, pe perioadă de plată (de obicei două săptămâni) sau pe an. Un schimb este de 8 ore de timp lucrat. Mai jos sunt câteva exemple despre cum este calculat un FTE:

  • FTE = Numărul de ture alocate pentru a lucra în fiecare perioadă de plată. Un angajat cu normă întreagă lucrează 10 schimburi la fiecare două săptămâni, ceea ce înseamnă 80 de ore într-o perioadă de plată. Un angajat cu normă întreagă nu ar trebui neapărat să lucreze 10 schimburi atâta timp cât a lucrat 80 de ore. Cu toate acestea, în sensul acestui modul, toate turele trebuie considerate cu o durată de 8 ore, astfel încât angajatul trebuie să lucreze 10 ture pentru a fi considerat cu normă întreagă.
  • FTE = Ore lucrate și ore cedinte pe perioadă de plată pentru angajatul cu normă întreagă

FTE = 40 ore lucrate ¸80 ore = 0,50 FTE

  • Ore = FTE x Ore plătite pe perioadă de plată pentru angajatul cu normă întreagă
  • Ore = 0,50 FTE x 80 = 40 de ore (numărul de ore pe care un FTE de 0,50 FTE ar fi programat să lucreze într-o perioadă de plată)
  • Schimburi = Ore pe perioadă de plată ¸Ore într-o tură

Schimburi = 80 de ore pe perioadă de plată ¸8 ore = 10 ture pe perioadă de plată

10 schimburi = 80 de ore pe perioadă de plată = 1,00 FTE

9 schimburi = 72 de ore pe perioadă de plată = 0,90 FTE

8 schimburi = 64 de ore pe perioadă de plată = 0,80 FTE

7 schimburi = 56 de ore pe perioadă de plată = 0,70 FTE

6 schimburi = 48 de ore pe perioadă de plată = 0,60 FTE

5 schimburi = 40 de ore pe perioadă de plată = 0,50 FTE

4 schimburi = 32 de ore pe perioadă de plată = 0,40 FTE

3 schimburi = 24 de ore pe perioadă de plată = 0,30 FTE

2 schimburi = 16 ore pe perioadă de plată = 0,20 FTE

1 schimb = 8 ore pe perioadă de plată = 0,10 FTE

Pentru fiecare dintre următoarele scenarii, completați răspunsurile folosind cunoștințele dumneavoastră despre formulele de bază Excel din Foaia de lucru furnizată în Caseta de trimitere a sarcinilor:

O PERIOADA DE PLATĂ ORE

SINGURA PERIOADA DE PLATARE TURURI

Grozav. Acum ați învățat posibilitatea de a calcula numărul de ture și de ore pe care le lucrează un FTW desemnat într-o săptămână și într-o perioadă de plată. Folosind aceleași principii, puteți calcula, de asemenea, numărul de ore și ture pe care un FTE ar lucra într-o lună, un trimestru sau un an.

Următorul pas este acela de a putea calcula numărul de FTE necesari personalului timp de o săptămână pe baza numărului de ture necesare. Pentru a putea calcula acest număr, trebuie să știți următoarele:

  • FTE = Total Shifts ¸5 shifts (ture lucrate de 1 FTE pe săptămână)
  • FTE = Un RN lucrează 5 schimburi pe săptămână. Câți FTE sunt necesari?

Acum, e rândul tău din nou. Completați schimburile și FTE-urile lipsă, folosind formule Excel:


Salvați următoarele ca usbreset.c

Rulați următoarele comenzi în terminal:

Obțineți autobuzul și ID-ul dispozitivului dispozitivului USB pe care doriți să îl resetați:

Faceți executabil programul nostru compilat:

Executați programul cu privilegiul sudo, faceți o înlocuire necesară pentru ID-urile <Bus> și <Device>, așa cum este găsit prin rularea comenzii lsusb:

Nu m-am găsit până acum în circumstanțele dvs. specifice, așa că nu sunt sigur dacă va face suficient, dar cel mai simplu mod pe care l-am găsit pentru a reseta un dispozitiv USB este această comandă: (Nu sunt necesare aplicații externe)

Acesta este cel pe care îl folosesc pentru a-mi reseta Kinect-ul, deoarece libfreenect pare să nu aibă API pentru a-l restabili. Este pe caseta mea Gentoo, dar nucleul ar trebui să fie suficient de nou pentru a utiliza aceeași structură de cale pentru sysfs.

Evident, a dvs. nu ar fi 1-4.6, dar puteți fie să extrageți acea cale a dispozitivului din jurnalul dvs. de kernel ( dmesg ) sau puteți utiliza ceva de genul lsusb pentru a obține ID-urile furnizorului și al produsului și apoi utilizați o comandă rapidă ca aceasta pentru a enumera cum căile se referă la diferite perechi ID furnizor/produs:

Aceasta va reseta toate porturile USB1/2/3 atașate[1]:

Cred că asta vă va rezolva problema. Dacă nu doriți să resetați toate punctele finale USB, puteți utiliza ID-ul de dispozitiv corespunzător din /sys/bus/pci/drivers/ehci_hcd

Note: [1]: driverele de kernel *hci_hcd controlează de obicei porturile USB. ohci_hcd și uhci_hcd sunt pentru porturile USB1.1, ehci_hcd este pentru porturile USB2 și xhci_hcd este pentru porturile USB3. (vezi https://en.wikipedia.org/wiki/Host_controller_interface_(USB,_Firewire))

Am creat un script Python care simplifică întregul proces pe baza răspunsurilor de aici.

Salvați scriptul de mai jos ca reset_usb.py sau clonați acest depozit.

Aveam nevoie să automatizez acest lucru într-un script python, așa că am adaptat răspunsul extrem de util al lui LiLo la următoarele:

În cazul meu, a fost driverul cp210x (pe care l-am putut spune din lsmod | grep usbserial ), așa că puteți salva fragmentul de mai sus ca reset_usb.py și apoi faceți acest lucru:

Acest lucru ar putea fi util și dacă nu aveți deja o configurație de compilator c pe sistemul dvs., dar aveți python.

Cel mai rapid mod de resetare va fi resetarea controlerului USB în sine. Procedând astfel, udev va obliga să anuleze înregistrarea dispozitivului la deconectare și înregistrarea este din nou odată ce îl activați.

Acest lucru ar trebui să funcționeze pentru majoritatea mediului PC. Cu toate acestea, dacă utilizați hardware personalizat, puteți pur și simplu să parcurgeți numele dispozitivelor. Cu această metodă nu trebuie să aflați numele dispozitivului prin lsusb. Puteți încorpora și într-un script automat.

Folosesc un fel de baros reîncărcând modulele. Acesta este scriptul meu usb_reset.sh:

Și acesta este fișierul meu de serviciu systemd /usr/lib/systemd/system/usbreset.service care rulează usb_reset.sh după ce managerul meu de afișare a pornit:

Iată un script care va reseta doar un ID de produs/furnizor potrivit.

Deoarece cazul special al întrebării este o problemă de comunicare a gphoto2 cu o cameră pe USB, există o opțiune în gphoto2 pentru a-și reseta conexiunea USB:

Poate că această opțiune nu exista în 2010 când a fost pusă întrebarea.

Am făcut un script python care va reseta un anumit dispozitiv USB pe baza numărului dispozitivului. Puteți afla numărul dispozitivului din comanda lsusb.

În acest șir 004 este numărul dispozitivului

Încercați asta, este o deconectare software (Eject).

Uneori, nu funcționează, pur și simplu dezlegați dispozitivul pentru unele dispozitive.

Doresc să-mi elimin sau să scot „Genius NetScroll 120”.

Apoi îmi verific mai întâi dispozitivul USB atașat

Ok, mi-am găsit mouse-ul, are un Bus 002, Device 009, idVendor 0458 și idProduct 003a, deci acestea sunt informații despre dispozitiv de referință despre mouse.

Acest lucru este important, numărul magistralei este calea numelui de început către dispozitiv și voi verifica ID-ul produsului și furnizorul pentru a asigura dispozitivul corect de eliminat.

Fiți atenți la foldere, verificați începutul cu dosarul numărul 2, îl voi verifica pe acesta deoarece Autobuzul meu este 002 și, unul câte unul, am verificat fiecare folder care conține idVendor și idProduct corect despre informațiile mouse-ului meu.

În acest caz, voi prelua informațiile cu această comandă:

Ok, calea /sys/bus/usb/drivers/usb/2-1.3/ se potrivește cu mouse-ul meu de informații! XDDD.


Partea 2: Imaginile Glycome

00:00:06.26 Deci bun venit la a doua prelegere din serie
00:00:09.00 numit Glicobiologie chimică.
00:00:11.07 Numele meu este profesorul Carolyn Bertozzi.
00:00:13.26 Sunt la departamentul de chimie la UC Berkeley,
00:00:17.21 cu, de asemenea, o întâlnire în Departamentul de Biologie Moleculară și Celulară
00:00:21.11 și sunt, de asemenea, un investigator al Institutului Medical Howard Hughes.
00:00:25.06 I.. Aceasta este a doua parte a unei serii în două părți.
00:00:28.23 Prima parte sa concentrat pe fundal și istorie
00:00:32.09 despre domeniul glicobiologiei și structurile zaharurilor.
00:00:36.18 Și această parte, care este partea a doua, se va concentra mai mult
00:00:40.26 despre unele cercetări recente din propriul meu laborator din Berkeley
00:00:43.25 cu scopul de a imagistica glicomul.
00:00:46.18 Și, de fapt, ceea ce te uiți aici este
00:00:49.07 o imagine fluorescentă a unui pește-zebră
00:00:53.06 care are cinci zile în care unele dintre zaharuri au fost etichetate
00:00:57.24 cu molecule fluorescente și asta ne permite să vizualizăm literalmente acele zaharuri
00:01:02.18 într-un organism viu. Și lasă-mă să-ți spun despre
00:01:06.15 de ce ne interesează asta.
Bine, acum domeniul imagistică moleculară este cu siguranță mare
00:01:13.15 și se extinde rapid, și este foarte important
00:01:16.28 atât din perspectiva medicinei clinice
00:01:19.15 precum și în laboratorul de cercetare.
00:01:22.15 Atâția dintre voi s-ar putea să vă fi trezit întinși pe o masă ca asta
00:01:26.14 la un moment dat în viața voastră, la fel ca și mine.
00:01:29.05 Acesta este un scaner pentru imagistică prin rezonanță magnetică sau un scaner RMN
00:01:34.24 și ce poate face acest scaner
00:01:36.26 înseamnă să faci o poză a moleculelor
00:01:39.29 în interiorul corpului nostru fără a fi nevoie să ne deschidem.
00:01:42.24 Ceea ce este foarte convenabil pentru mulți dintre noi.
00:01:44.26 Și există dispozitive foarte asemănătoare cu acesta care permit
00:01:49.13 clinicienii să se uite la alte molecule din corpul nostru,
00:01:52.00 molecule care sunt radiomarcate, de exemplu.
00:01:54.15 Și asta este această imagine aici. Aceasta se numește scanare PET.
00:01:59.00 a unui corp uman care a fost injectat cu o versiune radiomarcată de glucoză.
Acestea sunt instrumente importante pentru analizarea moleculelor în medii clinice.
00:02:09.28 dar ne place să ne uităm și la molecule în mediile de cercetare
00:02:12.16 în special pentru a înțelege ce fac moleculele în interior
00:02:16.02 celule vii și în zilele noastre avem unele minunat avansate
00:02:20.06 instrumente de microscopie cu fluorescență
00:02:22.10 care ne permit nu doar să vedem colecțiile de molecule din celule,
00:02:26.12 dar și molecule fluorescente individuale.
Deci este un moment foarte interesant pentru a face imagini moleculare în sistemele vii.
00:02:34.24 Acum, am menționat în prima mea prelegere că una dintre cele mai multe
00:02:38.29 aspecte interesante ale glicobiologiei este faptul că
00:02:43.15 glicomul sau colecția completă de glicani pe care o produce o celulă
00:02:48.09 este dinamic. Nu este fix.
00:02:50.19 Deci, glicomul sau colecția de zaharuri de pe suprafața unei celule
00:02:55.21 când este într-o anumită stare
00:02:57.12 este diferită de colecția de zaharuri din aceeași celulă
00:03:00.27 când celula și-a transformat starea.
Acesta este cu siguranță cazul când celulele stem embrionare
00:03:07.11 alege o soartă de diferențiere
00:03:10.00 și apoi devin o celulă diferențiată,
ca o celulă musculară sau un neuron. Dacă te uiți la colecția de
00:03:16.02 glicanii de pe suprafața celulelor glicolipidele și glicoproteinele,
veți descoperi că natura acelei colecții s-a schimbat
00:03:23.01 deoarece celula a suferit un proces de diferențiere.
00:03:26.12 Din perspectiva medicinei clinice,
00:03:30.07 este interesant de observat că glicomul se modifică atunci când celulele sănătoase
00:03:34.18 se transformă și devin celule canceroase.
00:03:37.28 Deci, puteți înțelege dacă zaharurile de pe suprafața celulei
00:03:42.02 se schimbă într-un mod care este caracteristic unei stări canceroase,
00:03:46.06 ar fi foarte convenabil să vedem
00:03:49.19 acele zaharuri se schimbă in vivo, la ființele umane vii.
Pentru că asta ar oferi posibilitatea de a imagina acele schimbări
00:03:58.15 și detectarea cancerelor atunci când se speră că sunt în stadii foarte incipiente.
00:04:02.17 Deci, există multe motive pentru care cineva ar dori să imagineze glicomul,
00:04:07.11 pentru a arunca o privire la modul în care acele zaharuri se schimbă în interiorul subiecților vii.
Deci putem înțelege cum se leagă glicanii cu diferențierea celulelor
00:04:17.06 sau la organogeneză. Și putem detecta modificări ale glicomului
00:04:22.20 care se corelează cu stările de boală.
00:04:24.23 Pentru a putea detecta acele boli în stadii foarte timpurii.
00:04:29.11 Provocarea, desigur, este să descoperi cum să etichetezi aceste molecule de zahăr cu
00:04:35.14 sonde pe care le putem vizualiza efectiv folosind tehnologii de imagistică.
00:04:40.16 Deci, chiar și în laboratorul de cercetare, acest lucru este foarte provocator.
00:04:43.22 Cea mai des folosită tehnică de imagistică în laboratoarele de cercetare
00:04:48.05 este imagistica prin fluorescență sau imagistica optică.
Și nici măcar nu avem o modalitate de a pune etichete fluorescente
00:04:55.02 despre aceste zaharuri. Deci asta este o provocare
00:04:57.24 că studenții și bursierii postdoctorali
00:05:00.02 în laboratorul meu au preluat.
Și este un proiect la care am început să lucrăm la sfârșitul anilor 1990.
Așa că progresează acum de peste zece ani.
00:05:09.21 Doar ca să-ți dau un pic de contrapunct,
00:05:12.17 oameni care studiază proteinele folosind tehnici de imagistică moleculară,
00:05:16.22 au la dispoziție un arsenal minunat de instrumente,
00:05:20.18, motiv pentru care imagini precum cea pe care am arătat-o ​​în diapozitivul anterior
00:05:24.06 sunt atât de comune și atât de familiare.
pentru majoritatea biologilor celulari. De fapt,
00:05:28.15 majoritatea biologilor celulari își petrec probabil o bună parte din zi
00:05:31.22 privind imagini similare cu aceasta.
În această celulă au fost marcate două proteine ​​diferite
00:05:37.14 cu doi coloranți fluorescenți diferiți,
00:05:39.28 unul verde și unul roșu.
Și proteina care pare verde a fost etichetată folosind un reporter codificat genetic.
00:05:47.03 Așa că lasă-mă să-ți arăt ce este acel reporter.
Se numește proteina verde fluorescentă,
00:05:52.19 abreviat GFP și este unul dintre cele mai importante instrumente pentru imagistica prin fluorescență
00:05:59.21 de proteine. Proteina verde fluorescentă, deoarece este o proteină care este codificată de o genă,
00:06:05.01 și se dovedește că se poate fuziona gena care codifică GFP
la gena care codifică proteina care vă interesează imagistica.
Și acum, când fuziunea proteinei GFP este exprimată,
Practic, proteina ta de interes este marcată cu o moleculă fluorescentă.
GFP are un cromofor în interior care este fluorescent.
Și acesta este un instrument atât de important. Ne-a revoluționat abilitățile
00:06:31.08 pentru a studia proteinele, nu doar în celulele vii, ci chiar și în organismele transgenice.
00:06:35.19 pe care le exprimăm aceste fuziuni GFP prin manipularea genomului
00:06:40.20 în stadiul de celule stem embrionare.
00:06:42.22 Acest lucru este atât de important încât a fost recunoscut cu Premiul Nobel pentru Chimie
00:06:47.03 în anul 2008, iar acel premiu a fost acordat acestor trei oameni de știință.
00:06:52.00 Foarte bine meritat. Dezvoltare foarte interesantă
00:06:54.23 în domeniul imagistică moleculară.
00:06:56.22 Acum, cei dintre noi care studiem glicobiologia, bineînțeles,
Ne-ar plăcea dacă am avea un instrument care să fie comparabil
la proteina verde fluorescentă.
Pentru a ne eticheta zaharurile cu o etichetă fluorescentă,
modul în care oamenii etichetează proteinele cu această etichetă fluorescentă.
00:07:12.16 Dar, din păcate, mașinile de biosinteză,
00:07:17.17 prin care sunt construite zaharurile, nu prea se pretează
acestor reporteri codificați genetic.
Asta pentru că zaharurile, spre deosebire de proteine, nu sunt produse genetice primare.
Fiecare dintre acești glicani complexi nu este codificat de o singură genă.
Mai degrabă, sunt produsele unei serii complexe de
00:07:38.26 pași metabolici în interiorul celulei.
Sunt produse ale metabolismului.
00:07:43.21 Și, din acest motiv, nu putem folosi reporteri codificați genetic, cum ar fi GFP
00:07:48.02 pentru a introduce etichete pe zaharuri.
00:07:50.17 Așa că am desenat acest desen animat ca pe un fel de comedie, pentru că ne-ar plăcea
00:07:54.24 pentru a putea pune o etichetă precum GFP pe zaharuri,
00:07:57.18 dar nu există într-adevăr niciun mecanism care să facă asta folosind genetica.
Deci, în laboratorul meu, ne-am concentrat
00:08:04.21 despre utilizarea căilor metabolice ale celulei.
pentru a introduce sonde fluorescente în zaharuri
care nu sunt GFP, ci mai degrabă reporteri fluorescenți cu molecule mici.
00:08:17.18 Și permiteți-mi să vă arăt schematic cum facem asta.
Este un proces în două etape și noi numim această etichetare metabolică a glicanilor.
00:08:27.14 cu reporterii chimici.
Primul pas este să hrănești celulele cu un sintetic
00:08:33.14 bloc de construcție monozaharide
00:08:35.17 Acum, acest zahăr sintetic seamănă foarte mult cu unul dintre cele naturale.
00:08:40.08 blocuri monozaharide pe care le-ai putea găsi
00:08:43.06 în alimentele pe care le mănânci și am introdus acele structuri în prima mea prelegere.
00:08:47.26 Dar diferența este că am modificat structura
00:08:51.07 din acest bloc de construcție monozaharide de introdus
00:08:54.22 o grupă funcțională chimică „X”
00:08:57.14 și „X” este doar genericul pentru moment,
00:08:59.08 și într-un minut vom ajunge la ce este asta.
00:09:00.23 Dar „X” este ceea ce noi numim reporterul chimic.
Este un grup funcțional reactiv
00:09:07.05 astfel încât atunci când celula ia această monozaharidă
00:09:10.18 bloc de construcție, iar când enzimele îl procesează și îl integrează în glicani,
00:09:15.29 când glicanul apare pe suprafața celulei, acel grup funcțional reactiv
00:09:20.07 este acum afișat și poate fi folosit într-un al doilea pas
00:09:24.09 care este o reacție chimică cu o moleculă sondă.
Acum, sonda este un colorant fluorescent, de exemplu.
Și sonda aceea are propriul ei grup funcțional chimic, să-i spunem „Y”.
doar ca o etichetă generică. Dar „X” și „Y” trebuie proiectate
00:09:40.15 așa că reacționează unul cu celălalt pentru a forma o legătură.
00:09:43.29 Și odată ce acea legătură este formată
Acum există o moleculă sondă fluorescentă
00:09:49.20 legat de un glican de suprafață celulară.
Și acea sondă ne permite acum să vizualizăm toți glicanii.
00:09:57.01 care posedă această monozaharidă roșie
00:09:59.17 bloc ca unul dintre constituenții lor.
00:10:01.29 Deci, aceasta este o schema foarte simplă
00:10:05.19 în sensul că ceea ce trebuie să facem este să hrănim celulele cu zahăr modificat
00:10:09.15 și apoi faceți o reacție chimică pe acel zahăr
00:10:12.27 odată ce a fost afișat pe suprafața celulei cu o sondă.
00:10:15.21 Dar sa dovedit că a existat o provocare chimică foarte semnificativă.
00:10:20.08 încorporat în această problemă pentru că trebuie să selectăm
00:10:24.03 reporterul chimic „X” și un grup funcțional complementar „Y”,
00:10:29.09 astfel încât aceste două grupuri funcționale să reacționeze
00:10:33.00 numai unul cu celălalt și nu cu nimic altceva în interiorul acestei celule.
00:10:38.25 Și permiteți-mi să vă spun, există o mulțime de funcționalități în interiorul acestei celule.
00:10:43.21 Toate proteinele și lipidele, acizii nucleici,
00:10:47.15 metaboliți, există apă, știi, există o mulțime de entități chimice în interiorul acestei celule
00:10:53.27 și „X” și „Y” trebuie proiectate pentru a evita orice reacție secundară
00:10:58.26 cu acele grupuri biologice și totuși reacționează doar între ele.
Deci a fost o provocare destul de importantă
00:11:06.11 și am întruchipat acel concept al acelei provocări
00:11:09.12 cu acest termen „bioortogonal”.
Deci, ceea ce înseamnă literalmente nu este interacțiunea cu biologia.
00:11:18.07 „X” și „Y” trebuie să reacționeze reciproc și selectiv unul cu celălalt.
00:11:22.10 Ei nu pot reacționa cu nimic
00:11:24.07 care este găsit în natură. Și, desigur, cu siguranță nu pot fi dăunătoare
00:11:28.09 la sistemul biologic aflat în studiu
00:11:30.25 altfel ar fi un dezastru din perspectiva
00:11:34.10 imagistica zaharurilor la animalele vii.
00:11:36.15 Așa că am petrecut mulți ani încercând să creăm reacții care
00:11:42.24 se potrivesc practic cu această descriere în care cei doi
00:11:45.27 omologii reactivi, X și Y, sunt bioortogonali.
Și pentru a scurta povestea, ceea ce am descoperit este că
00:11:55.14 un reporter chimic ideal, grupul X pe care îl punem în zahăr
00:12:00.16 este azida, care este definită ca având
00:12:04.12 trei atomi de azot legați unul de altul
00:12:06.10 într-un mod care este prezentat aici.
00:12:08.26 Acum azida are o serie de proprietăți care o fac foarte potrivită
00:12:14.04 pentru această aplicație specială ca reporter chimic.
00:12:17.04 În primul rând, azidele nu se găsesc în sistemele biologice.
00:12:22.03 Din câte știm, chimiștii au inventat azida.
00:12:26.06 Nu l-am găsit în natură.
00:12:27.25 Poate că natura a trecut cu vederea acest grup funcțional
00:12:29.27 când ea crea toate substanțele chimice
diversitatea care se găsește pe planeta noastră.
00:12:34.22 În plus, azidele sunt în esență inerte în sistemele biologice.
00:12:39.29 Nu sunt prea multe cu care să poată reacționa
00:12:41.22 care se găsește în mod normal într-un mediu biologic.
00:12:45.22 Azidele sunt foarte ușor de atașat la moleculele de zahăr.
00:12:50.14 Chimia este foarte simplă.
Și, mai important, azidele sunt mici.
Deci raza unei azide a lui van der Wahl este de doar aproximativ 2,4 Angstroms.
00:12:59.22 Ceea ce înseamnă că este puțin mai mare decât un grup metil.
Și asta este important pentru că atașăm o azidă unui zahăr.
00:13:08.11 și apoi întrebând toate enzimele
00:13:09.23 în interiorul celulei pentru a metaboliza acel zahăr ca și cum
a fost un substrat metabolic normal.
Și așa că nu putem schimba prea mult structura,
00:13:18.12 altfel acele enzime ar putea respinge
acel zahăr ca fiind prea străin, prea nenatural.
00:13:23.25 Dar azida este o modificare destul de mică.
Ne-am gândit că poate l-am putea strecura prin uşă.
00:13:28.18 a unora dintre acele enzime.
Permiteți-mi să spun doar un punct pentru că
00:13:33.08 Mi se pune frecvent această întrebare
00:13:34.20 printre biologi. Mulți biologi sunt familiarizați cu cuvântul azidă
00:13:40.08 în contextul azidei de sodiu
și știu că azida de sodiu este o otravă metabolică.
00:13:46.27 Ei pun adesea un pic de azidă de sodiu în tampoanele lor
00:13:51.01 pentru a preveni creșterea bacteriilor. Deci ei știu că azida de sodiu este citotoxică.
00:13:55.08 și de aceea mă întreabă: „Azidele nu sunt citotoxice?
00:13:59.04 Cum poți pune o azidă pe un zahăr
00:14:00.18 și îl hrănesc celulelor și îl hrănesc organismelor? Nu este toxic?"
00:14:03.24 Răspunsul este nu. Azida de sodiu este o entitate foarte diferită
00:14:08.11 din azide atașate la o moleculă.
00:14:11.14 Deci, odată ce azida este atașată la o moleculă precum zahărul,
00:14:14.19 este total inofensiv. În schimb, dacă azida este o sare ca azida de sodiu,
00:14:20.02 ai dreptate, atunci este foarte toxic.
00:14:21.25 Dar nu trebuie să ne facem griji pentru asta.
00:14:24.01 pentru că nu există nicio modalitate în corpul tău de a transforma o azidă de zahăr
00:14:28.03 la ceva ca azidă de sodiu.
00:14:30.14 Deci, nu-ți face griji pentru asta.
00:14:31.24 Bine. Acum, ce este cel mai important despre azidă
00:14:35.16 este că azida poate suferi chimicale
00:14:38.20 reacții cu alte grupuri funcționale
00:14:41.12 care amintesc că în diapozitivul anterior le-am numit Y.
00:14:44.06 Celălalt grup este Y. Acest grup este X.
00:14:46.18 Există mai multe grupuri Y diferite care reacţionează cu azide.
00:14:50.27 Și primul astfel de grup pe care l-am explorat
00:14:54.03 este o fosfină. Deci o fosfină este ceea ce primești atunci când iei un atom de fosfor
00:14:59.18 și îi legați trei substituenți așa cum am arătat aici.
00:15:03.25 Acum, la începutul secolului al XX-lea.
00:15:07.27 Vorbim între 1915 și 1920,
00:15:11.12 un chimist german pe nume Hermann Staudinger
00:15:14.28 a descoperit că fosfinele vor reacționa cu azide pentru a genera
00:15:20.17 un produs în care există o legătură fosfor-azot
și a numit acest tip de intermediar aza-ilidă.
Este o reacție foarte interesantă prin faptul că acestea
00:15:30.22 două grupuri chimice se unesc și fac acest covalent
00:15:34.22 aduct. Am fost intrigați de această chimie Staudinger
00:15:38.29 deoarece atât fosfinele, cât și azidele sunt bioortogonale
00:15:43.08 și reacția lor este foarte selectivă. Sunt foarte non-toxice.
00:15:47.27 Și părea să îndeplinească multe dintre aceste criterii de bioortogonalitate.
00:15:52.07 Cu o singură excepție. Se dovedește că aza-ylides
00:15:55.16 nu sunt deosebit de stabile în apă.
00:15:58.00 Au tendința de a se hidroliza.
Deci legătura P-N este scindată.
Și, desigur, dacă scopul nostru este să folosim chimia
00:16:05.22 pentru a atașa o sondă la un zahăr din corpul viu
00:16:09.10 unde suntem înconjurați de apă
Atunci sensibilitatea hidrolitică ar fi o problemă majoră pentru o aza-ilidă.
Deci, ceea ce am făcut a fost că am modificat această reacție într-un mod destul de subtil
00:16:22.19 unde am atașat atomului de fosfor un inel de benzen
00:16:26.18 care avea această grupă metoxicarbonil.
00:16:29.01 Așa că acum, odată ce aza-ilida s-a format
00:16:32.18 mai repede decât s-ar putea hidroliza, acest atom de azot
00:16:35.16 ciclizat la acest carbonil, scindat legătura ester,
00:16:39.18 și a format o amidă.
00:16:41.29 Și această ciclizare a fost atât de rapidă încât nu a făcut-o
00:16:45.04 chiar contează dacă era apă în jur.
00:16:47.09 Acum, odată ce acest produs a fost format,
00:16:49.08 apa ar putea veni la îndemână
00:16:51.15 a hidrolizat legătura P-N și a format acest produs, dar acum, pentru că o amidă
Legătura 28 s-a format în timpul acestei etape de ciclizare intramoleculară
00:17:01.04 aceste două părți, una care a venit din azidă
00:17:04.00 celălalt atașat la fosfină
00:17:06.14 erau încă legate între ele printr-o legătură foarte stabilă.
Deci asta este ceea ce numim ligatura Staudinger.
00:17:13.18 Este o reacție în care profităm de chimia clasică Staudinger
00:17:19.02 în primul pas, dar apoi îl modificăm pentru a forma un produs
00:17:22.20 în care cele două componente sunt permanent
00:17:24.14 legate împreună într-un mod care este
00:17:26.08 foarte stabil într-un sistem biologic.
Și ligatura Staudinger a fost una dintre primele
00:17:32.06 reacții chimice pe care le-am folosit pentru a încerca să imaginăm zaharurile din sistemele vii.
Deci ce zaharuri ai vrea să imaginezi?
Desigur, există multe opțiuni interesante.
00:17:44.08 Și așa cum am prezentat în prima mea prelegere,
00:17:46.24 la vertebrate există nouă
00:17:49.07 blocuri fundamentale de monozaharide
care sunt constituenții diferiților noștri glicani.
00:17:55.04 Toți sunt interesanți în sine,
00:17:58.01 dar când ne gândeam la ce zahăr ne-ar plăcea să ne imaginăm,
am fost atrași în mod natural de această monozaharidă,
00:18:05.24 numit acid sialic. Și așa cum am menționat în prima mea prelegere,
acidul sialic tinde să apară în anumite circumstanțe foarte interesante
00:18:15.08 în sistemele biologice ale vertebratelor.
00:18:18.12 Am menționat, de exemplu, acel acid sialic
00:18:21.01 este o componentă a ligandului pentru selectine.
00:18:24.27 Am menționat și acidul sialic
00:18:27.01 este structura de care se leagă virusul gripal.
Ei bine, se pare că acidul sialic este o monozaharidă destul de ocupată.
00:18:36.20 pentru că pare să aibă legătură și cu dezvoltarea embrionară
00:18:40.19 și la cancer. De fapt, glicomii celulelor embrionare,
diferențierea țesuturilor, precum și a celulelor canceroase
00:18:49.14 au fost studiate în detaliu
00:18:52.15 și se dovedește că mulți dintre glicani
00:18:54.25 găsit atât embrionar, cât și pe cancer
00:18:57.22 au acid sialic ca unul dintre constituenții lor.
00:19:00.19 Deci ceea ce am arătat aici sunt doar trei exemple dintr-un set mult mai mare.
00:19:05.03 Acestea sunt structuri de glicani care s-au dovedit a fi foarte ridicate
00:19:10.25 privind cancerele în comparație cu omologul normal al țesuturilor sănătoase.
00:19:14.14 Și multe dintre ele sunt, de asemenea, reglementate de dezvoltare.
00:19:17.29 ceea ce probabil nu este un accident, pentru că știm că adesea cancer
00:19:22.14 începem să dobândim proprietăți pe care noi
00:19:25.12 se asociază în mod normal cu țesutul embrionar.
Și-au cam pierdut identitatea
00:19:30.11 și revin la o stare embrionară.
și asta se reflectă în structurile lor de glicani.
Deci acid polisialic care este un homo-polimer
00:19:38.28 format din unități repetate de acid sialic
este foarte abundent pe o varietate de tumori
00:19:44.13 care sunt derivate din țesutul crestei neurale.
00:19:46.16 Sialyl Lewis X, despre care am menționat-o mai înainte
00:19:50.02 face parte din ligand pentru selectine,
00:19:54.02 se găsește, de asemenea, în niveluri ridicate pe o varietate de cancere epiteliale diferite.
00:19:57.08 și cancere de sânge. Și Sialyl Tn, o dizaharidă foarte simplă,
00:20:03.12 nu se găsește în mod normal pe niciun țesut uman sănătos
dar apare pe o varietate de cancere de prostată.
00:20:11.03 și nu știm cu adevărat de ce,
00:20:12.29 dar faptul că aceste structuri apar în contextul bolilor maligne
00:20:18.06 a sugerat multor oameni că ar putea exista
niveluri crescute de acizi sialici pe aceste țesuturi.
Deci, dacă am putea imagina acizii sialici,
Poate am putea detecta aceste tumori în sistemele vii.
00:20:31.25 Asta a fost una dintre motivațiile de a studia acizii sialici.
00:20:35.25 Bine. Atunci întrebarea a devenit, în mintea noastră,
Cum punem o azidă în acizii sialici?
Ei bine, trebuie să înțelegem metabolismul fundamental
00:20:46.22 care produce acid sialic în corpul nostru.
00:20:50.05 Și asta este ceea ce este arătat în acest slide.
Totul începe cu această simplă monozaharidă
00:20:56.23 bloc de construcție numit N-acetilmanozamină.
00:21:00.08 și prescurtăm acel ManNAc pe scurt.
00:21:03.14 Deci mănânci ManNAc și, de fapt, dacă mănânci pâine sau bei bere,
Orice produs de drojdie va avea niște ManNAc.
00:21:11.21 Dacă nu mănânci ManNAc, e în regulă
00:21:14.15 deoarece poți să-l biosintetizezi din glucoză
prin alți pași enzimatici pe care nu i-am arătat.
00:21:20.27 Dar, în orice caz, odată ce ManNAc intră în sistem,
practic are o singură soartă metabolică.
Este destinat să fie transformat în acid sialic.
00:21:28.27 în celulele dumneavoastră. Și asta se întâmplă printr-o serie de pași enzimatici
00:21:34.18 și nu voi trece prin toate aceste detalii.
00:21:37.18 Cu siguranță poți privi diapozitivul în detaliu dacă ești interesat.
00:21:40.17 Dar este suficient să spui că mănânci acest zahăr
și după ce toate aceste enzime au acționat asupra ei
00:21:46.29 la sfârșitul zilei se face un acid sialic,
și apare de obicei la sfârșitul lanțului complex de glicani
00:21:54.19 pe suprafața celulei tale, fie sub formă de glicoproteine ​​sau glicolipide.
00:21:58.13 Așa că am știut din munca multor laboratoare
00:22:01.17 că acest zahăr este transformat în acest zahăr.
Și am arătat grupul acetil în albastru.
Ca să fie clar unde ajunge asta în produsul biosintetic.
00:22:11.28 Și motivul pentru care subliniez acea grupă acetil
00:22:14.12 se datorează faptului că știm din munca mai multor grupuri
00:22:17.27 că poți face modificări subtile
00:22:20.22 la structura din această poziţie fără
00:22:23.14 dăunând semnificativ eficienței
00:22:26.13 oricare dintre acești pași enzimatici,
00:22:28.06 ceea ce este cu adevărat remarcabil dacă te gândești la asta.
00:22:30.23 În mod normal, ne gândim la enzime ca fiind foarte specifice
00:22:34.18 pentru substraturile lor, dar în această cale
00:22:37.26 există un pic de libertate și tu
poate modifica puțin acest lanț lateral.
00:22:41.26 Deci, știind asta, era clar pentru noi că acesta era un site
00:22:46.08 că am putea să atașăm o azidă
00:22:48.16 fără a confunda enzimele din celulă.
Și exact asta am făcut.
Deci prin sinteză chimică generăm această versiune nenaturală
00:22:59.04 de ManNAc, care are o azidă.
00:23:01.21 Deci, ca abreviere numim acest compus ManNAz
00:23:06.04 unde este versiunea azidă a ManNAc.
Și am vrut să aducem ManNAz în celule, așa că pentru a face asta am
00:23:15.12 blochează fiecare dintre grupările hidroxil, care sunt caracteristice moleculelor de zahăr
00:23:19.29 cu esteri acetilici. Acestea sunt grupuri protectoare.
00:23:24.13 Deci, odată ce grupările acetil sunt la locul lor, zahărul este acum suficient de lipofil
00:23:29.21 că va pătrunde prin membrana celulei și, odată ce este în interiorul celulei,
avem esteraze nespecifice care pur și simplu se scindează
00:23:38.25 aceste grupuri de acetil sunt îndepărtate și aruncați-le.
Și apoi zahărul este gata pentru metabolism.
Deci enzimele încep să prelucreze zahărul
și după câteva ore, ceea ce am descoperit este că,
00:23:48.15 iată, o parte din reziduurile de acid sialic
00:23:52.07 pe aceste celule au fost înlocuite cu un analog azido.
00:23:56.23 Deci, cu alte cuvinte, tot ceea ce facem este să adăugăm acest compus în mediul de cultură celulară,
00:24:01.16 și celulele fac toată munca grea
și produc acest acid azido-sialic pe glicanii de suprafață celulară.
În mod remarcabil, celulele nu par în mod deosebit
00:24:11.28 jignit de această transformare.
00:24:13.26 O parte din acizii lor sialici
00:24:16.18 au fost înlocuite cu această variantă nefirească
00:24:18.29 și asta pare în regulă pentru ei.
00:24:21.16 Dar este foarte convenabil pentru noi
00:24:22.28 pentru că acum putem folosi azida pentru a face chimie.
00:24:26.18 Și așa prin introducerea unui reactiv fosfină,
care a fost legat de o sondă fluorescentă, noi
00:24:32.13 faceți o legătură Staudinger între fosfină și azidă.
Acum există o legătură covalentă între molecula sondă și zahăr.
00:24:40.22 Deci, oriunde există un acid sialic,
Acum îl putem vizualiza
00:24:44.06 folosind microscopia cu fluorescență concentrându-se pe sondă.
00:24:47.12 Și așa am reușit să ne imaginăm
00:24:50.17 acizi sialici pe o varietate de tipuri de celule interesante.
Iar acidul sialic nu este singurul zahăr
00:24:56.29 pe care îl putem vedea folosind azida ca reporter chimic.
Deci, așa cum putem introduce azida în acid sialic,
00:25:05.07 prin hrănirea celulelor ManNAz.
Se pare că putem introduce o azidă în fucoză
00:25:11.22 pur și simplu prin hrănirea celulelor cu acest derivat de fucoză 6-azido
00:25:16.23 care are esteri acetil care îi protejează grupările hidroxi.
00:25:19.26 Și, de asemenea, putem introduce azide în N-acetilgalactozamină
00:25:25.18 sau GalNAc, prin hrănirea celulelor cu această formă modificată de GalNAc,
00:25:30.18 care are o azidă pe gruparea sa acetil. Noi numim asta GalNAz.
00:25:34.13 analog cu ManNAz, și de fapt voi reveni la acest zahăr
00:25:38.20 GalNAz spre sfârșitul prelegerii.
De asemenea, am investit destul de mult timp în dezvoltarea sondelor
00:25:45.16 pe care le putem folosi pentru a vizualiza aceste zaharuri.
Acum ligatura Staudinger este minunat de selectivă
00:25:51.24 prin faptul că ne permite să formăm o legătură covalentă între sondă și zahăr.
00:25:57.06 Dar mai mult decât atât putem exploata elemente
00:25:59.24 a acelei chimie de ligatură pentru a proiecta ceea ce numim sonde inteligente.
Deci acestea sunt sonde care sunt de fapt invizibile
00:26:08.06 până găsesc un zahăr azido
00:26:11.28 formează acea legătură prin ligatura Staudinger,
00:26:14.13 și apoi devin fluorescente.
Deci ei practic înoată în sistem,
00:26:18.11 caută azide și de îndată ce le găsesc,
00:26:20.26 fac o legătură și se luminează, și nu le vezi altfel.
Acest lucru ne permite să facem imagini cu fluorescență
00:26:26.01 cu semnal foarte bun deasupra fundalului.
00:26:28.23 Modul în care facem asta este să exploatăm faptul că
00:26:32.19 în timpul ligii Staudinger,
00:26:34.11 această legătură esterică va fi scindată.
În diapozitivele anterioare aveam pur și simplu un ester metilic în această poziție.
00:26:41.18 unde metanolul a fost eliberat în timpul reacției
00:26:44.28 ceea ce nu este deosebit de remarcabil.
00:26:46.25 Dar s-ar putea înlocui acel ester metilic
cu o legătură ester cu un extintor de fluorescență.
Și dacă există o moleculă fluorescentă legată în altă parte,
00:26:55.16 acel fluorofor va fi stins
de stingerea din această moleculă inițială.
Dar de îndată ce această sondă găsește o azidă,
00:27:03.21 situat într-un acid sialic, să spunem, sau alt zahăr de pe celulă,
00:27:08.02 fosfina reacţionează cu azida
00:27:10.14 se desfășoară ligatura Staudinger,
00:27:13.01 esterul este scindat, lichidul de stingere este eliberat,
00:27:16.12 acum că fluoroforul este activat.
Deci doar odată ce fluoroforul își găsește ținta
00:27:22.09 și reacționează, abia atunci vezi fluorescența.
Altfel e invizibil.
Permiteți-mi să vă arăt o structură chimică reală a unei sonde
00:27:29.25 pe care l-am pregătit, care urmează exact acest mecanism.
00:27:35.08 Aceasta este o moleculă pe care o numim cu afecțiune „QPhos”,
00:27:40.06 care înseamnă fosfină stinsă.
00:27:41.22 Are trei părți:
Deci aici, această parte verde este foarte cunoscută
00:27:48.08 moleculă fluorescentă numită fluoresceină.
Este un colorant verde fluorescent folosit în mod obișnuit în laboratorul de cercetare.
00:27:55.22 În mijloc în negru este o fosfină care este pregătită pentru o ligatură Staudinger.
Puteți vedea că pe acest inel de benzen există un grup ester.
Acesta este poziționat pentru acea reacție intramoleculară
00:28:09.14 a intermediarului aza-ilidă.
Și apoi, în sfârșit, aici, partea albastră
00:28:14.03 este un binecunoscut stingător de fluorescență,
00:28:16.23 numit Disperse Red 1.
Și atâta timp cât acest Disperse Red 1 este legat de acest ester
va stinge fluorescența moleculei de fluoresceină.
00:28:25.26 Așa că permiteți-mi să vă arăt câteva imagini pe care le-am făcut folosind QPhos
00:28:30.07 pentru a detecta acidul sialic pe celulele canceroase din cultură.
00:28:35.12 Deci, în acest experiment, ceea ce am făcut a fost că am crescut niște celule
00:28:40.12 numite celule HeLa. Acestea sunt celule canceroase ale epiteliului cervical uman
00:28:45.22 pe care îl poți crește într-o eprubetă. Și în timp ce acele celule creșteau,
Le-am hrănit ManNAz în mass-media.
Tocmai l-am adăugat în mediul de cultură celulară,
00:28:55.08 l-au luat, l-au digerat și au pus azide în acizii lor sialici.
00:29:00.13 Apoi, după câteva zile de tratament cu ManNAz,
Am reacționat acele celule cu QPhos.
Apoi, după câteva ore, am făcut o imagine fluorescentă a acelor celule.
00:29:11.13 Celulele au fost, de asemenea, colorate cu un colorant fluorescent albastru
00:29:15.03 care este specific pentru nucleu.
00:29:16.17 Asta te ajută doar să te orientezi exact unde sunt poziționate celulele
00:29:20.27 deoarece fiecare are un nucleu.
Deci, ceea ce puteți vedea este că fiecare celulă
00:29:25.17 este înconjurat de un contur frumos verde strălucitor.
00:29:29.15 Aceștia sunt acizii sialici de pe
00:29:32.05 glicoproteine ​​și glicolipide asociate membranei.
00:29:35.09 al celulei și sunt frumos luminate.
00:29:37.25 De fapt imaginăm zaharurile.
S-ar putea să vezi puțină fluorescență și în interiorul celulelor.
00:29:43.16 Asta face, practic, parte a căii secretorii,
00:29:47.23, de exemplu, compartimentul Golgi.
Și apoi există un pic de pată de
00:29:51.14 mici vezicule de asemenea în celule.
Asta pentru că după ce reacționăm acizii sialici pe membrană
00:29:57.17 unii dintre acești acizi sialici ajung să fie interiorizați
00:30:00.21 în vezicule pentru că membranele sunt în mod constant
00:30:03.26 înghițit și reciclat și răsturnat.
00:30:05.29 Se întorc în partea târzie a compartimentului Golgi
00:30:08.23 și apoi revenind la membrană.
De fapt, se întâmplă multe în timpul reacției cu QPhos.
00:30:14.26 Acum am avut câteva probleme odată ce am început
00:30:17.29 făcând astfel de experimente.
00:30:19.07 De exemplu, ne-am dat seama că pentru a obține această colorare strălucitoare frumoasă
00:30:23.24 dintre acizii sialici, a trebuit să reacţionăm celulele cu QPhos timp de câteva ore.
00:30:28.27 Asta nu este o problemă pentru imagistica zaharurilor de pe celulele cultivate
00:30:34.17 deoarece celulele sunt într-un balon cu reactivii
00:30:37.26 și pot sta în incubator câteva ore.
00:30:40.12 și lăsați doar reacția să se desfășoare.
Motivul pentru care a trebuit să lăsăm reacția să treacă câteva ore
00:30:45.15 spre deosebire de câteva minute
00:30:47.02 sau câteva secunde este că se dovedește reacția de ligatură Staudinger
00:30:51.02 este intrinsec destul de lent. Durează atât de mult pentru ca reacția să continue.
00:30:57.24 Și deși asta nu a fost prea problematic
00:31:00.21 pentru experimente imagistice pe celule cultivate,
00:31:03.25 ne-am îngrijorat că ar putea fi o problemă
00:31:06.23 pentru imagistica zaharurilor la animalele vii.
pentru că, desigur, un animal viu nu este în echilibru.
Nu sunt celule dintr-un balon care stau într-un incubator timp de multe ore.
00:31:17.26 Animalele au un metabolism activ.
De îndată ce introduci reactivi în corpurile lor,
00:31:24.19 corpurile lor lucrează la curățarea acei reactivi din nou.
Iar acest proces de eliminare poate fi foarte rapid pentru anumite molecule
00:31:32.18 și anumite animale. De fapt, când am început să ne uităm la ligatura Staudinger
00:31:38.06 ca instrument pentru imagistica zaharurilor la șoarecii de laborator
00:31:41.23 ne-am confruntat imediat cu această problemă.
Așa că am injectat șoareci cu ManNAz
00:31:48.08 și am găsit asta la animal
celulele au fost perfect dispuse să preia acest zahăr
00:31:54.23 și convertiți-l în acid azido-sialic,
00:31:58.01 nu a fost nicio problemă.
00:31:59.21 Și părea inofensiv pentru șoareci.
00:32:01.17 Deci nu a existat niciun detriment evident pentru înlocuire
00:32:04.09 o parte din acizii sialici cu versiunea azido.
Problema a apărut când am injectat aceiași șoareci
00:32:11.26 cu molecule sondă legate de a
00:32:15.09 fosfină pentru ligatura Staudinger.
00:32:17.04 Pentru că ceea ce am descoperit este că
00:32:19.24 reacția dintre fosfină și azidă
00:32:21.26 a fost prea lent în comparație cu rata clearance-ului metabolic
00:32:25.23 a sondei din corpul animalului.
Deci am putut detecta doar o mică parte din acest produs
doar pe anumite organe și țesuturi
00:32:34.00 Organele și țesuturile care au fost cele mai accesibile
la reactivi după ce le-am injectat
00:32:38.14 sau organele și țesuturile care aveau niveluri foarte, foarte ridicate
00:32:41.23 din acidul sialic pe care încercam să-l imaginăm.
00:32:45.07 Și a fost puțin frustrant,
dar practic a indicat un element foarte important
00:32:50.12 din acest experiment, pe care chiar nu l-am luat în considerare de la bun început.
00:32:55.07 Știi, acum zece ani.
00:32:56.04 Care este cinetica reacției
00:32:59.05 între azidă și molecula sondă
00:33:01.16 sunt foarte, foarte importante pentru imagistica animalelor vii.
Acea reacție trebuie să fie suficient de rapidă
00:33:08.29 astfel încât sonda să poată găsi azida și să reacționeze
00:33:12.11 mai repede decât este îndepărtat din corp.
00:33:14.21 Și după mulți ani de experimentare,
În cele din urmă am ajuns la concluzia că ligatura Staudinger a fost prea lentă.
Cinetica sa a fost prea lentă în comparație cu rata sa de metabolism.
00:33:27.22 Și probabil că nu a ajutat situația ca fosfinele, în general,
00:33:32.25 poate fi oxidat în ficatul mamiferelor
00:33:35.15 de către enzimele citocromului P450.
00:33:37.05 care transformă fosfina într-un oxid de fosfină
00:33:42.08 și odată ce se întâmplă asta, acum acest produs
00:33:45.08 nu mai este activ într-o ligatură Staudinger.
00:33:47.08 Deci, fără îndoială, metabolismul hepatic al fosfinei
00:33:51.19 a contribuit la rata sa rapidă de eliminare
00:33:54.23 care tocmai a concurat cinetica intrinsec lentă a reacției.
Deci, concluzia este că ligatura Staudinger
00:34:02.04 a fost grozav pentru imagistica in vitro asupra celulelor din cultură.
Nu atât de grozav pentru imagistica in vivo în organisme vii
care au capacitatea de a elimina rapid reactivii din sistem.
Deci, în acel moment, ne-am mutat atenția
la un alt tip de chimie pe care o pot suferi azidele.
00:34:21.16 Este o altă chimie care își are originile în ultimul secol
00:34:26.03 în mâinile unui chimist german.
00:34:27.28 În acest caz, Rolf Huisgen, profesor la Universitatea din München.
00:34:31.26 care în anii 1950 a descoperit că azidele
00:34:35.26 poate reacționa cu alchinele, poate suferi un 1,3-dipolar
00:34:41.07 reacție de cicloadiție al cărei mecanism este prezentat aici,
00:34:44.19 pentru a forma un produs cicloaduct numit triazol.
Acum, ca chimia Staudinger,
00:34:52.04 această chimie de cicloadiție Huisgen
00:34:55.02 este bioortogonal în aceeași alchine și azide
00:35:00.08 ambele nu se găsesc în sistemele biologice,
00:35:03.04 cel puțin nu în majoritatea sistemelor biologice
00:35:05.06 și reacționează unul cu celălalt foarte selectiv
fără reacții secundare nedorite în sistemul viu.
Așa că ne-am gândit că aceasta ar fi o altă cale foarte promițătoare de explorat.
00:35:16.25 Problema este că reacția clasică Huisgen
00:35:21.09 așa cum este descris cu o alchină liniară standard
00:35:24.27 este, de asemenea, foarte lent. De fapt, chiar mai lent
decât chimia Staudinger cu fosfine.
00:35:30.28 Atât de lent, încât atunci când oamenii performează
00:35:34.22 aceste reacții într-un laborator de cercetare,
00:35:37.04 de obicei trebuie să aplice temperaturi ridicate
00:35:40.03 sau presiuni ridicate pentru a obține reacția
00:35:43.08 pentru a trece la finalizare la o rată rezonabilă.
00:35:45.26 Și când spun temperaturi ridicate,
00:35:47.22 Adică peste 100 de grade Celsius, de exemplu.
00:35:51.19 Deci toluen la reflux. Mai fierbinte decât temperatura de fierbere a apei.
00:35:56.27 Evident că nu putem face asta celulelor
00:36:00.14 și cu siguranță nu și organismelor vii.
00:36:02.14 Dar am început să ne gândim la modalități prin care am putea să o facem
accelerează ritmul acestei chimie.
00:36:08.21 Se pare că, în anii 1960,
a existat o publicație a lui Wittig și Krebs
00:36:14.25 în care au raportat că fenilazida reacţionează cu
00:36:20.08 cyclooctyne care are o legătură triplă strânsă într-un inel cu opt membri
00:36:26.03 pentru a forma produsul triazol foarte rapid.
00:36:30.16 Acum studenții mei absolvenți citeau această lucrare.
00:36:33.25 A fost publicat în germană,
00:36:35.29 și, din păcate, la acel moment nu aveam
00:36:38.25 orice colegi din laborator a căror germană era suficient de bună
00:36:41.18 pentru a înțelege cu adevărat hârtia în detaliile sale fine.
00:36:44.06 dar toți citim această propoziție
00:36:46.08 și a recunoscut trei cuvinte: fenilazidă, ciclooctilă și explozie.
00:36:53.02 Din câte am putut vedea, Wittig și Krebs
00:36:57.14 a combinat acești doi reactivi
00:36:59.12 și au format un produs ca o explozie.
00:37:02.11 ceea ce ne-a sugerat că aceasta trebuie să fie o reacție destul de rapidă.
00:37:05.17 Ține minte totuși că ceea ce au făcut Wittig și Krebs
00:37:09.05 este să reacționeze cu ciclooctina curată,
00:37:12.03 care este un lichid, cu fenilazidă curată, fără solvent.
Deci, aceștia au fost reactivi foarte concentrați care au reacționat ca o explozie.
Și ne-am gândit, dacă dizolvăm acești reactivi la concentrații mai mici.
00:37:25.08 și solvenți prototipi, poate reacția
00:37:28.07 va fi foarte bine controlat,
Sper că încă foarte rapid la temperatura camerei.
00:37:32.13 Acum de ce ai putea întreba ciclooctyne
00:37:36.06 reacționează cu o azidă ca o explozie în timp ce
Alchinele liniare sunt atât de lente încât trebuie să o faci
00:37:42.17 le încălzești peste 100 de grade?
00:37:44.05 Acest lucru poate fi înțeles uitându-ne la ceea ce se întâmplă
00:37:47.27 la o alchina când o forțezi într-un inel cu opt membri.
00:37:51.13 Acum, în mod normal, alchinele sunt liniare.
00:37:54.12 Aceasta este geometria lor preferată.
Și când o alchină reacționează cu o azidă, acest unghi de legătură
00:38:00.28 trece de la 180 de grade la 120 de grade în produsul triazol.
Deci deformarea legăturii costă multă energie
00:38:11.01 în starea de tranziție pentru reacție.
00:38:12.29 De aceea trebuie să o încălzim.
Pentru a oferi o parte din acea energie pentru a trece peste acea barieră de activare.
00:38:17.23 În schimb, dacă alchina este încorporată într-un inel cu opt membri
00:38:23.04 acum unghiul de legătură este îndoit la 160 de grade
00:38:27.25 Nu este ideal, de fapt, costă multă efort
00:38:31.19 pentru a îndoi o legătură triplă la 160 de grade
00:38:35.16 Dar rezultatul este că acum diferența
00:38:38.13 între 160 de grade și 120 de grade este ceva mai mic.
Nu costă atât de multă energie să mergi
00:38:44.09 de la această structură printr-o stare de tranziție
00:38:46.22 pentru a ajunge la acest produs.
00:38:48.03 Deci, speranța noastră a fost că prin strecurarea materialului de pornire
00:38:52.12 și îndoiți unghiul de legătură astfel încât să fie mai aproape
00:38:54.25 la structura stării de tranziție
Am coborî bariera de activare
00:38:58.24 astfel încât reacția să poată avea loc la temperatura camerei.
Și exact asta am observat când am sintetizat chimic
00:39:05.17 o întreagă familie de ciclooctine în laborator.
00:39:09.16 Așa că permiteți-mi să rezumam rapid câteva comparații cinetice
00:39:14.10 pe care le-am realizat folosind o varietate de reactivi sintetici.
Și deci fiecare dintre acești compuși este o ciclooctilă
oarecum, în unele cazuri, cu un heteroatom în inel
cu diverși substituenți diferiți în locuri diferite
și am făcut acești compuși dintr-o varietate de motive
00:39:32.21 în care nu voi intra.
00:39:33.13 dar vei vedea că în unele cazuri au existat carboni hibridizați sp2
00:39:37.11 altundeva în ring. Speranța noastră a fost că am putea crește tensiunea
00:39:41.15 mai multă energie prin punerea
16 atomi de carbon hibridizat sp2 acolo.
Și unii dintre acești reactivi
00:39:47.03 au substituenți electronegativi de fluor.
00:39:49.27 ceea ce credem că ar putea accelera reacția
pe baza unor argumente ale orbitalilor moleculari de frontieră.
00:39:56.12 De asemenea, printre această colecție este prezentat un reactiv de fosfină
00:40:00.17 care este stabilit pentru o ligatură Staudinger.
Ceea ce am făcut a fost că am luat fiecare dintre acești compuși.
00:40:06.07 Am reacţionat fiecare compus cu azidă de benzii
00:40:09.27 într-o eprubetă. Și apoi am măsurat
00:40:12.12 constanta de viteză de ordinul secund a reacției.
00:40:14.26 Și în albastru sunt afișate practic valorile relative pe care le-am măsurat.
Deci, concluzia este că am găsit un compus
00:40:24.03 care reacționează foarte rapid cu azidele dintr-o eprubetă.
00:40:28.15 Aceasta este o ciclooctilă di-fluorurată
00:40:32.00 că am dat abrevierea DIFO.
00:40:34.22 Deci asta înseamnă Di-Fluoro Cyclo Octyne.
00:40:39.00 DIFO. Și rata relativă de reacție a DIFO
00:40:42.26 în comparație cu alți compuși, veți vedea,
00:40:45.17 de exemplu un compus fără atomi de fluor.
00:40:48.02 este foarte mare. Deci putem accelera rata de 75 de ori
doar punând niște atomi de fluor aici
00:40:54.29 în comparație cu unii compuși părinte.
00:40:57.08 Important, dacă compari rata relativă de reactivitate
00:41:00.08 între DIFO în comparație cu o fosfină de ligatură Staudinger,
00:41:03.06 vei vedea că este de 15 ori mai rapid.
Și așa am simțit că a fost ligatura Staudinger
00:41:09.26 a eșuat in vivo din cauza cineticii sale lente.
s-ar putea să găsim succes acum cu DIFO
00:41:16.11 ca omologul reactiv al azidei.
Așa că am testat acest concept într-o varietate de experimente imagistice
începând pur și simplu cu celule HeLa cultivate.
00:41:28.15 Deci, amintiți-vă, într-un diapozitiv anterior, v-am arătat
Câteva imagini ale acizilor sialici de pe celulele HeLa
00:41:34.26 unde am reacționat azidele cu QPhos.
00:41:37.19 Acesta este acum un experiment foarte asemănător, dar
odată ce punem azidele în acizii sialici
De data aceasta reacţionăm azidele cu acest compus.
00:41:48.05 Deci noi numim asta DIFO-488.
00:41:51.00 Aici jos este partea DIFO, ciclooctila di-fluoro,
00:41:55.23 Partea verde a moleculei este o reclamă
00:41:58.22 colorant fluorescent numit Alexafluor 488.
Este un pic ca fluoresceina în proprietățile sale spectrale.
00:42:05.02 De aceea îl numim DIFO-488.
Deci ceea ce te uiți aici sunt celulele HeLa cultivate.
Au fost hrăniți cu ManNAz pentru a pune azide în acizii sialici.
00:42:16.05 Apoi au reacţionat cu DIFO-488
00:42:19.03 și puteți vedea că acizii sialici sunt afișați în aceste frumoase
00:42:22.02 halouri verzi strălucitoare în jurul fiecărei celule.
Membranele sunt frumos luminate.
Aceștia sunt acizii sialici.
Acesta este un experiment de control
00:42:30.12 în care în loc să hrănească celulele ManNAz,
Le-am hrănit acum cu zahăr natural, ManNAc.
00:42:36.28 Nu există azide în aceste celule.
00:42:39.20 Le-am reacționat și cu DIFO-488.
Și acum nu vezi nicio etichetă verde pe membrane.
Asta pentru că nu există azide cu care DIFO să reacționeze.
00:42:50.09 Acesta este o dovadă a selectivității DIFO.
00:42:54.06 Reacţionează doar cu azide.
00:42:55.26 Dacă nu există azide în jur, nu are cu ce să reacționeze.
00:42:58.14 Nu vezi zaharurile.
00:43:00.11 Dar cel mai important număr de pe acest slide
00:43:03.02 acesta este chiar aici.
00:43:05.09 Acum putem vedea o imagine frumoasă ca aceasta
00:43:07.17 prin reacția celulelor pentru mai puțin de 1 minut cu DIFO-488.
00:43:13.02 În timp ce în experimentul anterior cu QPhos,
00:43:16.10 reactivul de ligatură Staudinger,
A trebuit să reacționăm celulele timp de peste două ore.
Dacă putem obține acest tip de imagine într-un minut,
00:43:25.22 Cred că acum ne putem imagina zaharurile din animalele vii.
00:43:29.28 Această reacție este suficient de rapidă, așa că am sperat.
Deci, ce model animal ar dori să folosim pentru a imagina zaharurile?
00:43:38.17 Șoarecii sunt, evident, un model foarte atractiv pentru că se poate
00:43:42.17 studiază o varietate de boli umane în acel organism model
00:43:46.04 inclusiv cancerul. Cu toate acestea, șoarecii nu sunt ideali pentru imagistica optică,
00:43:50.15 pentru că, după cum știți, nu sunt transparente.
00:43:53.18 Sunt opace.
Se poate face imagini cu fluorescență în interiorul unui șoarece,
00:43:57.15 dar necesită un anumit tip de colorant, în general un colorant în infraroșu apropiat.
și este un experiment mai complicat.
Și pentru o primă încercare de imagistică optică in vivo,
Ne-am gândit să folosim un organism model
care este puțin mai prietenos cu un microscop optic.
Și alegerea evidentă a fost peștele-zebră.
Deci, peștii zebra sunt translucizi.
00:44:20.09 Puteți vedea chiar prin ele
00:44:21.24 și monitorizează organele lor in vivo.
00:44:24.10 în animalul viu. De asemenea, pește-zebra
00:44:27.16 sunt un model foarte atractiv pentru studiile dezvoltării vertebratelor.
00:44:31.29 Au toate aceleași organe și părți pe care le avem noi.
00:44:35.23 Sunt vertebrate. Și embrionul lor
Programul de dezvoltare a fost foarte bine caracterizat.
00:44:42.10 Deci știm ce embrioni de pește zebra
00:44:43.28 ar trebui să arate ca în aproape toate etapele dezvoltării lor.
De asemenea, știm că există schimbări în glicome.
00:44:51.29 care corespund cu dezvoltarea embrionară.
Și așa am crezut că acesta este un organism foarte drăguț
00:44:57.06 pentru a testa în primul rând instrumentele noastre chimice,
00:44:59.25 dar, în al doilea rând, s-ar putea să ne putem adresa
00:45:02.22 câteva întrebări fundamentale foarte interesante
00:45:04.25 despre cum se schimbă glicomul în timpul dezvoltării.
Și învață ceva despre domeniul glicobiologiei.
00:45:10.06 Așadar, am început cu câteva experimente de dovadă a conceptului.
00:45:14.09 în care ne-am concentrat nu pe acidul sialic
00:45:17.06 ci mai degrabă pe un zahăr numit N-acetilgalactozamină.
00:45:22.05 prescurtat GalNAc.
00:45:24.12 Motivul pentru care am fost atât de interesați
00:45:26.11 în GalNAc se datorează faptului că, așa cum am menționat în prima mea prelegere,
este reziduul de bază conservat într-o familie
00:45:34.09 de glicani O-legați care sunt asociați
00:45:37.14 cu glicoproteine ​​din familia mucinei.
Mucinele sunt o clasă generală de glicoproteine
00:45:44.29 care se caracterizează prin grupuri dense
00:45:47.29 din acești glicani O-legați de-a lungul coloanei vertebrale polipeptidice.
Sunt implicați în adeziunea celulară,
00:45:54.10 reglează interacțiunile celulă-celulă și sunt cunoscute
00:45:57.24 să fie atât reglementate din punct de vedere al dezvoltării
00:45:59.15 și uneori suprareglată în timpul transformării maligne.
Deci mucinele sunt o clasă interesantă de glicoproteine.
Toți au un reziduu GalNAc în poziția lor centrală.
Așa că ne-am gândit dacă am putea introduce o azidă
00:46:13.03 în acest reziduu de GalNAc, poate am putea imagina mucinele
00:46:18.20 in vivo. Și modul în care facem asta este să
00:46:21.23 pur și simplu hrănesc celule, sau în acest caz, embrioni de pește-zebră,
00:46:25.23 Acest derivat de azido-acetil pe care îl numim GalNAz
00:46:30.14 încă o dată, grupările hidroxi sunt protejate cu esteri acetilici.
Pentru ca compusul să pătrundă în membranele celulare
00:46:37.08 și în interiorul celulei grupările acetil sunt îndepărtate de esteraze.
00:46:41.07 in vivo. Bine. Deci acesta a fost unul dintre primele noastre experimente
00:46:46.00 am făcut pur și simplu întrebarea dacă embrionii de pește-zebră
00:46:50.02 metabolizează GalNAz și îl introduc în mucine,
00:46:54.09 și dacă da, putem eticheta azidele
00:46:57.05 cu reactivi DIFO și imagine că zahăr in vivo.
00:47:01.27 Deci, în acest experiment am fertilizat embrioni de pește-zebră într-o eprubetă.
00:47:06.05 și am adăugat GalNAz în mediul de cultură
00:47:09.27 și lăsați-i să se dezvolte pe parcursul cursului
de câteva zile și apoi după aproximativ cinci zile
Am luat larvele de pește-zebră vechi de cinci zile
00:47:19.23 și am reacționat cu DIFO legat de un colorant fluorescent,
00:47:23.23 în acest caz a fost DIFO-488,
00:47:25.24 același compus pe care l-am arătat în diapozitivul anterior
și apoi i-am pus pe acei zebră marcați într-un microscop cu fluorescență.
00:47:33.00 și am făcut o poză. Deci ceea ce ești
Privind aici este peștele-zebră etichetat
00:47:39.03 vechi de cinci zile, tratat așa cum se arată
00:47:41.14 în această schemă. Și oriunde vezi orice luminozitate
Practic te uiți la eticheta DIFO
00:47:48.09 care a fost atașat covalent de zahărul azido.
În acest panou este și un pește-zebră vechi de cinci zile.
00:47:55.01 Nu poți vedea, îmi dau seama.
Motivul este că singura diferență
00:47:58.24 este că acest embrion de pește-zebră s-a dezvoltat în prezența lui
00:48:01.28 zahărul natural GalNAc, care nu are azide.
00:48:05.16 Deci, când am reacționat acest pește-zebră vechi de cinci zile cu DIFO-488,
00:48:10.06 nu avea nimic cu care colorantul să reacționeze
deci nu vezi nicio fluorescență.
Din nou, mărturisește selectivitatea rafinată a DIFO
00:48:18.13 pentru azidă. Deci practic acest experiment
00:48:21.28 ne-a demonstrat că de fapt ne putem imagina
acele reziduuri GalNAz dintr-un pește-zebră viu.
Și ar trebui să subliniez că acești pești-zebră
00:48:32.10 arată perfect normal, perfect sănătos
00:48:34.16 și fericit, în ciuda faptului că o parte
00:48:37.11 dintre reziduurile lor GalNAc au fost înlocuite cu GalNAz,
00:48:40.14 și că o parte din acele reziduuri GalNAz
00:48:43.29 au reacţionat chimic cu reactivul DIFO.
Acești pești-zebră au fost apoi eliberați înapoi în rezervoarele lor,
00:48:50.17 și continuă să ducă o viață normală din câte putem vedea.
Deci nu pare să fie dăunător pentru organism
00:48:56.06 ceea ce este important dacă scopul este să înveți ceva
00:48:58.16 despre biologia fundamentală a organismului.
Putem face și experimente
00:49:03.18 unde verificăm modificările glicomului,
00:49:06.03 în funcție de timp
00:49:07.27 care, din nou, este una dintre cele mai interesante
00:49:10.01 aspecte ale domeniului glicobiologiei.
00:49:11.27 De exemplu, iată un experiment în care am făcut
00:49:16.02 un embrion de pește-zebră fertilizat în cultură
00:49:18.15 Adăugăm la mediul de cultură GalNAz,
00:49:21.22 și lăsăm acești embrioni să se dezvolte în prezența zahărului azido.
00:49:25.17 Acum, la un moment dat,
00:49:28.01 vom scoate acei embrioni din mass-media
00:49:30.15 clătește-le și reacționează
00:49:33.11 cu DIFO conjugat cu un colorant fluorescent roșu.
00:49:36.26 În acest caz a fost Alexafluor 647.
Acum niște glicoproteine, cele care au fost etichetate
00:49:44.08 cu azidele apar acum roșii,
00:49:46.16 dar putem lua aceiași embrioni
care poartă o sondă fluorescentă
00:49:49.21 și pune-le înapoi în media
00:49:51.09 și lăsați-i să-și continue programul de dezvoltare.
00:49:54.04 Ceea ce facem mai întâi este o reacție de 10 minute
00:49:56.19 cu un reactiv numit TCEP,
00:49:58.16 aceasta este tricarboxidietilfosfină.
00:50:01.05 Acest reactiv reduce orice
00:50:05.01 azide nereacționate la amina corespunzătoare.
00:50:07.11 Și, de altfel, chimia prin care TCEP
00:50:10.17 reduce acele azide nereacționate
00:50:12.16 este chimia clasică Staudinger.
00:50:15.10 Putem profita de asta.
Deci distrugem orice azidă nereacționată.
00:50:20.08 Luăm acești embrioni roșii,
00:50:22.16 le-a reintrodus în mass-media care conține GalNAz,
00:50:26.03 Ei continuă să se dezvolte.
00:50:27.06 Ocupă mai mult GalNAz în timp ce fac asta.
00:50:29.21 Și vor integra GalNAz în următorul
00:50:32.26 val de glicoproteine ​​mucine.
Și acum putem scoate embrionii
00:50:37.18 și etichetați-le din nou, de data aceasta cu DIFO
00:50:40.03 conjugat cu un colorant verde fluorescent.
00:50:42.16 Așa că acum, la sfârșitul tuturor acestor lucruri,
Există doi coloranți fluorescenți pe peștele-zebră.
00:50:48.13 Vopseaua verde reflectă aceste azide care sunt
00:50:52.13 în glicoproteine ​​biosintetizate cel mai recent.
00:50:55.11 În timp ce colorantul roșu reflectă populația mai în vârstă
00:50:58.18 de glicoproteine ​​care au fost introduse mai devreme în dezvoltare.
00:51:02.17 Deci, acest lucru ne permite să separăm glicoproteinele vechi de glicoproteinele noi
00:51:07.18 pe baza culorii pe care le apar în microscopul cu fluorescență.
Deci genul ăsta de experiment a dus la imagini ca aceasta
00:51:16.13 pe care l-am arătat chiar în primul diapozitiv al acestei a doua prelegeri.
00:51:19.13 Deci acesta este capul unui pește-zebră de 5 zile
00:51:24.19 care a fost etichetat cu GalNAz,
00:51:26.24 urmat de trei coloranți fluorescenți colorați diferite
00:51:30.11 la trei momente diferite.
00:51:31.17 În această imagine specială, cele mai noi glicoproteine
00:51:35.16 par roșii și puteți vedea că există
00:51:37.11 o concentrație a acelor glicoproteine
00:51:39.16 aici, în organele olfactive,
00:51:41.22 care sunt practic nările peștilor zebră.
00:51:45.05 În timp ce populațiile mai vechi de glicoproteine ​​apar fie albastre, fie verzi.
00:51:51.03 Și poți vedea că albastrul și verdele
00:51:52.21 au o distribuție destul de diferită de cea roșie.
Și uitându-mă la modul în care aceste culori diferite
s-au mutat în funcție de timp,
00:51:59.26 putem învăța ceva despre dinamica glicomei.
00:52:04.02 Cel puțin din perspectiva acestor mucină glicoproteine
00:52:06.27 pe care le-am etichetat cu GalNAz.
De fapt, poți folosi un microscop confocal pentru a te plimba
00:52:14.05 organismul etichetat celulă cu celulă
00:52:15.29 și aruncați o privire foarte atentă la ceea ce sa întâmplat
00:52:19.04 la mucine în funcție de timp în timpul dezvoltării.
00:52:22.21 Doar de exemplu, aici este un panou de celule epiteliale
00:52:26.16 și puteți vedea că fiecare celulă epitelială arată ca și cum ar avea
00:52:29.12 o membrană marcată roșu cu puncta albastru și verde în interiorul celulei.
00:52:34.26 Care este exact ceea ce ne-am aștepta,
00:52:36.27 deoarece în acest experiment etichetarea roșie
00:52:40.13 reflectă cea mai nouă populație de glicoproteine.
00:52:43.23 Acestea sunt glicoproteinele care tocmai
00:52:45.18 a apărut pe membrana plasmatică
00:52:47.08 cu azide gata pentru etichetare.
00:52:49.13 În schimb, populațiile mai în vârstă de glicoproteine
00:52:52.29 care au fost biosintetizate cu multe ore înainte
00:52:55.15 Am făcut această poză, au fost deja reciclate.
00:52:58.08 de veziculele endocitare din membrană.
00:53:01.18 Și de aceea apar în interiorul celulei.
Aceasta este o structură care a fost destul de dramatică
00:53:07.09 care a apărut la aproximativ 72 de ore după fertilizare.
00:53:12.11 Ceea ce privești aici este o proiecție roșie
00:53:14.12 care practic iese de pe ecran
00:53:16.15 la tine de la joncțiunea a trei celule epiteliale.
00:53:20.25 Acea structură roșie este o structură a părului mecanosenzorial.
00:53:24.22 Acestea sunt structuri care ies din lateral
00:53:27.23 a capului embrionului,
00:53:29.09 așa cum puteți vedea în această vedere la scară mai mare.
00:53:32.06 Acestea sunt structuri care
00:53:33.19 peștele-zebră îl poate folosi pentru a simți fluxul de curent în mediul său.
00:53:36.28 de exemplu.
Și faptul că am surprins această structură atât de dramatic în roșu
00:53:41.21 ne spune în primul rând că trebuie să conțină aceste mucine asemănătoare glicoproteinelor
00:53:47.29 altfel nu l-am putea vedea
00:53:49.23 pentru că asta ne imaginăm.
00:53:51.29 În al doilea rând, că majoritatea acestor glicoproteine
s-au format în fereastra dintre
00:53:56.23 72 și 73 de ore după fertilizare.
00:53:59.27 Care ar fi o fereastră foarte dificil de capturat
00:54:02.18 folosind alte tehnologii clasice de imagistică.
Deci acestea sunt tipurile de studii care, practic, deschid fereastra
00:54:10.01 prin viziunea zaharurilor în biologia dezvoltării.
00:54:14.10 Și cred că asta este foarte interesant
00:54:16.04 aplicarea viitoare a tehnologiei.
00:54:17.27 Deci, ce ar trebui să iei acasă din această a doua prelegere
00:54:23.02 în această serie. În primul rând, există o lecție de chimie aici,
00:54:26.11 care nu are nicio legătură cu zaharurile.
00:54:28.15 Este faptul că, știi, am profitat
00:54:31.13 a unor instrumente chimice foarte clasice.
00:54:34.08 Acestea sunt reacții chimice care au fost raportate pentru prima dată
00:54:37.20 încă din 1915. Asta cu aproape o sută de ani în urmă.
00:54:41.15 Și aceste vechi chimie clasice: chimia Staudinger
00:54:44.29 și chimia de cicloadiție Huisgen
Am descoperit că sunt adevărate pietre prețioase pentru aplicațiile moderne în biologie.
00:54:52.22 Deci, cercetând vechea literatură chimică,
00:54:55.29 se pot găsi niște instrumente incredibile
00:54:58.17 pentru a aduce în epoca modernă a cercetării biologice.
00:55:02.09 Și asta este foarte interesant pentru cineva care a fost pregătit ca chimist
00:55:05.15 și în esență se consideră chimist.
00:55:08.17 În al doilea rând, ar trebui să-ți amintești de azidă.
00:55:11.11 Azida are proprietăți fenomenale
00:55:15.00 care îl fac atât de potrivit pentru aceste aplicații
00:55:18.15 ca reporteri chimici.
00:55:19.25 Și credem că azida
00:55:21.13 are mult potențial nu doar pentru imagistica zaharurilor,
00:55:24.09 felul în care o facem, dar pentru imagini
00:55:26.11 tot felul de biomolecule interesante.
00:55:28.26 inclusiv proteine, lipide, acizi nucleici,
00:55:32.12 metaboliți, lucruri care nu sunt neapărat codificate în genom,
00:55:37.08 pentru care GFP și alți reporteri genetici nu sunt prea potriviti.
00:55:43.11 În al treilea rând, acum am arătat că etichetarea metabolică cu zaharuri azido
00:55:48.22 îți permite să imaginezi glicanii din sistemele vii.
00:55:51.23 Și credem că asta le va permite oamenilor de știință
00:55:53.29 pentru a studia glicobiologia folosind tot hardware-ul imagistică moleculară
00:55:59.28 care până acum sa concentrat în primul rând pe studiul proteinelor.
Și, în sfârșit, unde mergem cu această tehnologie în laboratorul meu
00:56:10.04 este să ne continuăm studiile despre biologiile dezvoltării
00:56:12.19 până când putem înțelege cum contribuie glicomul
la unele dintre procesele timpurii de luare a deciziilor despre soarta celulelor
00:56:18.12 în timpul programului embriogen.
00:56:20.10 De exemplu, cum se schimbă glicomul
00:56:22.18 când celulele stem embrionare pluripotente abia încep
să-și aleagă soarta finală de diferențiere.
Sperăm că putem surprinde un instantaneu
00:56:32.22 a acelui moment din perspectiva glicomei.
Și apoi, în sfârșit, știi, una dintre motivațiile noastre originale
00:56:38.27 a fost să dezvolte aceste instrumente într-un mod care
00:56:41.22 ar putea fi util din punct de vedere clinic. Deci sperăm că
00:56:44.29 putem dezvolta reactivii chimici
00:56:47.09 azido-zaharurile în așa fel încât să poți
00:56:50.18 introduce de fapt acești reactivi la subiecții umani.
Și folosiți-le pentru a detecta tumorile în stadii incipiente
00:56:57.06 în virtutea glicomei lor schimbătoare.
00:57:00.01 Așa că rămâneți pe fază și sperăm că vom avea multe de spus
00:57:03.02 despre asta în viitor.
00:57:04.20 În sfârșit, aș dori să le mulțumesc pe studenți
00:57:08.26 și bursieri postdoctorali în laboratorul meu.
00:57:10.21 Ce vezi pe acest slide
00:57:12.17 este un instantaneu al laboratorului meu în acest moment particular de timp
00:57:16.21 unde vă arăt tuturor studenților
00:57:19.02 și postdoctori care sunt în prezent în laborator
00:57:20.25 deși am enumerat doar o mică listă de absolvenți
00:57:24.10 a cărui lucrare am făcut aluzie în timpul acestei prelegeri.
00:57:27.27 Majoritatea numelor lor au fost de fapt menționate pe diapozitive
00:57:30.19 împreună cu referințe la publicații, dacă sunteți interesat
00:57:33.10 săpând în asta mai în detaliu.
00:57:36.07 Dar trebuie spus că toată lucrarea pe care am prezentat-o
00:57:39.04 din laboratorul meu este de fapt cercetarea practică
00:57:43.10 dintre studenții mei și bursierii postdoctorali și eu sunt
00:57:46.27 în mare parte purtătorul de cuvânt care are privilegiul de a împărtăși acest lucru lumii.
00:57:50.29 Deci, vă mulțumesc foarte mult pentru acordare și sper că v-a plăcut să învățați puțin
00:57:55.04 despre glicobiologie chimică.

  • Partea 1: Glicobiologie chimică

Partea 2: Celulele stem planare

00:07.1 Bună tuturor.
00:08.2 Mă numesc Alejandro Sánchez Alvarado.
00:10.0 Sunt investigator la Institutul Stowers
00:12.2 pentru Cercetare Medicală
00:14.2 și Institutul Medical Howard Hughes,
00:16.0 și pentru următoarele câteva minute
00:17.1 Îți voi face un rezumat
00:19.0 din ceea ce am învățat în ultimii câțiva ani
00:21.1 despre celulele stem planare
00:23.1 cunoscut și sub numele de neoblaste.
00:25.2 Deci, termenul neoblast a fost inventat
00:27.2 de către un student absolvent la Colegiul Bryn Mawr în 1893
00:30.2 pentru a se referi la aceste celule nediferențiate
00:33.1 care se găsesc distribuite pe tot planul corpului
00:36.0 a anatomiei planare.
00:38.0 Și aceste celule sunt responsabile, în mare parte,
00:40.2 pentru capacitatea imensă de a regenera părțile lipsă ale corpului
00:44.2 după amputare la aceste animale.
00:46.1 Deci, ceea ce vedeți aici este în esență
00:48.2 o progresie de șapte zile a unui animal
00:50.2 care a fost decapitat
00:52.2 și poți urmări cum încep să se formeze țesuturile
00:55.1 în fața planului de amputare
00:57.0 începe să se diferențieze în ceva
00:59.0 care arată ca un cap planar.
01:00.2 Aceste celule sunt larg distribuite
01:02.3 în întreaga anatomie a organismului,
01:04.3 sunt etichetate aici cu verde,
01:06.2 și puteți vedea, de exemplu,
01:07.3 că se află în esență în fiecare parte a animalului,
01:12.1, cu excepția vârfului capului animalului, în sine,
01:15.2 și faringele propriu-zis.
01:17.1 Și acestea sunt singurele două țesuturi care,
01:19.0 când este amputat de la animal,
01:20.2 nu va regenera un animal complet,
01:22.2 și știm acest lucru din lucrarea lui Morgan, T.H. Morgan,
01:26.2 în 1898 și 1901.
01:27.3 Dar restul de țesut,
01:29.1 atâta timp cât are aceste celule verzi, aceste neoblaste,
01:31.2 vor lansa de fapt un răspuns regenerativ
01:33.2 pentru a restabili forma și funcția acelui fragment
01:36.2 într-un animal complet.
01:38.2 Deci, cum arată aceste celule?
01:40.2 Aceste celule sunt foarte nediferențiate,
01:43.2 sunt relativ abundente,
01:45.0 puteți vedea aici nucleul în roz,
01:47.0 sunt foarte puține materiale cu densitate de electroni după micrografia electronică,
01:51.2 sugerând că cea mai mare parte a ADN-ului este într-o stare relaxată.
01:54.2 Nu este condensat,
01:56.1 ceea ce înseamnă că acel ADN este probabil deschis pentru afaceri.
01:58.2 Ar trebui să aibă loc transcrierea
02:00.2 într-o varietate de moduri
02:02.3 pentru a permite acestor celule să se diferențieze
02:04.2 în cele 40 până la 50 de tipuri diferite de celule
02:06.2 care alcătuiesc anatomia acestui organism.
02:08.2 Citoplasma este foarte bazofilă,
02:10.2 deci este plin cu ARN
02:13.2 -- ARN mitocondrial, ARN ribozomal,
02:15.1 ARN mesager,
02:16.3 și probabil ARN-uri lungi necodante
02:18.2 și microARN
02:20.2 și întreaga populație și tipuri de ARN la aceste animale.
02:23.1 Ceea ce este remarcabil la aceste celule este că
02:26.3 nu sunt rare
02:28.1 sunt de fapt foarte abundente,
02:29.2 pe care îl puteți vedea cu ușurință doar privind acest organism
02:31.1 unde au fost etichetate neoblastele.
02:33.2 Deci, aceste neoblaste corespund numai prin anatomie,
02:35.2 după morfologia celulelor,
02:36.3 până la aproximativ 25% din toate celulele acestui animal.
02:40.1 Aceasta este o exagerare grosolană a unui anumit tip de celulă,
02:43.0 în special un tip de celulă nediferențiat,
02:45.1 care se poate transforma în orice tip de țesut la aceste animale.
02:49.0 În al doilea rând, acestea sunt singurele celule care se divid în planari.
02:52.1 Din nou, o altă exagerare,
02:54.0 în mod normal, nu așa funcționează,
02:55.2 dar la aceste animale aveți celule stem,
02:57.1 care sunt singurele care se împart
02:59.2 la aceste animale care se reproduc asexuat,
03:00.3 și apoi celelalte celule,
03:02.1 care sunt celulele diferențiate,
03:03.2 care sunt în întregime post-mitotice.
03:05.2 Nu se vor mai împărți.
03:07.1 Și atunci știm și acum asta
03:09.2 ei nu sunt doar totipotenți în mod colectiv.
03:11.1 și ce vreau să spun prin asta?
03:12.2 Ceea ce vreau să spun prin asta este că
03:14.1 o colecție a acestor celule,
03:15.1 când eliminați acest fragment din animal, de exemplu,
03:18.1 atunci acest pătrat poate regenera un animal complet
03:21.2 și apoi acele câteva neoblaste care sunt prezente acolo
03:24.3 va diviza, va prolifera și va diferenția
03:27.0 în toate tipurile de țesut care lipsesc.
03:28.2 Dar, mai recent,
03:30.3 un om de știință postdoctoral anterior în laboratorul meu,
03:32.2 care acum își conduce propriul laborator
03:34.2 la Institutul Whitehead din MIT,
03:36.2 a demonstrat că puteți elimina
03:39.1 o celulă individuală din aceste animale,
03:41.0 dar ei înapoi într-un animal
03:43.0 în care au fost eliminate toate neoblastele
03:44.1 și, cu o oarecare frecvență,
03:46.1 de care este capabilă celula individuală
03:50.0 restabilind toate celulele și toate țesuturile acestor animale,
03:53.1 soluționarea suspiciunii, suspiciunii de mult timp,
03:56.0 că aceste celule conțin într-adevăr capacitatea de a fi,
03:58.2 dacă nu toti-, cel puțin pluripotent,
04:01.0 și capabil să restaureze și să producă
04:03.0 toate tipurile de celule din aceste animale.
04:04.2 Deci, asta face ca aceste celule să fie deosebit de interesante,
04:07.0 pentru că ceea ce ne spune este că
04:10.0 au descoperit o cale
04:12.0 pentru a-și regla producția genomică
04:13.3 în produse foarte specifice
04:17.0 pentru a da naștere la mușchi,
04:18.1 sau, în alte cazuri, neuroni,
04:19.2 sau, în alte cazuri, epiteliu,
04:21.0 și așa mai departe și așa mai departe.
04:22.1 Și trebuie să înțelegem cum sunt aceste celule
04:25.2 gestionând toate aceste informații pentru a produce țesuturi
04:27.2 din numărul corect
04:29.1 și de tipul potrivit
04:31.1 pentru a permite animalului să fie recunoscut ca planar.
04:33.1 Deci, știm acea amputare
04:36.2 este capabil să activeze proliferarea acestor celule,
04:39.1 deci în orice moment în care aceste celule se divid,
04:41.3 la un moment dat, de fapt,
04:44.1 2% din toate neoblastele intră în ciclul celular,
04:46.2 care este o activitate foarte rapidă și furioasă,
04:48.3 dar amputația crește de fapt această rată
04:51.1 la numere chiar mai mari,
04:52.3 și îți voi arăta asta chiar aici.
04:54.2 Puteți vedea aici un cap regenerând o coadă.
04:57.1 Deci, acesta este capul care regenerează o coadă, deci acesta este fragmentul de cap.
05:00.2 Acum puteți vedea un trunchi care acum se va regenera
05:02.2 un cap și o coadă.
05:04.0 Și apoi puteți vedea un fragment de coadă,
05:05.1 care, în esență, va fi în cele din urmă
05:06.3 regenerează un cap, chiar aici, bine?
05:09.1 Dar ceea ce vedeți aici în această a treia coloană din mijloc
05:12.2 este numărul de celule care sunt în curs de diviziune celulară,
05:15.0 deci folosim un anticorp împotriva
05:17.1 o formă fosforilată a histonei H3
05:20.0 serină numărul 10, la aceste animale,
05:23.1 în aceste proteine,
05:24.2 unde acesta este momentul în care celula trece de la G2 în mitoză,
05:27.1 astfel încât ne permite să vedem ce celule se divid.
05:29.1 Putem cuantifica acest proces,
05:30.2 și acum știm acea amputare
05:32.3 provoacă inițial o mare explozie de proliferare.
05:35.0 Deci, doar amputarea poate activa aceste celule
05:37.2 la hiperproliferare.
05:39.0 Deci, ceea ce am dori să facem este să înțelegem
05:41.1 cum răspund aceste celule la mediu,
05:42.2 și prin faptul că nu răspunde în acest fel
05:44.2 că ar produce tumori
05:46.3 sau produc niște structuri amorfe,
05:48.1 dar, în esență, regenerează tipurile de țesut potrivite
05:51.2 și structurile potrivite care lipsesc după amputații.
05:54.1 Deci, ce aș dori să fac în următoarele minute
05:56.1 este să vă arate modul în care,
05:57.3 în ultimii cinci până la șase ani,
05:59.1 poate puțin mai mult decât atât,
06:01.0 am disecat biologia neoblastului.
06:02.3 Și ceea ce sper să realizez în această prezentare
06:04.3 este să trecem peste patru lucruri:
06:07.0 cum am procedat să identificăm
06:09.2 markeri care sunt asociați cu neoblastele
06:11.0 cum am identificat marcatorii care
06:14.1 ne-a permis să distingem neoblastele de progenitori,
06:16.3 celulele care au fost produse după diviziunea celulară
06:19.1 am dori, de asemenea, să înțelegem cum se comportă aceste celule
06:22.2 -- nu avem nicio înțelegere,
06:25.0 sau mai degrabă înțelegere profundă,
06:26.3 despre modul în care aceste celule se comportă în condiții homeostatice normale
06:30.2 sau în condiții de regenerare
06:32.2 și apoi, în sfârșit, puțin despre
06:35.0 cum fac aceste celule de fapt diviziunea celulară,
06:37.1 care a fost o surpriză pentru noi
06:40.1 la sfârșitul zilei.
06:42.0 Deci, să începem cu marcajele de neoblast.
06:44.1 Deci, acești markeri de neoblast
06:46.1 sunt gene sau proteine
06:48.3 care sunt produse în mod special de celulele stem
06:50.2 care ne va permite acum să le distingem molecular
06:53.1 din cohortele lor, cohortele din jur.
06:55.1 Deci, cum procedăm pentru a identifica genele specifice?
06:58.3 Ei bine, ți-am spus mai devreme că
07:00.3 acestea sunt singurele celule care sunt supuse diviziunii celulare,
07:04.0 așa că am profitat de un experiment care a fost executat
07:07.0 la începutul anilor 1900 de către un om de știință, [necunoscut],
07:10.1 care i-a permis să elimine toate neoblastele din planari
07:14.2 prin expunerea lor la doze mari de iradiere.
07:17.3 Iar iradierea ucide doar celulele în diviziune,
07:20.0 pentru că cromatina se sparge în bucăți,
07:22.1 când celulele încearcă să se dividă
07:24.2 nu își pot împerechea cromozomii,
07:25.2 și suferă apoptoză, moarte celulară completă.
07:28.1 Deci, iată situația:
07:30.0 luăm un animal, așa, în verde sunt celulele stem,
07:32.2 expunem aceste animale la iradiere,
07:34.2 ar putea fi iradiere gamma sau iradiere cu raze X,
07:37.1 și apoi după o perioadă de timp
07:38.3 toate aceste celule verzi vor dispărea.
07:40.2 Totuși, animalul
07:42.0 va supraviețui pe baza virtuții
07:43.3 din celulele sale diferențiate
07:45.2 timp de 3-4 săptămâni,
07:47.1, ceea ce ne oferă mult timp
07:49.2 să se uite la comportamentul acestor celule post-mitotice.
07:52.0 Deci, ideea este în esență următoarea:
07:54.2 putem compara aceste două stări,
07:56.1 animalul de tip sălbatic și animalul iradiat,
07:58.2 și vedeți ce diferențe apar?
08:00.2 Aceste diferențe ar trebui asociate
08:02.2 cu țesuturile care lipsesc,
08:04.1 și țesuturile care lipsesc în acest caz
08:06.1 vor fi neoblastele.
08:07.1 Deci, asta e ideea.
08:08.1 Prelevam probe la o zi după iradiere,
08:11.1 la șapte zile după iradiere,
08:13.2 și speranța este că prin profilarea expresiei ARN
08:16.3 putem identifica gene care sunt asociate exclusiv
08:19.2 cu celulele stem și descendenții lor,
08:22.0 și voi explica asta mai detaliat
08:24.1 doar în următorul diapozitiv.
08:25.2 Deci, ceea ce am făcut a fost să
08:27.2 măsoară diferențele în expresia genelor
08:30.0 între tipul sălbatic și animalul iradiat,
08:32.3 și ceea ce am observat este că există un grup de gene
08:36.2 care în esență dispar, acestea sunt coloanele în roșu, aici,
08:38.3 24 de ore după iradiere.
08:40.2 Aceste gene sunt probabil asociate cu neoblastele,
08:43.2 deoarece neoblastele au fost îndepărtate fizic
08:45.3 de la întregul animal.
08:47.3 La orice altceva se așteaptă acolo pentru neoblasti,
08:49.0 deci dacă vedem genele dispar sau expresia genelor dispar,
08:51.0 asta pentru că neoblastele au dispărut,
08:52.2 deci presupunem că aceste gene sunt asociate cu acele celule.
08:55.2 Așa am procedat la identificarea
08:57.3 gene asociate cu neoblastele.
08:59.2 Și gena care a fost cel mai grav afectată de iradiere,
09:03.0 este această moleculă numită Smedwi-2.
09:06.1 Smedwi-2 este un membru al familiei de proteine ​​Argonaute,
09:10.1 descoperit inițial în plante,
09:11.3 pe care îl cunoaștem din biologia plantelor
09:13.2 să fie asociat intrinsec
09:15.1 cu reglarea celulelor stem din plante.
09:17.2 Deci, dacă animalele și plantele au un strămoș comun,
09:20.2 această moleculă era acolo, probabil reglând celulele stem,
09:24.1 în strămoșul care a dat naștere atât plantelor, cât și animalelor.
09:26.3 Deci, aceasta este o moleculă foarte veche
09:28.2 și este surprinzător și încântător
09:30.3 pentru a găsi o moleculă ca aceasta exprimată în neoblaste în planari.
09:33.2 Deci, acum știm că poate această moleculă
09:36.1 este cu adevărat foarte, foarte important
09:38.1 în reglarea funcției celulelor stem.
09:39.1 Și așa, când ne uităm la locul în care animalul
09:42.3 această genă este exprimată,
09:44.1 o găsim exprimată în esență în neoblaste.
09:46.1 Toate aceste mici puncte verzi
09:48.1 sunt toate celulele stem care există
09:50.1 la un animal cu reproducere asexuată
09:52.1 la orice moment dat.
09:53.1 Și în magenta vezi celulele
09:55.1 care sunt în curs de diviziune celulară, bine?
09:57.0 Deci acum putem profita de
10:01.0 Interferența genetică mediată de ARN sau ARNi,
10:03.1 și perturbă funcția acestei molecule
10:06.1 și apoi vedeți ce consecințe are
10:08.1 despre funcția neoblastelor înșiși.
10:10.2 Și așa am făcut asta
10:14.1 pentru a determina funcția,
10:17.1 ci pentru a confirma mai întâi dacă acestea sunt sau nu
10:20.1 gene specifice neoblastului,
10:21.2 am profitat de o metodologie
10:23.1 care a fost dezvoltat de colegii noștri din Japonia,
10:24.3 Kiyokazu Agata și laboratorul său,
10:27.3 că prin sortarea acestor celule.
10:29.1 luând în esență aceste animale,
10:30.3 faci o supă de celule,
10:32.1 și apoi măsurați conținutul de ADN.
10:33.2 și conținutul de ADN crește pe măsură ce celulele se divid,
10:36.0 deci acestea sunt neoblastele, bine?
10:37.3 Iar celulele al căror conţinut de ADN nu se schimbă vor fi aici jos.
10:43.0 Acum putem lua acest profil
10:45.0 și aplicați-l din nou pe un animal
10:47.1 unde neoblastele au fost îndepărtate prin iradiere,
10:49.2 rulează același profil,
10:50.3 și ce vedem?
10:52.1 Ei bine, celulele care se divid au dispărut,
10:53.3 bine, așa că acum știm că toți neoblastii
10:55.3 vor fi aici,
10:57.0 dar există o altă fereastră de celule
10:58.3 a numit populația X2, chiar aici,
11:00.1 care au dispărut și ele.
11:01.2 Deci credem că celulele sar între aceste două ferestre,
11:03.2 dar acolo este populația noastră de neoblast.
11:05.2 Și există un grup de celule care nu au fost modificate
11:07.2 prin iradiere
11:09.0 și noi numim aceasta descendență de diviziune post-mitotică.
11:11.0 Așa că acum am purificat celulele din fiecare dintre aceste ferestre
11:14.0 și am încercat să măsurăm expresia
11:17.1 dintre aceste molecule, Smedwi-2 în aceste celule, asta este ceea ce vedem.
11:21.1 Că doar ferestrele X1 și X2
11:24.2 exprimă PIWI sau Smedwi-2,
11:26.2 sugerând atunci că acesta este un marker foarte specific
11:29.1 neoblastilor înșiși.
11:30.3 Deci, pentru a reveni la ceea ce spuneam mai devreme,
11:33.1 când perturbăm funcția acestor gene,
11:35.2 ceea ce vedem în esență este următorul:
11:37.2 am fost capabili să recapitulăm, sau să copiem,
11:41.1 fenotipul pe care îl vedem al animalelor
11:43.2 care au fost supuse iradierii.
11:45.1 Sunt incapabili să creeze un răspuns regenerativ,
11:47.2 deci nu se formează cap sau cozi,
11:49.1 și puteți vedea că formează această mică formă de cochilie de taco, la care ne referim.
11:54.1 numim curling ventral,
11:55.2 și ARNi-ul smedwi-2 dă exact același fenotip.
11:58.1 Dar de ce ne-a dat exact același fenotip?
11:59.3 Și așa. pentru ca stim asta
12:03.1 celulele care exprimă în esență PIWI
12:05.0 sunt doar celulele stem,
12:06.1 nu sunt prezente celule diferențiate,
12:07.2 și totuși consecința este
12:09.2 detectabil numai în celulele diferențiate.
12:11.2 Așa că am urmărit aceste celule în timp
12:13.3 pentru a vedea ce s-ar întâmpla cu neoblastii înșiși
12:15.3 după ce eliminăm molecula,
12:20.1 am observat că neoblastele erau încă acolo,
12:21.3 și totuși nu își exercitau funcția,
12:23.1 și motivul pentru care nu își exercitau funcția
12:25.1 a fost pentru că neoblastii înșiși
12:27.3 nu s-a putut diferenția în tipul de celulă adecvat.
12:30.2 Deci te uiți aici la epiderma animalului,
12:32.3 acestea sunt denumite celule epiteliale columnare,
12:34.3 nucleele au fost marcate cu BrdU
12:37.0 pentru a ne permite să urmărim celulele în timp,
12:39.1 și asta se întâmplă în condiții normale,
12:42.0 asta se întâmplă când molecula PIWI este perturbată de ARNi.
12:45.1 Celulele sunt făcute,
12:47.1 ei migrează către țesutul potrivit,
12:48.2 dar când ajung acolo, nu se diferențiază în mod corespunzător.
12:51.0 Deci ceea ce vedem aici este o consecință a unei gene
12:53.2 care este exprimat în neoblaste,
12:55.2 nu mai este exprimat în descendență,
12:57.0 dar are consecințe asupra capacității acelei celule,
12:59.2 îndepărtat cu multe ore și cu mulți microni distanță de sursă,
13:04.3 provocând un defect fenotipic grav
13:06.3 care este incompatibil cu viața.
13:08.2 Deci acum știm că această moleculă este de fapt foarte, foarte importantă,
13:11.3 nu pentru întreținerea neoblastelor,
13:13.1 ci pentru că le-a spus de fapt neoblastilor
13:15.0 ce să devină mai târziu
13:17.0 pe măsură ce acestea devin post-mitotice.
13:18.2 Deci, asta a fost de fapt
13:21.1 ceva care a fost descoperit în laboratorul nostru în 2005,
13:24.0 și apoi câteva luni mai târziu
13:26.0 a devenit evident că motivul
13:28.0 de ce se întâmpla asta
13:29.2 pentru că era un nou tip de microARN,
13:31.2 este denumit piRNA,
13:33.1 că această moleculă o regla.
13:34.2 Deci, nu știam că se întâmplă asta,
13:36.1 dar probabil de aceea vedem acest fenotip.
13:38.0 Aceste piRNA nu sunt făcute.
13:40.1 Deci, ne-am gândit că.
13:42.2 acum avem un control asupra markerilor
13:46.2 care sunt asociate cu neoblastele.
13:47.2 putem identifica markeri asociați
13:50.1 cu descendența lor post-mitotică,
13:52.0 urmează același proces?
13:53.1 Deci, asta vom face
13:55.1 următoarea parte a prezentării,
13:56.3 acești markeri descendenți de neoblast,
13:58.2 și așadar, ceea ce ne-am gândit că vom face este asta.
14:01.1 dacă aceste gene au dispărut 24 de ore mai târziu, bine,
14:04.1 ar fi plecat după o săptămână,
14:06.1 dar mai sunt aceste gene care nu au dispărut 24 de ore mai târziu,
14:09.1 dar au plecat 7 zile mai târziu.
14:11.1 Așa că credem că acestea sunt celulele
14:13.2 care nu mai sunt făcute de neoblasti,
14:15.1 și acestea sunt celule tranzitorii
14:17.1 în drum spre diferențierea terminală.
14:19.1 Și așa am crezut că vom face
14:21.1 ne vom uita la aceste celule particulare
14:22.2 și apoi vedeți dacă sau nu
(14:24.3) ei exprimă aceste gene în locuri diferite.
14:27.2 Și așa ne-am referit la aceasta ca
14:29.3 markeri potențiali ai populației progenitoare,
14:32.1 bine?
14:33.2 Și acesta este experimentul pe care l-am făcut,
14:35.0 acestea sunt genele care sunt exprimate în neoblaste,
14:37.3 acestea sunt genele care erau încă prezente,
14:40.3 acolo 24 de ore după iradiere,
14:42.1 îi puteți vedea chiar aici,
14:43.2 dar în ziua a 2-a ei au dispărut, în ziua a 4-a
14:46.1 practic au plecat din nou.
14:47.2 Dacă te uiți la genele de categoria 3,
14:49.1 sunt prezenți acolo în ziua 1,
14:51.1 sunt prezenți acolo în ziua 2,
14:53.0 și au dispărut până în ziua 4.
(14:54.2) Deci asta a sugerat că aceste celule
14:56.1 își schimbau de fapt profilurile de expresie
14:59.1 pe măsură ce timpul progresa și celulele se diferențiau,
15:00.3 și deci ceea ce am făcut a fost să etichetăm celulele,
15:03.2 permanent, cu BrdU,
15:04.1 și apoi am urmărit aceste celule
15:06.2 pe măsură ce timpul trece.
15:07.2 Deci, aceste celule sunt acum dublu etichetate pentru BrdU,
15:10.1 care le etichetează permanent ADN-ul.
(15:12.3) Gena este exprimată în aceste neoblaste
15:14.3 și acum ne întrebăm ce se întâmplă cu BrdU,
15:16.1 care este complet independent de expresia genelor,
15:18.3 îl vom vedea acum în următoarele celule post-mitotice,
15:22.0 dar exprimând genele despre care credem că sunt exprimate în progenitori?
15:24.3 Și ceea ce vedem în esență este că,
15:27.0 da, celulele BrdU pozitive
15:28.3 care exprimau ieri PIWI,
15:30.2 acum nu exprimă PIWI,
15:32.0 și exprimă acești alți markeri timpurii de descendență.
15:35.0 Puteți urmări aceste celule de-a lungul timpului
15:36.2 și în esență vedeți același lucru,
15:38.1 că după 96 de ore această genă este oprită
15:41.1 și apoi se activează un nou set de gene,
15:43.1 și este dublu etichetat de BrdU.
(15:44.2) Acesta este un marcator permanent și unic
15:47.0 care ne permite să urmărim aceste celule în timp.
15:49.3 Deci, asta ne permite să identificăm și să definim
15:53.0 prima linie de celule stem în planari,
15:55.2 pe care, în esență, noi tocmai
16:00.1 arată aici sub formă de diagramă.
16:01.2 Aveți molecule asociate cu celulele stem,
16:03.2 molecule asociate cu descendența diviziunii post-mitotice.
16:06.2 acesta este începutul, la 24 de ore după iradiere,
16:09.0 și aceștia sunt markerii care apar
16:12.2 după 24 de ore,
(16:14.1) pe măsură ce celulele încep să continue în marșul lor către diferențiere
16:16.0 pentru a da naștere fie pielii, fie epidermei, mai degrabă,
16:19.1 mușchi, neuroni și așa mai departe.
16:21.3 Deci, folosind aceste instrumente și folosind această abordare,
16:24.0 am început să decoram
(16:26.2) diversitatea destinelor și diversitatea tipurilor de celule
16:29.3 care sunt prezente în acest organism.
16:32.0 Mai recent, însă,
16:34.0 a devenit disponibilă o nouă tehnologie
16:36.0 pentru a face acest lucru la un nivel mult mai ridicat de rezoluție,
16:38.2 și asta este afișat chiar aici,
16:40.0 aceasta este lucrarea unui fost om de știință postdoctoral din laborator,
16:42.2 Peter Reddien,
16:43.3 unde s-au uitat în esență la 96 de gene și 96 de celule,
16:48.1 care sunt prezentate în esență chiar aici,
(16:49.2) și ce văd ei când testează celulele acestor indivizi
16:52.3 împotriva acestor 96 de gene,
16:54.1 identifică subpopulații de neoblaste
16:57.1 care exprimau gene specifice
17:00.0 la orice oră dată,
17:01.2 sugerând că, deși toate neoblastele
17:03.2 exprimă PIWI,
17:04.3 există subpopulații în cadrul acelei populații de celule PIWI-pozitive
17:09.0 care exprimă alți markeri specifici
17:11.3 care probabil vor dicta soarta
17:14.2 pe care aceste celule le vor lua,
17:16.2 sub homeostazie obișnuită,
17:17.2 pentru a da naștere unor structuri adecvate.
17:20.2 Așadar, cred că, în următorii câțiva ani, vom vedea o binefacere în înțelegerea noastră
17:23.1 despre modul în care aceste tipuri diferite de celule
17:25.2 sunt specificate și reglementate
17:28.0 pentru a produce tipul și numărul corect de celule
17:30.1 în ambele condiții homeostatice
17:32.1 și condițiile de regenerare în planari.
17:34.1 Și, făcând acest lucru, informează cum celulele stem
17:37.1 fac ceea ce fac ei în regatul animal,
17:41.0 și poate chiar regnul vegetal,
17:43.0 dar asta rămâne de stabilit.
17:45.0 Deci, ce fac aceste celule?
17:47.2 Știi, ei doar stau acolo,
17:49.2 îi vedem în esență doar stând în țesut,
17:52.0 și așa am vrut să știm,
17:54.0 ce fel de comportamente manifestă?
17:55.2 Și pentru a face asta am profitat
17:57.2 o paradigmă experimentală cu adevărat interesantă
17:59.3 care a fost conceput, crezi sau nu,
18:02.1 în 1945-1946 la Paris, după al Doilea Război Mondial,
18:05.3 de Étienne Wolf și François Dubois,
18:08.2 și vă voi ghida prin acest proces.
18:10.3 Aceasta este ceea ce au făcut ei.
18:12.1 Acest experiment este absolut frumos.
18:13.3 În esență, este o teză de doctorat.
18:15.2 Au luat animale sălbatice,
18:17.3 au luat animale care au fost iradiate,
18:19.2 nu au neoblaste,
18:21.0 au îndepărtat țesut de la donator,
18:22.2 transplantat la tipul sălbatic și a pus întrebarea:
18:27.2 face acest țesut care are neoblaste,
18:29.1 poate salva sau nu animalul iradiat?
18:31.2 Bine?
18:33.0 Deci, când faci asta,
18:34.1 dacă transplantați țesut iradiat într-un animal iradiat,
18:36.1 animalul moare.
18:37.2 Nicio problemă, adică la asta te-ai aștepta.
18:39.1 Nu există neoblaste acolo.
18:40.2 Cu toate acestea, dacă acum transplantați
18:43.2 țesut de tip sălbatic într-un animal iradiat,
18:46.0 da, animalele devin mai mici pentru că devin,
18:48.0 dar de fapt salvează animalul,
18:50.1 astfel încât după 32 de zile să fie încă în viață,
18:52.3 au un cap frumos,
18:54.1 au faringe,
18:55.2 par perfect recuperați,
18:57.1 doar prin transplant,
18:58.2 sugerând că țesutul care a fost transplantat
19:00.2 și neoblastele din interiorul lor
19:02.1 poate repopula efectiv țesutul iradiat
19:04.0 și salvează animalul.
19:06.0 Dacă acum faceți experimentul în așa fel încât
19:08.2 acum transplantați țesut de la animalul care se reproduce sexual
19:11.3 în animalul cu reproducere asexuată,
19:14.1 poate animalul care se reproduce sexual
19:17.1 transformă animalul asexuat într-un animal sexual, bine?
19:19.3 Și astfel, putem spune diferențele
19:22.0 privind cromozomii,
19:24.3 și în esență ceea ce facem este asta
(19:26.2) luăm ca gazdă un animal asexuat iradiat
19:28.2 și luăm ca donator un animal sălbatic sexual
19:32.1 pentru altoi,
19:34.0 și ceea ce descoperim în esență este că nu numai că salvează animalul care se reproduce asexuat, ci
(19:38.2) îi transformă de fapt în animalul sexual hermafrodit.
19:42.1 Deci, este foarte important să știm asta
19:44.2 pentru că asta ne spune că celulele stem, neoblastele,
19:46.2 poate da naștere nu numai țesuturilor somatice, ci
19:49.1 dar și liniei germinale,
19:51.0 sugerând că aceste celule sunt la fel de aproape de o celulă stem totipotentă
19:54.0 așa cum poți intra în regnul animal,
19:56.3 și le face și mai interesante de încercat să înțeleagă
19:59.1 pentru că ne-ar putea ajuta să înțelegem și să disecționăm
20:02.2 procesele prin care celulele își controlează potența.
20:05.1 Bine?
20:06.1 Deci, cum populează țesutul?
20:08.1 Bine?
20:09.2 Adică, le transplantezi într-un animal și întrebarea este.
20:12.0 sunt nediferențiați,
(20:13.3) deci se mișcă, doar migrează
20:16.2 printr-o proliferare pasivă,
20:18.1 sau ce fac ei?
(20:19.2) Așadar, aceasta este lucrarea unui student absolvent în laborator la acea vreme,
20:21.1 Otto Guedelhoefer,
20:22.2 care a folosit în esență instrumentele pe care le-am identificat
20:25.1 cu acele profiluri de expresie a genelor
20:28.0 pentru a eticheta neoblastele și descendenții lor,
20:29.3 și apoi putem urmări soarta acestor celule în timp.
20:34.0 Deci, iată un animal iradiat care a primit o grefă,
20:35.2 iată grefa cu țesut normal de tip sălbatic,
20:37.1 toate punctele albastre sunt celule stem cu marker PIWI,
20:40.1 și acum punem întrebarea,
20:41.3 ce se întâmplă în timp?
20:43.1 3 zile, 4 zile, până la 12 zile după transplant sau PT?
20:47.1 Și ceea ce puteți vedea aici este că,
20:48.2 ca un epicentru,
20:50.2 celulele încep să migreze radial
20:52.3 pentru a repopula animalul.
20:54.0 Deci celulele se pot mișca, bine?
20:55.2 Și așa salvează țesutul,
20:57.2, ceea ce este cu adevărat important pentru noi să știm,
(20:59.2) că, chiar și atunci când sunt nediferențiați, ei par să se miște într-o anumită măsură,
21:02.2 nu foarte repede,
21:04.3 dar se mișcă într-o anumită măsură.
21:06.2 Deci, acum putem pune întrebarea,
21:08.0 se mișcă și apoi proliferează,
21:09.2 sau se mișcă pe măsură ce proliferează?
21:11.1 Așa că am folosit acest marker care etichetează activitatea mitotică,
21:13.0 iată animalul cu altoi,
21:15.2 iată activitatea de proliferare,
21:18.1 și după cum puteți vedea,
21:19.3 ceea ce se întâmplă este că celulele migrează din țesut,
21:22.1 și puteți vedea țesutul aici, în centru,
21:24.0 puteți vedea celule pozitive în țesutul iradiat preexistent,
21:26.3 și acelea sunt celule care se divid.
21:29.0 Deci, în esență, ele doar se extind și repopulează organismul.
21:32.2 Și aici vine clincherul, bine,
21:35.0 acesta este marele experiment pe care Étienne Wolf și François Dubois
21:39.2 a venit cu.
21:40.1 Acum putem pune întrebarea, după cum urmează:
21:41.2 Ei chiar migrează? Bine?
(21:43.1) Putem veni cu o paradigmă experimentală
21:45.2 care ne-ar permite să măsurăm acest lucru?
21:46.2 Și aceasta este strălucirea experimentului.
21:48.1 Ceea ce au decis să facă a fost să ia o planară, bine,
21:51.0 și apoi puneți un mic scut de plumb deasupra,
21:53.3 și apoi expune capul și coada la iradiere letală.
(21:57.2) Acest lucru ar trebui să elimine în esență toate neoblastele
22:00.1 în cap și coadă,
22:01.3 și acum pui întrebarea,
22:03.0 faceți celulele protejate din centrul animalului,
22:05.1 vor călători acum înainte și posterior
22:08.2 să repopuleze acele țesuturi și să le salveze?
22:10.1 Deci, aceasta este situația.
22:12.1 Acestea sunt celule nediferențiate,
22:14.2 sunt protejați de plumb,
22:16.0 ce fac ei?
22:18.0 Deci, am repetat experimentele,
(22:19.2) am făcut aceste mici poduri de plumb și așa acum.
22:22.1 iată animalele,
22:23.3 sunt supuși la iradiere,
22:25.2 capetele anterioare și posterioare au fost supuse iradierii,
22:27.0 centrul a fost protejat de conducere.
22:29.1 După cum puteți vedea deja,
22:31.2 țesuturi precum capul, de exemplu, în acest organism chiar aici
22:35.1 încep să se resoarbe.
22:36.2 Ei nu sunt salvați de neoblasti.
22:38.2 Așa că acum putem pune întrebarea cu marcatorii,
22:40.2 ce fac ei?
22:42.0 Și puteți vedea aici țesutul protejat, neoblastele sunt acolo,
22:44.3 capul și coada nu sunt etichetate,
22:46.3 și ceea ce se întâmplă în timp este că
22:49.0 celulele nu migrează deloc.
(22:50.2) Țesuturile încep să se destrame
22:52.2 și chiar dacă țesuturile se destramă,
22:54.0 aceste neoblaste sunt staționare.
22:56.1 Nu migrează deloc.
22:57.2 Apoi am pus întrebarea, ei bine, ce se întâmplă
23:00.0 dacă tăiați efectiv animalul?
23:01.2 Ce se întâmplă dacă acum luăm aceste animale
23:03.1 care sunt protejate la mijloc
23:04.2 și să-i decapiteze?
23:05.3 Decapitarea ar forța acum aceste celule
23:09.1 să mobilizeze și să repopuleze animalul?
23:10.2 Și când facem asta,
23:12.2 prin decapitarea animalului, aceasta este ceea ce vedem.
23:14.2 Deci, nu există nicio amputare,
23:16.1 iată frontul de undă al neoblastelor,
23:18.2 și când scoatem capul,
23:20.2 acum putem vedea celulele exprimându-se în esență.
23:23.0 sau prezent chiar în apropierea planului de amputare,
23:26.0 sugerând că migrau.
23:28.0 Nu numai că migrează, ci
23:29.1 ei migrează direcțional,
23:30.3 pentru că dacă te uiți la coadă,
23:32.1 nu vedem nicio migrare a acestor celule către coadă.
23:34.1 Deci, neoblastele pot fi efectiv mobilizate,
23:36.2 și acesta este un atribut al celulelor stem din planari
23:39.1 de care nu eram conștienți,
23:41.1 și este foarte important pentru noi să fim conștienți
23:44.0 pentru ca noi să înțelegem ce simt aceste celule în mediu
23:46.2 pentru a le permite să creeze un răspuns regenerativ.
23:49.1 Deci, aceste studii ne permit apoi să concluzionam că
23:53.2 neoblastele migrează atunci când animalele sunt rănite,
23:55.2 când există un pod,
23:57.1 o punte transversală de integritate structurală,
23:59.1 și că migrarea acelor celule pare a fi direcțională,
24:02.1 deci nu este doar o plimbare aleatorie,
24:03.3 este direcțională.
24:05.1 Asta sugerează că planul amputației
24:06.3 trimite un semnal foarte puternic și specific
24:08.2 pentru ca celulele să se mobilizeze în locul respectiv.
24:12.1 Și ultimul lucru pe care vreau să-l împărtășesc cu voi
24:15.1 despre neoblaste
24:17.1 este o descoperire cu adevărat surprinzătoare
24:18.3 pe care nu anticipam să le facem.
24:20.1 Am vrut să perturbăm cu adevărat diviziunea celulară
24:22.0 pentru că știm că acestea sunt singurele celule care se divid,
24:24.0 și așa am crezut că, de ce nu?
24:26.0 Dacă modulăm acest lucru,
(24:27.2) ar trebui să modulăm capacitatea acestor celule
24:29.1 pentru a face diferite tipuri de țesut.
24:30.3 Așadar, aceasta a fost o colaborare între laboratoare.
24:33.2 laboratorul meu și laboratorul lui Wallace Marshall de la UCSF,
24:36.2 unde un om de știință postdoctoral foarte talentat,
24:39.1 Juliette Azimzadeh,
24:40.3 a vrut să afle cum
(24:43.2) cilii din organisme sunt construiți și reglați.
24:47.1 Așadar, știm, așa cum v-am spus mai devreme,
24:49.2 că acestea sunt singurele celule care se divid în planari
24:51.2 -- acesta este un neoblast în telofază --
24:54.1 și pentru a diviza trebuie să formați aceste structuri centriolare
24:57.3 care se leagă de asteri
25:01.1 pentru a separa cromozomii unul de celălalt.
25:03.1 Și știm din literatură
25:05.3 că asta se întâmplă.
25:07.1 Puteți vedea centriolii în roșu,
25:08.2 acesta este un film pe care l-am împrumutat de la Jordan Raff de la Universitatea Oxford,
25:11.1 și apoi acestea sunt. uhhh.
25:13.3 divizarea centriolilor.
25:16.0 În verde este ADN-ul real
25:18.1 și în roșu sunt asterii
(25:20.2) separarea celulelor și producerea a două celule fiice dintr-o celulă.
25:24.1 Așa că de mulți ani ne-am gândit la asta
(25:26.2) centriolii sunt absolut esenţiali pentru orientarea celulelor
25:29.0 și separarea cromozomilor,
25:30.2 și că toate animalele folosesc de fapt centrioli
25:33.1 pentru a executa această funcție.
25:35.1 Deci, ne-am gândit, bine, bine,
25:38.1 să clonăm toate proteinele centriolare
25:39.2 și apoi să vedem ce găsim.
25:41.1 Și așa am făcut asta și am fost surprinși de asta
25:44.0 nu a afectat diviziunea celulară,
25:45.2 și, deci, noi, ei bine, de ce este asta?
25:47.1 Așa că ne-am uitat puțin mai adânc
25:49.2 și apoi ne-am dat seama că există cel puțin două tipuri de diviziune celulară:
25:51.2 așa-numitele centrosomal și acentrozomal.
25:54.0 Acesta este tipul de diviziune celulară pe care îl vedeți în celulele germinale,
25:56.1 cei care produc gameți.
25:58.0 Nu au nevoie de centrioli la vârfurile asterilor
26:00.2 pentru ca separarea să continue.
26:02.2 Și când ne uităm la planari, în esență,
26:05.1 vedem că există centrioli,
26:06.1 dar sunt asociate cu cilii,
26:07.2 cilii ventrali ai animalelor,
26:09.0 dar nu sunt deloc necesare,
26:12.1 pentru proliferarea acestor animale.
26:14.1 Deci, dacă te uiți la aceste componente corect,
26:16.1 sas-4 și plk-4,
26:17.3 neoblastele s-au regenerat,
26:21.0 dar gene care afectează ciclul celular
26:22.3 împiedică aceeași regenerare,
26:24.3 și unde ajungeți prin a testa prezența sau absența centriolilor
26:27.3 folosind un anticorp împotriva acestei proteine,
26:30.2 ne-am dat seama că neoblastele nu au centrioli.
26:33.2 Deci, acesta este un exemplu, pentru prima dată,
26:36.1 al unui animal care face diviziunea celulară,
26:38.2 diviziunea celulară mitotică,
26:40.1 deloc fără centrioli, complet nebănuit.
26:43.2 Și când ne uităm la microscopia electronică
26:45.1 putem vedea cromozomii,
26:47.1 putem vedea stâlpul axului,
26:49.1 puteți vedea această matrice pericentriolară,
26:50.3 dar nu există centrioli în această diviziune celulară.
26:53.1 Deci, după cum am spus, aceasta este prima demonstraţie
26:55.1 că centriolii nu sunt esențiali pentru mitoza animală
26:57.0 și aș dori să sugerez asta
26:59.0 probabil că va fi adevărat și pentru alte organisme,
27:01.0 și că această diviziune celulară acentriolară
27:03.1 este comun pentru meioză, dar nu pentru mitoză,
27:05.2 chiar dacă planarii fac doar mitoză
27:08.2 din câte putem spune.
27:10.0 Bine, deci, cum sunt neoblastele atunci
27:13.1 reglementate pentru a produce tipul potrivit
27:16.0 și numărul de celule
27:17.2 să menţină forma şi funcţia animalului?
27:18.3 Deci, ți-am spus tot timpul
27:20.2 că atunci când tăiați aceste animale în trei fragmente.
27:22.1 fragmentul de cap nu are faringe,
27:23.3 trebuie să ia niște neoblaste,
(27:25.2) coopta-i într-un mod care poate produce faringe
27:28.1 astfel încât să puteți finaliza regenerarea unui animal complet.
(27:31.1) Coada este la fel.
27:32.2 Trebuie să generați un cap,
27:34.2 generează un faringe,
27:36.1 și permite animalului să se regenereze într-un organism complet.
27:38.1 Și același lucru este valabil și pentru portbagaj, bine?
27:40.2 Deci, cum o face?
27:42.2 Nu sunt doar tipurile de.
27:44.2 locația și poziția acestor țesuturi,
27:47.1 dar știm și că există evenimente de semnalizare
27:48.3 la capătul anterior și la capătul posterior
27:50.1 care nu sunt moştenite, ca să spunem aşa,
27:53.0 de fragmentele amputate.
27:54.0 Deci, cumva, acest fragment, acum,
27:55.2 trebuie să activeze acest semnal posterior
27:57.2 pentru a permite animalului să aibă atât semnale anterioare, cât și posterioare.
28:01.2 Nu ne este clar cum se face acest lucru,
28:04.0 și așa am dori să sugerăm asta
28:07.1 acest tip de reglementare se va baza în esență
28:10.2 despre ce stare de determinare sau diferenţiere
28:14.2 aceste neoblaste, care locuiesc în mijlocul animalului,
28:16.3 poate fi sau nu.
28:18.3 Și chiar acum ipoteza populară este aceea
28:22.1 aceste neoblaste preiau sau dobândesc, în esență,
28:25.1 soarte specifice.
28:26.0 Este ceea ce ne referim drept model determinist,
28:28.1 unde celula stem pluripotentă
28:30.1 produce progenitori specializați,
28:31.1 și acești progenitori specializați vor continua
28:33.2 pentru a produce celulele necesare
28:36.1 după plasticitatea indusă de leziuni,
28:38.1 și apoi în cele din urmă, odată ce toate cele reparate,
28:40.1 revine din nou la homeostazie,
28:42.1 chiar înainte de amputare.
(28:43.2) Acest lucru este foarte greu de realizat
28:48.1 folosiți ca explicație
28:50.1 pentru cum fragmente de animale
28:53.1 care nu au nici capătul anterior, nici capătul posterior,
28:55.0 sau oricare dintre semnale,
28:56.2 resetându-se, dacă aceste celule sunt deja angajate
28:59.0 la această stare homeostatică particulară.
29:00.2 Deci, ceea ce favorizăm în laborator chiar acum
29:03.1 este un model alternativ,
29:04.3 la care ne referim ca model probabilist,
29:06.1, ceea ce înseamnă că niciodată neoblastele nu sunt cu adevărat
29:09.3 dedicat unei anumite soarte,
29:11.1 dar în esență intră și ies
(29:13.2) o anumită stare probabilistică. probabilistic.
29:16.2 Și asta permite un grad extraordinar de plasticitate
29:19.0 astfel încât, în funcție de context,
29:21.0 dacă un animal este amputat
29:23.0 și acea celulă se afla în acest jgheab special,
29:25.1 poate ieși de fapt din el și apoi,
29:27.0 prin semnalele de amputare,
29:28.2 să fie canalizat într-un mod specific.
29:30.0 Deci nu sunt toți în anumite canale
29:32.1 care sunt predeterminate și nu sunt interschimbabile,
29:35.1 dar este un model probabilistic
29:36.3 unde celulele intră și ies.
29:38.1 Așadar, ne-am dori să, în viitorul apropiat,
29:39.2 încercați să vizualizați acest lucru văzând
29:42.1 dacă același neoblast se poate porni și opri sau nu
29:45.3 gene diferite asociate cu sorti diferite.
(29:47.1) 29:47.1 Și așa este, atunci modelul probabilistic va fi.
29:52.1 umm. vom avea dovezi care să susțină asta.
29:55.0 Deci asta am învățat
29:58.3 pe scurt despre neoblaste.
30:00.2 Trebuie să aflăm mult mai multe.
30:03.0 În esență, cum controlați numărul de neoblaste din animal?
30:06.2 Cum controlezi soarta acestor celule
30:08.2 atât în ​​condiții homeostatice, cât și în condiții de regenerare?
30:11.1 Și cred că anii următori ne vor oferi
30:14.0 cu o înțelegere foarte clară
30:15.2 despre modul în care celulele stem funcționează de fapt, așa cum ar fi,
30:18.1 într-un organism adult in vivo.


12.2 Reducerea dimensiunilor

Adesea, o variabilă conține puține informații care sunt relevante pentru sarcina în cauză. Chiar și pentru variabilele care sunt informative, poate exista redundanță sau aproape duplicarea variabilelor. Adică, două sau mai multe variabile oferă în esență aceleași informații - au modele similare în toate cazurile.

Astfel de variabile irelevante sau redundante fac mai greu de învățat din date. Variabilele irelevante sunt pur și simplu zgomotul care ascunde tiparele reale. În mod similar, atunci când două sau mai multe variabile sunt redundante, diferențele dintre ele pot reprezenta zgomot aleatoriu. În plus, pentru unii algoritmi de învățare automată, un număr mare de variabile (p) vor prezenta provocări de calcul. De obicei, este util să eliminați variabilele irelevante sau redundante, astfel încât ele – și zgomotul pe care îl transmit – să nu ascundă tiparele pe care algoritmii de învățare automată le-ar putea identifica.

De exemplu, luați în considerare voturile într-un parlament sau un congres. Mai exact, vom explora Parlamentul Scoțian în 2008. 22 Legiuitorii votează adesea împreună în blocuri pre-organizate și, astfel, modelul „da” și „nu” pe anumite buletine de vot poate indica ce membri sunt afiliați (adică membrii aceluiași partid politic). Pentru a testa această idee, ați putea încerca să grupați membrii după numărul lor de vot.

Tabelul 12.1: Exemplu de date privind înregistrările de vot de la Parlamentul Scoțian.
Nume S1M-1 S1M-4.1 S1M-4.3 S1M-4
Canavan, Dennis 1 1 1 -1
Aitken, Bill 1 1 0 -1
Davidson, domnule David 1 1 0 0
Douglas Hamilton, Lord James 1 1 0 0
Fergusson, Alex 1 1 0 0
Fraser, Murdo 0 0 0 0
Gallie, Phil 1 1 0 -1
Goldie, Annabel 1 1 0 0
Harding, domnule Keith 1 1 0 0
Johnston, Nick 0 1 0 -1

Tabelul 12.1 prezintă o mică parte din registrul de vot. Numele membrilor parlamentului sunt cazurile. Fiecare buletin de vot – identificat printr-un număr de dosar, cum ar fi – este o variabilă. Un 1 înseamnă un vot „da”, -1 este „nu”, iar 0 este o abținere. Există (n=134) membri și (p=773) buletine de vot—rețineți că în acest set de date (p) depășește cu mult (n) . Nu este practic să afișați toate cele peste 100.000 de voturi dintr-un tabel, dar există doar 3 voturi posibile, așa că afișarea tabelului ca imagine (ca în Figura 12.5) funcționează bine.

Figura 12.5: Vizualizarea voturilor Parlamentului Scoțian.

Figura 12.5 este o grilă (134 imes 773) în care fiecare celulă este codificată cu culori pe baza votului unui membru al Parlamentului la un buletin de vot. Este greu să vezi un model mare aici, deși este posibil să observi structura tartanului scoțian. Modelul tartan oferă experților o indicație că matricea poate fi aproximată printr-o matrice de rang scăzut.

12.2.1 Abordări intuitive

Pentru început, Figura 12.6 arată valorile buletinelor de vot pentru toți membrii parlamentului pentru doar două buletine de vot selectate în mod arbitrar. Pentru a oferi o idee mai bună a numărului de puncte la fiecare poziție, valorile sunt agitate prin adăugarea de zgomot aleatoriu. Punctele roșii sunt pozițiile reale. Fiecare punct este un membru al parlamentului. Membrii aliniați în mod similar sunt grupați împreună la una dintre cele nouă posibilități marcate cu roșu: (Da, Nu), (Da, Abține), (Da, Da) și așa mai departe până la (Nu, Nu). În aceste două buletine de vot sunt populate opt din cele nouă posibilități. Înseamnă asta că există opt grupuri de membri?

Figura 12.6: Parlamentul scoțian votează pentru două buletine de vot.

Intuiția sugerează că ar fi mai bine să se folosească toate din buletinele de vot, mai degrabă decât doar două. În Figura 12.7, primele 387 de buletine de vot (jumătate) au fost adunate împreună, la fel ca buletinele de vot rămase. Figura 12.7 sugerează că ar putea exista două grupuri de membri care sunt aliniate unul cu celălalt. Utilizarea tuturor datelor pare să ofere mai multe informații decât utilizarea doar a două buletine de vot.

Figura 12.7: Scatterplot care arată corelația dintre voturile Parlamentului Scoțian în două colecții arbitrare de buletine de vot.

12.2.2 Descompunerea valorii singulare

Vă puteți întreba de ce a fost făcută alegerea de a adăuga prima jumătate a buletinelor de vot ca (x) și buletinele de vot rămase ca (y) . Poate că există o alegere mai bună pentru a afișa modelele de bază. Poate ne putem gândi la o modalitate de a aduna buletinele de vot într-un mod mai semnificativ.

De fapt, există o abordare matematică pentru găsirea Cel mai bun aproximare a matricei buletin de vot–alegător folosind matrici simple, numite descompunerea unei valori singulare (SVD). (Tehnica de reducere a dimensiunii statistice a Analiza componentelor principale (PCA) poate fi realizat folosind SVD.) Matematica SVD se bazează pe cunoștințele de algebră matriceală, dar operația în sine este accesibilă oricui. Geometric, SVD (sau PCA) echivalează cu o rotație a axelor de coordonate, astfel încât mai multă variabilitate poate fi explicată folosind doar câteva variabile. Figura 12.8 arată poziția fiecărui membru pe cele două componente principale care explică cea mai mare variabilitate.

Figura 12.8: Gruparea membrilor Parlamentului Scoțian pe baza SVD de-a lungul membrilor.

Figura 12.8 arată, dintr-o privire, că există trei clustere principale. Cercul roșu marchează in medie membru. Cele trei grupuri se îndepărtează de medie în direcții diferite. Există mai mulți membri a căror poziție este între medie și grupul de care sunt cel mai aproape. Aceste grupuri pot dezvălui alinierea membrilor parlamentului scoțian în funcție de afilierea la partid și istoricul voturilor.

Pentru un grafic, unul este limitat la utilizarea a două variabile pentru poziție. Cu toate acestea, gruparea se poate baza pe mai multe variabile. Utilizarea mai multor sume SVD poate permite ca cele trei grupuri să fie împărțite în continuare. Culoarea din Figura 12.8 de mai sus arată rezultatul solicitării a cinci grupuri folosind cele mai bune cinci sume SVD. Matricea de confuzie de mai jos compară partidul real al fiecărui membru cu apartenența la grup.

Cât de bine a funcționat algoritmul de clustering? Afilierea de partid a fiecărui membru al parlamentului este cunoscută, chiar dacă nu a fost folosită la găsirea clusterelor. Clusterul 1 este format din majoritatea membrilor Partidul Național Scoțian (SNP). Clusterul 2 include un număr de indivizi plus toți, cu excepția unuia dintre liberal-democrații scoțieni. Clusterul 3 preia restul de 10 membri ai SNP. Clusterul 4 include toți membrii Partidul Conservator și Unionist Scoțian, în timp ce Clusterul 5 reprezintă toți membrii, cu excepția unui singur Muncitoresc scoțian parte. Pentru majoritatea partidelor, marea majoritate a membrilor au fost plasați într-un grup unic pentru acel partid, cu o mică parte de alți colegi cu drept de vot. Cu alte cuvinte, tehnica a identificat corect aproape toți membrii celor patru partide diferite cu reprezentare semnificativă (adică, conservator și unionist, laburist, liberal-democrat și național).

Figura 12.9: Gruparea buletinelor de vot pentru Parlamentul Scoțian pe baza SVD de-a lungul buletinelor de vot.

Din datele buletinului de vot trebuie extrase mai multe informații. Așa cum există grupuri de poziții politice, există grupuri de buletine de vot care ar putea corespunde unor factori precum efectul social, efectul economic etc. Figura 12.9 arată poziția buletinelor de vot, folosind primele două componente principale.

Există grupuri evidente în această figură. Totuși, interpretarea poate fi dificilă. Amintiți-vă că, pentru fiecare număr, există atât voturi „da”, cât și „nu”. Acest lucru explică simetria punctelor din jurul centrului (indicate cu roșu). Punctele opuse de-a lungul fiecărui unghi din centru ar putea fi interpretate în termeni de social liberal impotriva social conservator și liberal din punct de vedere economic impotriva conservatoare din punct de vedere economic. Decizia care implică probabil citirea proiectului de lege în sine, precum și o înțelegere nuanțată a politicii scoțiane.

În cele din urmă, componentele principale pot fi folosite pentru a rearanja membrii parlamentului și pentru a rearanja separat buletinele de vot, menținând în același timp votul fiecărei persoane. Aceasta înseamnă pur și simplu reordonarea membrilor într-un alt mod decât alfabetic și în mod similar cu buletinele de vot. O astfel de transformare poate aduce o claritate dramatică apariției datelor – așa cum se arată în Figura 12.10 – unde blocurile de vot mari, aproape egale și opuse ale celor două partide politice majore (partidele Național și Laburist) devin evidente. Alianțele dintre partidele politice mai mici tulbură apele în jumătatea inferioară a Figurii 12.10.

Figura 12.10: Ilustrarea voturilor Parlamentului Scoțian atunci când sunt comandate de vectorul primar al SVD.

Persoana reprezentată de rândul de sus în Figura 12.10 este Nicola Sturgeon, liderul Partidului Național Scoțian. De-a lungul vectorului primar identificat de SVD-ul nostru, ea este cea mai extremă alegătoare. Potrivit Wikipedia, Partidul Național aparține unei „tradiții social-democrate europene de masă”.

În schimb, persoana din partea de jos a figurii 12.10 este Paul Martin, membru al Partidului Laburist din Scoția. Este ușor de observat în Figura 12.10 că Martin s-a opus lui Sturgeon la majoritatea voturilor.

Frumusețea figurii 12.10 este că aduce ordine profundă haosului aparent din figura 12.5. Acest lucru a fost realizat prin simpla ordonare a rândurilor (membrilor Parlamentului) și a coloanelor (buletinele de vot) într-un mod rezonabil. În acest caz, ordonarea a fost determinată de vectorul primar identificat de SVD-ul matricei de vot. Acesta este încă un exemplu al modului în care tehnicile de învățare automată pot identifica modele semnificative în date, dar ființelor umane li se cere să aducă cunoștințele de domeniu pentru a obține o înțelegere contextuală semnificativă.


6 Răspunsuri 6

Mai întâi aș scăpa de împrumutul pentru studenți. Acest lucru vă va lăsa cu 11K. Atunci aș folosi asta pentru a-ți finanța ROTH. Dacă ești căsătorit, poți pune până la 5.000 pe an fiecare.

Pentru orice bani rămași, aș deschide un fond mutual obișnuit (nu beneficiat de avantaje fiscale). Puteți contribui cu jumătate din banii pe care i-ați plătit pentru împrumuturile dvs. pentru studenți, iar cealaltă jumătate poate merge la creditul ipotecar.

De asemenea, m-aș uita să fac o reparație la casa ta. Este posibil să puteți muta 10 sau 15 ani la plata curentă a ipotecii.

Nu aș recomanda plata datoriilor. Ambele sunt împrumuturi cu dobândă scăzută, deductibile din impozite, pe care le-ați gestionat suficient de bine pentru a avea economii semnificative și, probabil, puteți câștiga o rată a dobânzii mai mare investind decât ați putea plăti datoria. Punerea banilor în ETF-uri de avangardă sau într-un cont de îmbunătățire va fi probabil mai bine pe termen lung.

Când vă gândiți dacă să plătiți împrumutul pentru studenți, rețineți că, deoarece lucrați pentru o organizație non-profit, o parte sau toată datoria respectivă poate fi iertată după 10 ani în cadrul Programului de iertare a împrumuturilor de serviciu public.

De asemenea, aș dori să fiu ușor contrariant la întrebarea principală. Îmi place să am multe economii și puține datorii la fel de mult ca următoarea persoană. Dar, cu excepția cazului în care v-ați planificat viața cu așteptarea că veți primi acest legat, este o excepție. Dacă nu făceai deja o treabă excelentă de economisire pentru situații de urgență și pensie sau dacă aveai multe datorii de consum, aș spune că ar trebui să folosești banii pentru a-ți stabiliza finanțele înainte de a face orice altceva. Dar finanțele tale par stabile. Așa că ia o parte din exploatare și fă ceva frumos cu el. Călătorește la casa strămoșească a regretatei tale bunici. Înzestrați o mică bursă în memoria ei. Cumpără un mic lux pe care nu l-ai putea gestiona niciodată cu propriul tău salariu. Nu sugerez să-l cheltuiți pe tot, dar folosirea a 20% din ea pentru ceva care altfel nu este la îndemână vă va oferi amintiri bune și totodată vă va lăsa material mai bine.

Economisirea pentru viitor este importantă. Achitarea datoriilor este importantă. Să te bucuri de viață când poți de asemenea important. Echilibrul este totul.

Ai creat un fond grozav de urgență și nicio datorie cu cardul de credit. Este ceva de care să fii mândru. Dacă nu ai avut deja grijă de aceste două lucruri, asta ar fi prima ta prioritate.

Dacă aș fi în situația ta, aș plăti împrumutul pentru studenți. Da, este o rată a dobânzii scăzută, dar ai ocazia să o achizi complet și să elimini o plată lunară din viața ta. Ia-l.

Nu știu dacă ați contribuit deja la IRA Roth pentru anul acesta sau nu, dar aș pune deoparte 11.000 USD pentru a acoperi contribuția maximă la IRA Roth pentru anul acesta și anul viitor.

Rămân aproximativ 10.000 de dolari. Aveți bani rezervați pentru următoarea mașină? Dacă nu, alocați cei mai mulți bani pentru următoarea mașină. Când trebuie să cumpărați o altă mașină, veți putea să plătiți numerar și să evitați un împrumut auto.

Alții au sugerat să plătiți împrumutul pentru studenți, mai ales pentru satisfacerea unei plăți mai puțin, dar vă sugerez să faceți calculul cu privire la cât de multă dobândă ați economisi dacă plătiți din timp pentru fiecare împrumut:

  1. Nu ați spus câți ani ați trecut în fiecare dintre aceste împrumuturi sau care a fost soldul inițial al împrumutului, ci ați făcut câteva ghiciri brute (de exemplu, pe http://www.bankrate.com/calculators/mortgages/amortization-calculator .aspx) ați putea plăti cu ușurință 600 USD pe lună în dobândă la creditul ipotecar. Dacă aplicați 50K la credit ipotecar și săriți în jos câțiva ani în programul de amortizare, acum plătiți 475 USD pe lună în dobândă (din nou acestea sunt doar presupuneri, deoarece nu cunosc toate detaliile despre împrumutul dvs.). Chiar dacă plata dvs. nu s-a schimbat, acei 125 USD în plus sunt acum direcționați către principal și, astfel, vă construiesc capitalul propriu și valoarea netă.
  2. Faceți același calcul cu soldul împrumutului pentru studenți. Câtă dobândă veți plăti pentru restul împrumutului și cum se compară aceasta cu calculele dvs. de la pasul 1 pentru ipoteca în aceeași perioadă de timp?

Când faci calculele, cred că vei vedea de ce achitarea datoriei cu cea mai mare rată a dobânzii este aproape întotdeauna cel mai bun sfat.

Dacă puteți refinanța ipoteca la o rată mai mică este o întrebare separată, dar calculul de mai sus s-ar aplica în continuare, doar cu programe de amortizare diferite.

Menționați doar două datorii, ipotecare și împrumut pentru studenți, dar menționați economii de 19.000 USD, ceea ce sugerează că sunteți un economisitor și probabil că nu aveți alte datorii.

Nu ti-ai mentionat (net) venituri si cheltuieli (adeverinta de venit), dar din moment ce ai economii substanțiale, probabil că trăiești în limitele posibilităților tale (venituri > cheltuieli). Deoarece menționați 38.000 USD la pensie, am putea concluziona că economisiți în mod regulat pentru pensie (economisiți 10% pentru pensionare)?

Nu ați menționat nicio afecțiune medicală sau alte datorii, care ar putea necesita economii mari, așa că aș sugera să faceți economii de 6 luni (2,5K USD x 6 = 15K USD), dar dacă cheltuielile dvs. nete sunt mai mici, ați putea reduce acest lucru (2K USD). x 6 = 12.000 USD).

Nu menționați nicio investiție pe care ați dori să o faceți, dar, deoarece nu ați menționat nicio investiție candidată, putem presupune că nu aveți (specific) investiții pe care le găsiți deosebit de atractive. Nu ați menționat nimic pe care îl salvați pentru a cumpăra și ați putea dori să cumpărați.

Ați combinat 19.000 USD + 50.000 USD = economii de 69.000 USD, iar 15.000 USD ar fi economii de urgență confortabile, lăsând 54.000 USD pe care i-ați putea folosi pentru a reduce datoria ipotecară sau împrumutului pentru studenți.

Dobânda datoriei ipotecare @4,5%, este mai mare, așa că achitarea acelei datorii ar fi ca și cum ați câștiga 4,5% rentabilitate garantată a banilor tăi, fără taxe. La venitul dvs., rata de impozitare marginală este suficient de mică decât deducerea dobânzii ipotecare (dacă detaliezi) nu ar reduce mult acest randament (15% dacă detaliezi).

Dobânda datoriei împrumutului pentru studenți @2,8%, ar fi ca și cum ați câștiga 2,8% rentabilitate garantată a banilor tăi, fără taxe.

În mod clar, randamentul mai mare al „investiției” dvs. în achitarea datoriilor ar reduce soldul dvs. ipotecar (rentabilitatea investiției cu peste 50% mai mare, în comparație cu datoria împrumutului pentru studenți).

Nu ați menționat nicio circumstanță care ar putea determina creșterea ratei împrumutului pentru studenți, a ratei ipotecarei, și nici nu ați menționat vreo dificultate în efectuarea plăților ipotecare și împrumutului pentru studenți, sumele oricăreia dintre plăți și nici numărul de ani rămase până la plătiți pentru oricare.

Dacă aveți nevoie (sau doriți) să vă reduceți plățile, puteți alege să plătiți împrumutul pentru studenți pentru a elimina o singură plată și, astfel, a vă reduce cheltuielile. Sau puteți alege să plătiți ipoteca și să refinanțați (sau să refactorizați) ipoteca pentru a obține o plată mai mică. O altă strategie (presupunând că aveți casa dvs. timp de 5-7 ani), ar putea fi să plătiți ipoteca suficient pentru a o refinanța într-un împrumut de 15 ani și (presupunând că aveți un scor bun de credit) să obțineți o rată mai mică (3%). .

Dar am să vă sugerez să luați în considerare a amestecate abordare. Combinați Dave Ramsey Bulgăre de zăpadă abordare cu abordarea reducerii ratei dobânzii. Luați cei 54.000 USD (57.000 USD?) disponibili (după rezervarea unui fond de urgență pentru 6 luni) și împărțiți-le între ambele. Îți plătești creditul ipotecar cu 27.000 USD, iar datoria împrumutului pentru studenți cu 27.000 USD. Rentabilitatea combinată a investiției este (2,8+4,5)/2 = 3,65% și aveți următoarele

Următorii pași ar fi,

  • Concentrați-vă pe plata împrumutului pentru studenți și apoi folosiți banii eliberați din acea plată pentru a vă achita ipoteca.
  • Luați în considerare refinanțarea într-un împrumut de 15 ani pentru o rată mai mică a dobânzii.
  • Luați în considerare dacă un fond de urgență puțin mai mic (13.000 USD) și plata împrumuturilor pentru studenți rămase (2.000 USD) vă vor lăsa cu un fond de urgență confortabil. (Rețineți că, dacă împrumuturile dvs. pentru studenți sunt de 300 USD/lună, epuizarea suplimentară a fondului de urgență ar fi compensată de reducerea sumei fondului de urgență necesar timp de 6 luni).

Există două motive mari pentru a plăti datoria împrumutului pentru studenți. Una este abordarea Dave Ramsey Debt Snowball, care este că aceasta este datoria mai mică și, prin urmare, reprezintă un câștig psihologic, iar cealaltă este că datoria la împrumutul studențesc are un tratament special chiar și în faliment.


4. DISCUTIE

În studiul de față, prin analize in silico la scară largă ale OR din diferite specii, demonstrăm fără ambiguitate existența unor motive de aminoacizi C-terminal foarte conservate.

Motivele C-terminale ale OR identificate în acest studiu se suprapun în mare măsură cu helixul amfipatic 8, 43, 44, care într-o varietate de GPCR s-a dovedit a fi implicat în cuplarea proteinei G, dimerizarea receptorului, interacțiunea cu membrana plasmatică și internalizare. 71-76 Motivele pe care le-am identificat sunt, de asemenea, bine cunoscute în GPCR-urile non-olfactive și în alte proteine, unde au fost identificate ca locații ale interacțiunilor proteină-proteină, de exemplu în contextul mecanismelor de transport intracelular, de exemplu, retenția/recuperarea ER, sau Exportul ER/translocarea membranei plasmatice și poate fi localizat la situsurile distale și proximale ale membranei, cu implicații funcționale diferite. 32, 35, 77, 78 Locația generală a motivelor pe care le-am identificat în OR în studiul de față co-localizează sau se suprapun exclusiv cu motivele C-terminale proximale ale membranei în GPCR-uri non-olfactive care au fost validate funcțional pentru a sprijini mai degrabă traficul anterograd și/sau semnalizarea receptorilor. Conform predicției noastre bazate pe analize in silico, toate scanările noastre cu mutații alaninei cu motive care se potrivesc cu secvența consens au dus la fenotipuri de pierdere a funcției ale OR respective. Viceversa, și așa cum a fost prezis, restabilirea unei secvențe asemănătoare consensului în motivele C-terminale care deviază consensul ale OR2M3 și Olfr16 a dus la fenotipuri de receptor de câștig de funcție în ceea ce privește atât expresia membranei plasmatice, cât și semnalizarea, sugerând că conservarea C- motivele terminale în sala de operare sunt mai degrabă necesare pentru traficul lor anterograd și expresia funcțională, cel puțin în sistemele de celule de testare. Efectele dăunătoare ale abaterii de la un consens OR la ​​66 de locuri critice asupra expresiei suprafeței OR de șoarece într-un studiu recent, au sugerat că o retenție intracelulară a OR poate fi cauzată de instabilitatea lor structurală generală. 38 În studiul lor, Ikegami et al. (2020) nu au identificat, totuși, niciun motiv C-terminal conservat, asociat, de exemplu, cu traficul anterograd de RUP. Cu toate acestea, trei dintre cele patru C-terminale, „situri critice de consens SAU” identificate de Ikegami și colab. (2020) (C-termen11, C-termen13-14) se suprapun cu motivele asemănătoare consensului „KxxL” (C-term8-11), și „K[+]LL” (termen C12-15) identificate în studiul nostru.

RUP-urile adăpostesc cel mai conservat și cel mai proximal motiv C-terminal, dibazic distanțat „[+]x[+]” la termenul C3-5 (vezi și Ref. 31). Observația noastră că o mutație alaninei a reziduului de bază la termenul C3 expresia de suprafață a RUP investigate nu a atenuat niciodată este în concordanță cu rapoartele care arată că un motiv „[+]x[+]” dibazic, membranar-proximal, poate să nu fie accesibil pentru niciun mecanism de transport intracelular. 32, 35, 78 În schimb, mutația alaninei a celor mai proximale sau a ambelor reziduuri bazice la termenul C3-5, sau o trunchiere a terminalului C care a șters termenul C3-5 în OR8D1, semnalarea cAMP a diminuat sau eliminat semnificativ a OR investigate în studiul nostru, sugerând implicarea lor în cuplarea și semnalizarea proteinei G, așa cum s-a demonstrat anterior pentru reziduurile intracelulare, membrana-proximale din GPCR-uri 76, 79, 80 sau OR. 43, 44 De exemplu, experimentele de trunchiere în receptorul Mch1r al hormonului concentrator de melanină de șobolan, care a șters un motiv „RxR” dibazic de membrană proximală din helixul amfifil 8, au abolit semnalizarea proteinei G a acestui receptor. 76 La șoarecele de clasă II SAU Olfr73 (mOR-EG, MOR174-9), o trunchiere C-terminală a 12 AA a abolit funcția receptorului, 81 probabil pentru că această trunchiere a șters motivul la termenul C.12-15 (“KKLL”) precum și ultimul reziduu hidrofob al motivului C-term8-11 („KxxL”). Acest lucru merge bine cu descoperirile noastre din experimentele de trunchiere și scanările mutaționale cu OR8D1 și alte trei OR, arătând că ambele motive sunt importante pentru expresia de suprafață și semnalizarea OR.

Mai mult, mediul de aminoacizi poate influența puterea motivului respectiv. Descoperirile noastre că calitatea reziduului acid N-terminal al helixului citosolic 8 la termenul C6, adiacent motivului „RxR” al OR8D1 la termenul C3-5, semnalizarea afectată, este în conformitate cu un raport al Kawasaki et al. (2015) care au demonstrat că acest reziduu este implicat în semnalizarea proteinei G a șoarecelui SAU Olfr544 (mOR-S6). 43 Ikegami și colab. (2020) au subliniat, de asemenea, această poziție ca fiind o poziție critică de consens importantă pentru o stabilitate structurală generală a RUP. 38 În mod similar, un glutamat la o poziție omoloagă în receptorul V2 al vasopresinei umane (AVPR2), în legătură cu un motiv di-leucină C-terminal omolog cu termenul C.10-11 a motivului C-termen8-11 („KxxL”) în blocuri de operare, a afectat expresia suprafeței celulare a AVPR2. 82 În plus, experimentele viitoare pot dezvălui impactul treoninei sau asparaginei extrem de conservate în motivul dibazic „[+]x[+]” la termenul C.3-5, în OR de clasă I sau, respectiv, OR de clasă II, sau a alaninei foarte conservate la termenul C10 în cadrul motivului „KxxL” la termenul C8-11 în SAU de clasa a II-a.

Consensul C-terminal al danio rerio secvențele se abate de la consensul asupra a opt specii din studiul nostru. Prezența unui motiv C-terminal „KxxxT” extrem de conservat în danio rerio sugerează că OR de pește ar putea fi evoluat cu motive de aminoacizi C-terminal care se abat de la motivele părtinitoare pentru mamifere, așa cum sunt rezumate în tabelele 1 și 2. Acest lucru justifică o investigație a altor clade filogenetice de pești, ceea ce poate duce la descoperirea altor tipuri de pești tipice. , motive C-terminale.

În plus față de motivele C-terminale, domeniile intracelulare non-C-terminale din GPCR-uri pot conține motive conservate, dibazice, cum ar fi motivul „RxR”, care poate funcționa ca un semnal de retenție/recuperare ER în anumite GPCR. 83 Un motiv similar în OR, pe lângă motivul foarte conservat la termenul C3-5, poate fi găsit, de exemplu, în ICL315-17, cu rate de 63,6% și 76,3% în OR de clasa I și, respectiv, clasa II, iar „RxK” fiind motivul cel mai abundent în oricare dintre clase (MK, DK, observații nepublicate). Mai mult, motive distincte din domeniile N-terminale ale GPCR-urilor pot regla transportul lor intracelular, anterograd, 84-86 care a fost demonstrat pentru OR, de exemplu, cu situsuri de glicozilare N-terminale. 81 Astfel, utilizarea frecventă a etichetelor N-terminale suplimentare cu OR recombinate, totuși, poate anula într-o anumită măsură orice efecte ale motivelor lor de trafic în sistemele de celule de testare, ceea ce face dificilă demonstrarea diferențelor subtile experimentale în echipamentul lor individual cu anumite AA. motive, sau chiar un singur AA în cadrul acestor motive.

Aici, am identificat motive AA foarte conservate care discriminează între OR de clasă I și clasa II și sunt instructive pentru expresia și/sau semnalizarea lor de suprafață. Acest lucru poate sugera interacțiunea OR prin aceste motive conservate cu diferiți însoțitori, dintre care doar unele au fost identificate până acum. 25-29 Într-o familie de proteine ​​însoțitoare TIM mitocondriale, de exemplu, s-a demonstrat că motive distincte de aminoacizi sunt menținute în descendența eucariotelor și s-a sugerat că asigură o gamă largă de proteine ​​substrat care să fie însoțite de intermembrana mitocondrială. spaţiu. 87 Din experimentele noastre de modificare a motivului „RxK” tipic OR de clasă II la termenul C3-5 în OR8D1 la motivul „KxK” tipic OR de clasa I, se poate presupune că un schimb AA destul de conservator conservă mai mult sau mai puțin funcția motivului respectiv, dar totuși poate modula puterea sa efectivă. Apariția modificărilor conservatoare AA în multe dintre motivele identificate, într-adevăr, a dezvăluit o anumită degenerare a motivelor, un fenomen, care a fost raportat anterior pentru glicoziltransferaze și GPCR neolfactiv.30, 82, 88, 89 O astfel de diversificare a motivelor, împreună cu creșterea observată a numărului de diferite motive C-terminale cu evoluție, poate fi o consecință a creșterii repertoriilor OR și a unei cereri mai mari de transport intracelular reglat și semnalizare. Un grad mai mare de combinații realizabile de diferite motive C-terminale, cel puțin într-o anumită clasă de receptor, poate permite codarea zip subtilă și, astfel, reglarea fină a expresiei suprafeței OR și a semnalizării cAMP în OSN-urile lor respective.

Astfel, putem testa dacă, ipotetic, ar putea exista suficiente combinații posibile pentru a echipa OR ale unui întreg repertoriu de receptori individual cu motive C-terminale, prin calcularea unui număr maxim de combinații posibile de motive C-terminale conservate în OR numai pe diferite. poziții, prin utilizarea formulei pentru k -permutări ale lui n (selectând k articole dintr-o colecție de n articole, cu k ≤ n): n ! ( n - k ) ! ). Dacă presupunem n = 8 motive poziționale diferite (așa cum s-a identificat în acest studiu, a se vedea tabelul 3) și permitem, în mod conservator, oricărui OR de clasă I dat să adăpostească, în medie, până la k = 2 motive C-terminale diferite (comparați Figura 2C ), aceasta ar avea ca rezultat 56 de combinații. Acest număr de combinații de motive C-terminale ar permite echiparea individuală a întregului repertoriu SAU de clasa I, de exemplu, uman sau Platypus (material suplimentar, Mendeley Data, V1, https://doi.org/10.17632/49n4t7b4r2.1 ). Presupunând doar un motiv C-terminal suplimentar pentru SAU de clasă II, astfel, ar duce la 336 de combinații. Acest echipament combinatoriu cu motive C-terminale ar fi suficient pentru a acoperi, de exemplu, întregul repertoriu OR de clasa II Platypus și 86% din repertoriul OR de clasa II umană.

În acest moment, putem specula asupra unui rol ipotetic al motivelor C-terminale care discriminează cel puțin clasa I/clasa II în RUP: S-a demonstrat că secvențele de aminoacizi SAU și nivelurile de expresie determină coalescența axonală în glomerulii neuronilor senzoriali olfactivi. in vivo. 90 Mai mult, Imai et al. (2006) au demonstrat că țintirea axonilor OSN depinde de nivelurile cAMP intracelular derivate din OR. 69 Într-adevăr, RUP posedă grade individuale de activitate constitutivă în absența stimulului odorant. 91 Potrivit lui Zhang și colab. (2012), direcționarea axonală glomerulară a RUP este decuplată de specificitatea stimulului. 92 Majoritatea OSN-urilor care exprimă OR de clasa I au fost raportate că își proiectează axonii într-un domeniu anterodorsal în bulbul olfactiv de șoarece, 93 care se presupune că s-a datorat semnalizării AMPc derivate din OR, independent de odorant. 69, 91, 94 Astfel, un echipament individual, combinatoriu cu motive C-terminale care controlează expresia suprafeței RUP și/sau o semnalizare proporțională, constitutivă a cAMP poate fi instructiv cel puțin pentru o țintire diferențială a axonilor OSN care exprimă fie clasa I, fie SAU de clasa a II-a. Experimentele viitoare cu șoareci modificați genetic pot dezvălui o țintire a OSN-urilor specifice clasei OR, dependentă de motivul C-terminal.

În rezumat, aici, am demonstrat existența unor motive C-terminale extrem de conservate în OR care discriminează între receptorii de clasa I și clasa II și joacă un rol instructiv în exprimarea suprafeței celulare și semnalizarea cAMP.


Priveste filmarea: Biologie, Clasa a VII-a, Animale Nevertebrate. Încrengătura Celenterate. Clasa Hidrozoare (August 2022).