Informație

De ce este de dorit să cuplați producția chimică cu creșterea?

De ce este de dorit să cuplați producția chimică cu creșterea?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Am următoarea întrebare în biologia sistemelor: a) Desenați un grafic care arată relația de creștere (Vbio) și Vefni pentru sistem aici. (Lăsați axa orizontală să reprezinte Vbio și axa verticală să reprezinte Vefni)

Primul meu gând a fost că ar fi pur și simplu linie dreaptă de la (0,5,0,5) la (1,0). Dar acum mă gândesc că trebuie să țin cont și de V4.

b) Determinați una sau mai multe reacții care sunt de așa natură încât, dacă sunt eliminate, producția de M4 este cuplată cu creșterea (cuplarea creșterii). Desenați un grafic care să arate relația Vbio și Vefni pentru mutant.

Aici am crezut că ar fi V1 și V4. Nu sunt sigur însă, pentru că nu am găsit o explicație bună pentru ce este exact cuplarea creșterii.

c) De ce este de dorit să cuplați producția chimică cu creșterea? adică ce avantaje au acele sisteme față de cele în care nu există o astfel de cuplare?

Aici habar n-am.


De ce este de dorit să cuplați producția chimică cu creșterea?

Atunci când se proiectează noi căi metabolice pentru producția chimică, trebuie să țineți cont de faptul că scopul acestora este de a se extinde (adică pentru a atinge dimensiunea industrială).

Din punct de vedere industrial, cu cât un proces este mai rapid/mai simplu, cu atât mai bine. Producția chimică cuplată cu creșterea înseamnă că este necesară o singură etapă pentru a produce produsul dorit (înainte de procesele din aval). În caz contrar, ar trebui să se producă mai întâi biomasa (etapa de creștere) și apoi să se treacă la etapa de producție chimică. Un pas este mai ieftin și mai rapid decât doi, fără a menționa pașii intermediari care ar putea fi necesari (spălarea celulelor, centrifugare, filtrare...).

Principalul dezavantaj al producției chimice cuplate cu creștere este că randamentul final ($mol_{produs final~}/mol_{substrat}$) este împiedicat de producția de biomasă. Aceasta poate fi o problemă reală dacă substratul este scump.


32.3: Reproducerea asexuată

  • Contribuție de OpenStax
  • Biologie generală la OpenStax CNX
  • Comparați mecanismele și metodele de reproducere asexuată naturală și artificială
  • Descrieți avantajele și dezavantajele reproducerii asexuate naturale și artificiale
  • Discutați durata de viață a plantelor

Multe plante sunt capabile să se înmulțească folosind reproducerea asexuată. Această metodă nu necesită investiția necesară pentru a produce o floare, a atrage polenizatori sau pentru a găsi un mijloc de răspândire a semințelor. Reproducerea asexuată produce plante care sunt genetic identice cu planta mamă, deoarece nu are loc amestecarea gameților masculini și feminini. În mod tradițional, aceste plante supraviețuiesc bine în condiții de mediu stabile în comparație cu plantele produse din reproducere sexuală, deoarece poartă gene identice cu cele ale părinților lor.

Multe tipuri diferite de rădăcini prezintă reproducere asexuată Figura (PageIndex<1>). Cormul este folosit de gladiole și usturoi. Bulbii, cum ar fi un bulb solzoasa la crini și un bulb tunicat la narcise, sunt alte exemple comune. Un cartof este un tubercul cu tulpină, în timp ce păstârnacul se înmulțește dintr-o rădăcină pivotantă. Ghimbirul și irisul produc rizomi, în timp ce iedera folosește o rădăcină adventivă (o rădăcină care provine dintr-o parte a plantei, alta decât rădăcina principală sau primară), iar planta de căpșun are un stolon, care se mai numește și alergător.

Figura (PageIndex<1>): Diferite tipuri de tulpini permit reproducerea asexuată. (a) Corbul unei plante de usturoi arată similar cu (b) un bulb de lalele, dar corbul este țesut solid, în timp ce bulbul este format din straturi de frunze modificate care înconjoară o tulpină subterană. Atât cormii, cât și bulbii se pot autopropaga, dând naștere la noi plante. (c) Ghimbirul formează mase de tulpini numite rizomi care pot da naștere la mai multe plante. (d) Plantele de cartofi formează tuberculi tulpini cărnoase. Fiecare ochi din tuberculul tulpină poate da naștere unei noi plante. (e) Plantele de căpșun formează stoloni: tulpini care cresc la suprafața solului sau chiar sub pământ și pot da naștere la noi plante. (credit a: modificarea lucrării de către Dwight Sipler credit c: modificare a lucrării de Albert Cahalan, USDA ARS credit d: modificare a lucrării de Richard North credit e: modificare a lucrării de Julie Magro)

Unele plante pot produce semințe fără fertilizare. Fie ovulul, fie o parte a ovarului, care este de natură diploidă, dă naștere unei noi sămânțe. Această metodă de reproducere este cunoscută sub numele de apomixis.

Un avantaj al reproducerii asexuate este că planta rezultată va ajunge la maturitate mai repede. Deoarece noua plantă provine dintr-o plantă adultă sau din părți ale plantei, va fi, de asemenea, mai robustă decât un răsad. Reproducerea asexuată poate avea loc prin mijloace naturale sau artificiale (asistate de oameni).


2 Bioenergetica dezvoltării ecosistemelor

Atributele de la 1 la 5 din Tabelul 1 reprezintă bioenergetica ecosistemului. În stadiile incipiente ale succesiunii ecologice, sau în natură tânără, ca să spunem așa, rata producției primare sau fotosinteza totală (brută) (P) depaseste rae de respirație comunitară (R), astfel încât raportul P/R este mai mare decât 1. În cazul special al poluării organice, raportul P/R este de obicei mai mic decât 1. În ambele cazuri, însă, teoria este că P/R se apropie de 1 pe măsură ce are loc succesiunea. Cu alte cuvinte, energia fixă ​​tinde să fie echilibrată de costul energetic al întreținerii (adică respirația totală a comunității) la maturitatea sau punct culminant ecosistem. Prin urmare, raportul P/R ar trebui să fie un indice funcțional excelent al maturității relative a sistemului.

Atâta timp cât P depășește R, materia organică și Biomasa (B) se vor acumula în sistem (Tabelul 1, itemul 6), cu rezultatul că raportul P/B va tinde să scadă sau, invers, B/P, B/ Rapoartele R sau B/E (unde E=P/R) vor crește (Tabelul 1, articolele 2 și 3). Teoretic, atunci, cantitatea de biomasă a culturii în picioare susținută de fluxul de energie disponibil (E) crește la maximum în stadiile de maturitate sau de climax (Tabelul 1, itemul 3). În consecință, producția comunitară netă, sau randamentul, într-un ciclu anual este mare în natura tânără și mică sau nulă în natura matură (Tabelul 1, itemul 4).


Ciclul de viață și adaptabilitatea

Johnsongrass este o plantă perenă agresivă. Fie lăstari noi din rizomi, fie puieți noi vor încolți la începutul și la mijlocul primăverii. Semințele încep să germineze când temperaturile solului ajung la 70 F, totuși, lăstarii noi din rizomi vor încolți atunci când temperaturile solului sunt de 60 F. Lăstarii din rizomi se dezvoltă mai repede decât răsadurile, profitând de carbohidrații din rizomi acumulați în timpul iernii. Plantele încep să producă noi rizomi după ce s-au dezvoltat cinci până la șapte frunze adevărate. Aceasta apare la aproximativ trei până la șase săptămâni după apariție. Înflorirea va începe la șase până la nouă săptămâni după răsărire, iar semințele viabile vor fi produse la două până la trei săptămâni după înflorire. În timpul toamnei, creșterea Johnsongrass încetează când temperaturile solului revin la 60 F, transformând planta în stare latentă. În Oklahoma, Johnsongrass va începe să crească până la sfârșitul lunii martie, iar noi rizomi vor începe să se dezvolte până la sfârșitul lunii aprilie. Înflorirea va începe la începutul lunii iunie și semințele viabile vor apărea la sfârșitul lunii iunie. În plus, noi rizomi, flori și semințe vor continua să fie produse până la începutul lunii noiembrie, când plantele devin latente.

Johnsongrass este adaptat la o gamă largă de tipuri de sol într-un interval de pH de la 5 la 7,5. Prin urmare, Johnsongrass se găsește în principal în terenuri arabile, livezi, terenuri deșeuri deschise, marginea drumurilor, pășuni, canale irigate și șanțuri. Se dezvoltă cel mai bine în soluri fertile de câmpie. Nu este adaptat solurilor argiloase slab drenate, dar poate tolera perioade scurte de inundații. Producția de rizom este, de asemenea, afectată de tipul de sol. O producție mai mare de rizom și adâncime va avea loc în solurile cu textură mai ușoară. De exemplu, solurile argiloase vor permite doar jumătate din rizomii care sunt capabili să fie produși în soluri nisipoase argiloase. În plus, majoritatea rizomilor din solurile argiloase și argiloase vor atinge adâncimi de 3 și, respectiv, 5 inci.


Inginerie metabolică pentru producția de combustibili și substanțe chimice bioregenerabile: contribuții ale biologiei sintetice

Producția de combustibili și substanțe chimice prin fermentarea microbiană a materialului vegetal este o alternativă de dorit la producția pe bază de petrochimie. Producția fermentativă de combustibili și substanțe chimice bioregenerabile necesită ingineria biocatalizatorilor care pot transforma rapid și eficient zaharurile în produse țintă la un cost care este competitiv cu procesele petrochimice existente. De asemenea, este important ca biocatalizatorii să fie robusti la condiții extreme de fermentație, inhibitori derivați din biomasă și produsele lor țintă. Ingineria metabolică tradițională a făcut progrese mari în acest domeniu, dar biologia sintetică a contribuit și va continua să contribuie la acest domeniu, în special cu biocombustibilii de generație următoare. Această lucrare analizează utilizarea ingineriei metabolice și a biologiei sintetice în ingineria biocatalizatorilor pentru producția de combustibili și substanțe chimice bioregenerabile, cum ar fi etanol, butanol, acetat, lactat, succinat, alanină și xilitol. De asemenea, examinăm provocările existente în acest domeniu și discutăm strategii pentru îmbunătățirea toleranței biocatalizatorului la inhibitorii chimici.

1. Introducere

Societatea umană a depins întotdeauna de carbon și energie derivate din biomasă pentru nutriție și supraviețuire. În istoria recentă, am devenit, de asemenea, dependenți de carbon și energie derivate din petrol pentru produse chimice și combustibili de bază. Cu toate acestea, natura neregenerabilă a petrolului este în contrast puternic cu carbonul regenerabil și energia prezentă în biomasă, unde biomasa este în esență o unitate de stocare temporară a carbonului atmosferic și a energiei derivate din lumina soarelui. Astfel, există o cerere din ce în ce mai mare de a dezvolta și implementa strategii pentru producerea de produse chimice de bază și combustibili din biomasă în loc de petrol. Mai exact, în această lucrare suntem interesați de fermentația microbiană a zaharurilor derivate din biomasă la combustibili și substanțe chimice de bază.

Pentru ca un proces de fermentație să concureze cu procesele existente pe bază de petrol, substanța chimică țintă trebuie să fie produsă la un randament, titru și productivitate ridicat. Uneori există constrângeri suplimentare asupra procesului de fermentație, cum ar fi prezența inhibitorilor puternici în hidrolizatul de biomasă sau necesitatea de a funcționa la un pH sau temperatură extreme [1]. Aceste obiective pot fi dificil de atins cu microbii naturali. Prin urmare, microorganismele cu aceste trăsături dorite trebuie adesea dezvoltate, fie prin modificarea microbilor existenți, fie prin intermediul de novo proiectarea de noi microbi. Deși s-au înregistrat progrese semnificative în direcția de novo design [2, 3], această lucrare se concentrează pe modificarea microbilor existenți.

Omenirea s-a bazat mult timp pe biocatalizatori microbieni pentru producerea de alimente și băuturi fermentate și pe biocatalizatori eucariotici pentru alimente și textile. Am modificat încet acești biocatalizatori selectând trăsăturile de dorit fără a înțelege mecanismele biologice care stau la baza. Dar, după elucidarea codului biologic și dezvoltarea tehnologiei ADN recombinant, avem acum instrumentele pentru a face mai mult decât doar selectarea trăsăturilor observabile - acum suntem capabili să modificăm și să proiectăm rațional căi metabolice, proteine ​​și chiar organisme întregi.

O mare parte din această modificare rațională a fost sub forma Ingineriei Metabolice. Ingineria metabolică a fost definită în 1991 [4, 5] și aici folosim definiția „îmbunătățirea direcționată a producției, formării sau proprietăților celulare prin modificarea reacțiilor biochimice specifice sau introducerea altora noi prin utilizarea tehnologiei ADN recombinant ” [6]. În timp ce Ingineria metabolică a permis progrese extraordinare în producția de substanțe chimice de bază și combustibili din biomasă, dintre care unele sunt discutate în această lucrare, am ajuns acum la punctul în care sunt dorite funcții biologice care nu există în natură. Biologia sintetică își propune să dezvolte și să asigure aceste funcții biologice nenaturale.

Timp de mulți ani, termenul de biologie sintetică a fost folosit pentru a descrie concepte care ar fi clasificate astăzi drept Inginerie metabolică [7]. Cu toate acestea, în ultimii 10 ani, termeni precum „molecule organice nenaturale” [7], „sisteme chimice nenaturale [8], „comportamente noi” [9], „sisteme artificiale, inspirate de biologie” [10] și „funcții”. care nu există în natură” [11] au fost folosite pentru a descrie Biologia Sintetică. În scopul acestei revizuiri, vom aplica definiția Biologiei Sintetice a „proiectarea și construcția de noi componente biologice, cum ar fi enzime, circuite genetice și celule, sau reproiectarea sistemelor biologice existente” [12].

Biologia sintetică are aplicații în multe domenii, inclusiv sinteza fără celule [13], ingineria țesuturilor și plantelor [14] și descoperirea medicamentelor [15], dar aici suntem interesați de modificarea microbilor pentru producția bioregenerabilă de substanțe chimice și combustibili de bază. . Alte recenzii recente au tratat, de asemenea, acest subiect [16–18].

Biologia sintetică pentru producerea unui compus țintă poate fi exprimată ca o secvență a următoarelor evenimente, fiecare dintre acestea fiind discutată mai detaliat și demonstrată mai jos.

Proiectați căile metabolice și proprietățile fenotipice ale sistemului dorit. Care sunt substraturile și produsele dorite? Care sunt factorii de stres de mediu așteptați?

Alegeți un organism gazdă adecvat (șasiu) pe baza următoarelor criterii. Care organisme prezintă cel puțin unele dintre proprietățile dorite? Cât de bine caracterizate și adnotate sunt aceste organisme? Există instrumente de biologie moleculară pentru modificarea acestui șasiu?

Formulați o abordare de implementare. Ce modificări sunt necesare pentru a realiza căile și proprietățile identificate în pas? Trebuie adăugate, eliminate sau reglate căile metabolice? Există calea sau fenotipul dorit în natură sau trebuie proiectat de novo?

Optimizați sistemul reproiectat și evaluați proprietățile sistemului în raport cu cel ideal. Se poate îmbunătăți și mai mult șasiul?

Chiar și un simplu biocatalizator, cum ar fi calul de lucru de laborator Escherichia coli, este un sistem complex de aproximativ 4603 gene, 2077 reacții și 1039 metaboliți unici [19, 20] și, în timp ce pașii evidențiați mai sus sunt relativ simpli, este încă dificil să proiectați rapid și fiabil un biocatalizator pentru a realiza comportamentele dorite. 21]. Biologia sistemelor, standardizarea sistemelor biologice și evoluția metabolică sunt vitale pentru compensarea acestei deconectări între comportamentele așteptate și cele reale ale biocatalizatorului. Printr-o combinație a acestor tehnici puternice, biocatalizatorii au fost reproiectați pentru producerea unei game uimitoare de combustibili și substanțe chimice de bază, atât naturale, cât și nenaturale (Figura 1 și Tabelul 1). Aici discutăm exemple de succes care implică producția de combustibili și substanțe chimice de bază, cu accent pe D- și L-lactat, L-alanină, succinat, etanol și butanol.


2. Metode și instrumente pentru reproiectarea biocatalizatorului

2.1. Şasiu

Un șasiu robust și stabil permite producția eficientă și economică de combustibili și substanțe chimice la nivel industrial. Deoarece suntem interesați în mod special de biocatalizatori care pot utiliza biomasa, un șasiu de dorit are următoarele caracteristici: (1) creșterea în mediu de săruri minerale cu surse ieftine de carbon, (2) utilizarea zaharurilor hexoze și pentoze, astfel încât toate componentele de zahăr din biomasa lignocelulozică poate fi convertită în produsul dorit, (3) rata metabolică ridicată, esențială pentru o rată ridicată de productivitate, (4) proces simplu de fermentație pentru a reduce costul de manipulare și a minimiza riscurile de eșec în producția pe scară largă, (5) organism robust (temperatură ridicată și pH scăzut acolo unde este posibil) pentru a reduce necesarul de celulază externă în timpul degradării celulozei, precum și pentru a reduce cantitatea necesară de adiție de bază, (6) ușurință în manipulare genetică și stabilitate genetică, (7) rezistență la inhibitorii produși în timpul procesului de pretratare a biomasei și (8) toleranță la concentrații mari de substrat și produs pentru a obține titruri mari de compus țintă.

Bacteriile enterice, în special E coli, au multe dintre caracteristicile fiziologice menționate mai sus și sunt, astfel, un șasiu excelent pentru biologia sintetică. Cele mai multe dintre exemplele discutate aici folosesc E coli, dar alte sisteme importante de modele microbiene au fost reproiectate, inclusiv Clostridium acetobutylicum [28], Corynebacterium glutamicum [29], Saccharomyces cerevisiae [30] și Aspergillus niger [31]. E coli a fost folosit ca organism model încă de la începutul ingineriei genetice [32]. În timp ce tulpina K-12 MG1655 (ATCC# 47076) este una dintre cele mai frecvent utilizate E coli tulpini [33], există alte linii, cum ar fi B (ATCC# 11303), C (ATCC# 8739) și W (ATCC# 9637), care sunt, de asemenea, considerate în general sigure, deoarece nu sunt capabile să colonizeze intestinul uman. [34]. Deși K-12 este cea mai caracterizată și utilizată tulpină, E coli W (ATCC# 9637) și C (ATCC# 8739) s-au dovedit a fi șasiuri mai bune pentru sintetizarea combustibililor și substanțelor chimice. De exemplu, tulpinile derivate din K-12 nu au putut să fermenteze complet 10% (g/v) glucoză în mediu complex sau săruri minerale [1, 35], în timp ce derivații tulpinilor W sau C pot fermenta complet mai mult de 10% ( w/v) de glucoză cu creștere celulară și rate de utilizare a zahărului mai mari decât K-12. În plus, E coli Tulpinile W au capacitatea nativă de a fermenta zaharoza [1, 36].

Genele străine pot fi instabile în celulele gazdă datorită recombinării facilitate de elementele ADN mobile și, prin urmare, elementele ADN mobile din E coli Tulpina K-12 a fost eliminată [37]. Această strategie minimă de construcție a genomului este o abordare excelentă pentru îmbunătățirea acestui șasiu pentru producția de combustibili și substanțe chimice.

2.2. Instrumente de biologie a sistemelor
2.2.1. Modele la scară genomică și simulare in silico

Având în vedere baza rațională a ingineriei metabolice și a biologiei sintetice, modelele și simulările sunt instrumente și predictive esențiale. Instrumentele de secvențiere a genomului și de adnotare automată au permis construirea de modele metabolice la scară genomică a aproape 20 de microorganisme [38]. Aceste modele bazate pe constrângeri și in Silicon simulările pot fi utilizate pentru a prezice redistribuirea fluxului metabolic după manipularea genetică sau pentru a prezice alte funcții celulare, cum ar fi preferința de substrat, rezultatele evoluției adaptive și schimbările profilurilor de expresie [39]. De asemenea, pot ajuta la proiectarea căii pentru a obține fenotipurile dorite [40-42]. De exemplu, cel E. coli iModelul JE660a GSM a fost utilizat pentru a simula cu succes declanșările cu o singură genă și mai multe gene pentru a îmbunătăți producția de licopen [42]. Cadrul de calcul, Optknock, a fost dezvoltat pentru a identifica ținte de ștergere a genelor pentru optimizarea sistemului [41], iar rezultatele simulării pentru ștergerile genelor pentru producția de succinat, lactat și 1,3-propandiol au fost în acord cu datele experimentale. Un alt program de simulare, OptStrain, a fost dezvoltat pentru a ghida modificarea căii metabolice pentru producerea de compus țintă, atât prin adăugarea de reacții metabolice heterologe, cât și prin eliminarea reacțiilor native [40]. Cu toate acestea, majoritatea modelelor actuale au doar informații stoichiometrice, în timp ce efectele cinetice și de reglare nu sunt incluse [38, 39]. Integrarea informațiilor cinetice și de reglementare va îmbunătăți acuratețea și puterea predictivă a acestor modele.

2.2.2. Analiza Omics de mare randament

Analiza omică de mare performanță, cum ar fi transcriptom, proteome, metabolom și fluxom [43–45], ajută la caracterizarea funcției celulare pe mai multe niveluri și, prin urmare, oferă o capacitate de „depanare” pentru optimizarea sistemului [12, 45].

Manipulările genetice pot perturba echilibrul metabolic sau pot afecta creșterea celulelor din cauza epuizării precursorilor importanți [46, 47], a acumulării de intermediari toxici [48] sau a dezechilibrului redox [1]. De exemplu, niveluri ridicate de NADH în E coli reproiectat pentru producția de etanol a inhibat activitatea citrat sintetazei, limitând astfel creșterea celulară prin scăderea producției de metabolit critic 2-cetoglutarat [49]. Analiza metabolomului și fluxomului poate identifica rapid metaboliții limitatori sau distribuția modificată a fluxului metabolic, oferind baza pentru rezolvarea problemelor [45, 50]. De exemplu, măsurătorile metaboliților de Aspergillus terreus au fost implementate în reproiectarea rațională metabolică pentru creșterea producției de lovastatin [45, 50]. Modificările profilurilor mARN și proteinelor pot fi identificate prin analiza transcriptomului și proteomului, oferind ținte ale genelor pentru inginerie ulterioară [46, 47]. Lucrarea lui Choi et al. demonstra acest concept: analiza transcriptomului de E coli producerea proteinei de fuziune a factorului I de creștere asemănător insulinei umane ajutată la selecția țintelor pentru ștergerea genelor. Tulpina reproiectată rezultată a arătat o creștere mai mare de 2 ori a titrului produsului și a productivității volumetrice [46, 47]. În plus, analiza comparativă a secvenței genomului facilitează identificarea genelor mutante sau a regulatorilor în timpul evoluției, iar aceste mutații pot fi utilizate pentru a reproiecta sistemele pentru o mai bună capacitate sintetică. De exemplu, într-un efort descris ca „reconstrucție a tulpinii bazată pe genom”, tulpinile evoluate de Corneybacterium glutamicum selectate pentru producția de L-lizină au fost comparate cu tulpina parentală și s-au găsit mutații care au fost propuse ca fiind benefice pentru producția de L-lizină. Trei dintre aceste mutații au fost introduse în tulpina părinte și au permis producerea de până la 3,0 g/L/h L-lizină [51].

2.3. Instrumente de manipulare genetică
2.3.1. Ștergerea genelor

Deleția genelor poate redistribui fluxul de carbon către produsul țintă prin ștergerea genelor critice pentru căile metabolice concurente și, prin urmare, este utilizată pe scară largă în strategiile de reproiectare metabolică. Recombinarea omologă este cea mai frecvent utilizată strategie pentru ștergerea genelor (Figura 2). Din punct de vedere istoric, plasmidele care conțineau un marker selectabil flancat de fragmente de ADN omoloage genei țintă și repliconi sensibili la temperatură sau condiționali au fost necesare pentru ștergerea eficientă a genei în bacterii [52] (Figura 2 (a)). În contrast, genele pot fi perturbate direct în drojdie de fragmente PCR liniare cu fragmente scurte de ADN flancare omoloage cu ADN-ul cromozomial. ADN-ul liniar nu este la fel de ușor de transformat E coli din cauza sistemului de exonuclează intracelular și a eficienței scăzute de recombinare. Sisteme de ștergere a genelor bazate pe bacteriofag

Recombinaza roșie facilitează ștergerea genei cromozomiale folosind un fragment liniar PCR [53]. În această metodă, gena cromozomială este înlocuită cu markerul selectabil flancat de două fragmente FRT (țintă de recunoaștere FLP) (Figura 2 (b)) și apoi markerul poate fi îndepărtat de recombinaza FLP [54]. Cu toate acestea, această metodă lasă o cicatrice de 68bp-FRT pe cromozom după fiecare excizie [52], reducând în continuare eficiența ștergerii genelor. Utilizarea repetată a acestui sistem FRT/FLP pentru deleții specifice de gene are potențialul de a genera deleții cromozomiale neintenționate mari.


(A)
(b)
(c)
(A)
(b)
(c) Comparația metodelor de ștergere a trei gene în E coli. Aceste metode pot fi utilizate și în alte bacterii enterice. Prima și a treia metodă pot fi, de asemenea, utilizate pentru integrarea genelor în cromozom și înlocuirea promotorului pentru reglarea expresiei genei. 2 litera (a) metoda bazata pe plasmide. Etapa

este construcția plasmidei de deleție care conține fragmente de ADN omoloage genei țintă (h1 și h2), un marker selectabil și fie un replicon sensibil la temperatură, fie condiționat. Etapa

este o recombinare cu dublu încrucișare, plasmida nu se poate replica în tulpina gazdă și sunt selectate colonii rezistente la antibiotice. În pas

, FRT, repliconul și markerul de rezistență la antibiotice sunt îndepărtate de FLP. 2 litera (b) Metoda liniară bazată pe ADN. Etapa

este construcția fragmentului de ADN liniar prin PCR (H1-P1 și H2-P2 ca primeri). H1 și H2 se referă la fragmente scurte de ADN omoloage genei țintă. Etapa

este înlocuirea genei țintă cu gena rezistenței la antibiotice prin recombinare încrucișată cu ajutorul recombinazei roșii. Etapa

este îndepărtarea FRT și a markerului antibiotic de către FLP. 2 litera (c) Metodă bazată pe recombinare în două etape dezvoltată în laboratorul nostru. Pași

, 2, 3 și 5 descriu construcția plasmidelor și a fragmentelor de ADN liniar pentru recombinările în două etape. Etapa

descrie primul pas de recombinare, în care pisica, sacB caseta este introdusă în gena țintă. Etapa

Pentru a facilita ștergerile secvențiale ale genelor, laboratorul nostru a dezvoltat o strategie de recombinare în două etape (Figura 2(c)), folosind sensibilitatea E coli la zaharoză când Bacillus subtilis levansucraza (sacB) se exprimă [24, 27, 55]. Delețiile genelor create prin această metodă nu lasă ADN străin, markeri de rezistență la antibiotice sau secvențe cicatrice la locul ștergerii. În prima recombinare, o parte a genei țintă este înlocuită cu o casetă ADN care conține o genă de rezistență la cloramfenicol (pisică) și gena levansucrazei (sacB). În a doua recombinare, cel pisica, sacB caseta este îndepărtată prin selecție pentru rezistența la zaharoză. Celulele care conțin sacB genele acumulează levan în timpul incubației cu zaharoză și sunt ucise [55]. Recombinanții supraviețuitori sunt foarte îmbogățiți pentru pierderea pisica, sacB caseta [24, 27].

2.3.2. Reglarea expresiei genetice

La fel ca delețiile genelor, sistemele de expresie bazate pe plasmide sunt omniprezente în reproiectarea metabolică. Cu toate acestea, sistemele pe bază de plasmide au mai multe dezavantaje. (1) Menținerea plasmidei este o povară metabolică asupra celulei gazdă, în special pentru plasmidele cu număr mare de copii [56]. Rețineți că numerele mari de copii nu sunt esențiale, având în vedere că majoritatea enzimelor metabolice centrale sunt codificate de o singură genă (2) expresia pe bază de plasmide depinde de stabilitatea plasmidei, doar câteva plasmide naturale de copiere unitară având stabilitatea dorită [12] ( 3) numai plasmidele cu număr redus de copii au replicare care este sincronizată cu ciclul celular și, astfel, menținerea unui număr consistent de copii în toate celulele este o provocare [12] (4) reproiectarea metabolică poate necesita construirea unei căi heterologe complexe și, prin urmare, mai multe genele, codificate în bucăți mari de ADN, trebuie încorporate. Majoritatea plasmidelor comerciale au dificultăți în transportarea fragmentelor mari de ADN.

Integrarea cromozomală a genelor țintă, urmată de reglarea fină a expresiei lor, ar putea elimina aceste probleme asociate plasmidei. Strategia de recombinare în două etape menționată mai sus pentru ștergerea genei poate fi utilizată și pentru integrarea genelor sau înlocuirea promotorului (Figura 2).

Expresia genelor la procariote este controlată în principal la nivel transcripțional și, prin urmare, promotorul este elementul cel mai reglabil. În timp ce promotorii inductibili, cum ar fi lac și ara, au fost utilizate în mod tradițional pentru a modula expresia genelor, utilizarea pe scară largă a inductorilor este prohibitivă pentru producția de combustibili și substanțe chimice în vrac. Cu toate acestea, au fost dezvoltate mai multe strategii pentru a construi biblioteci de promotori constitutivi pentru reglarea fină a expresiei genelor. Unele metode se bazează pe utilizarea promotorilor naturali. De exemplu, Zymomonas mobilis ADN-ul genomic a fost utilizat pentru a construi o bibliotecă de promotori pentru screeningul expresiei optime a Erwinia chrysanthemi gene de endoglucanază (celY și celZ) în Klebsiella oxytoca P2 pentru a îmbunătăți producția de etanol din celuloză [57]. Alte metode se bazează pe modificarea aleatorie a promotorilor existenți, cum ar fi randomizarea secvențelor spacer între secvențele consens [58] sau mutageneza unui promotor constitutiv [59]. Această metodă de modificare a promotorului a fost utilizată pentru a evalua impactul nivelurilor de fosfoenolpiruvat carboxilază asupra randamentului celular și a nivelurilor de deoxi-xilulose-P sintetazei asupra producției de licopen, iar nivelurile optime de expresie ale acestor gene au fost identificate pentru fenotipul maxim dorit [59]. Aceste biblioteci de promotori sintetici ar putea fi, de asemenea, integrate direct în cromozom, ceea ce ar putea facilita modularea expresiei genelor cromozomiale [60, 61].

Metodele de reglare fină descrise mai sus se bazează pe selecția celui mai bun promotor natural sau pe modificarea aleatorie a promotorilor existenți. Unul dintre scopurile biologiei sintetice este construirea de părți standard, iar procesele posttranscripționale, cum ar fi terminarea transcripțională, degradarea ARNm și inițierea translației, au fost concepute având în vedere acest scop. Exemplele includ construirea unei biblioteci sintetice de structuri secundare 5’ pentru a manipula cu succes stabilitatea ARNm [62] și modularea locului de legare a ribozomului (RBS), precum și a secvențelor Shine-Dalgarno (SD) și bogate în AU pentru a regla expresia genei la procesul de inițiere a traducerii [60, 63]. Riborregulatorii au fost, de asemenea, dezvoltați pentru a regla expresia genelor prin interacțiuni ARN-ARN [64]. O metodă finală de reglare fină a expresiei genelor este optimizarea codonilor, care poate îmbunătăți traducerea genelor străine [65]. Aceste secvențe de gene optimizate adesea nu există în natură și trebuie generate folosind tehnici de sinteză a ADN-ului.

În multe cazuri, mai mult de o genă trebuie să fie introdusă în șasiu și expresia acestor gene trebuie să fie coordonată pentru a obține performanța dorită a biocatalizatorului. O astfel de metodă este modularea expresiei fiecărei gene individuale prin intermediul propriului promotor. Cu toate acestea, este dificil de prezis nivelul de expresie adecvat al fiecărei gene. O altă opțiune este combinarea mai multor gene într-un operon sintetic cu un singur promotor și reglarea fină a expresiei fiecărei gene prin procese posttranscripționale [12] cu elemente de control reglabile (cum ar fi structura secundară a ARNm, situsurile de clivaj RNază, situsurile de legare a ribozomului și secvenţe de sechestrare) la regiunile intergenice. Bibliotecile de regiuni intergenice reglabile (TIGR) au fost generate și verificate pentru a regla expresia mai multor gene într-un operon [48]. Această metodă a fost utilizată pentru a coordona expresia a trei gene într-un operon care codifică o cale biosintetică heterologă de mevalonat, îmbunătățind producția de mevalonat de 7 ori [48]. O altă metodă de a controla expresia a mai mult de o genă este de a crea mașini de transcripție globale prin mutageneza aleatorie a factorilor de transcripție [66, 67]. S-a demonstrat că această metodă îmbunătățește eficient toleranța la compuși toxici și producția de metaboliți și modifică fenotipurile [66, 67].

2.3.3. Ingineria proteinelor

Proteinele naturale pot să nu îndeplinească criteriile necesare pentru performanța specifică și eficientă a sistemului și, prin urmare, poate fi necesară modificarea pentru o anumită aplicație. Evoluția dirijată a proteinelor oferă o modalitate de optimizare rapidă a enzimelor, chiar și în absența informațiilor structurale sau mecaniciste [68]. Pentru evoluția direcționată, o bibliotecă de proteine ​​este de obicei generată prin mutageneză aleatorie [68], recombinarea unei gene țintă [69] sau o familie de gene înrudite [70] și apoi biblioteca este analizată prin screening cu randament ridicat. Această metodă a fost utilizată pentru a crește cu succes activitatea enzimatică [71, 72], a crește solubilitatea și expresia proteinelor, a inversa enantioselectivitatea și a crește stabilitatea și activitatea în medii neobișnuite [68]. De exemplu, o bibliotecă de mutații a geranilgeranil difosfat sintazei care codifică gena Archaeoglobus fulgidus a fost generat pentru a detecta mutanții cu activitate mai mare, permițând producerea de licopen în E coli. Screeningul a peste 2.000 de variante a identificat opt ​​cu activitate crescută, dintre care una a crescut producția de licopen cu 100% [71].

De o importanță deosebită pentru domeniul biologiei sintetice este crearea unei noi activități enzimatice prin ingineria proteinelor [73, 74]. De exemplu, izomerizarea nenaturală a α-alanina la β-alanina a fost obținută prin evoluția unei lizin 2,3-aminomutază pentru a-și extinde specificitatea de substrat pentru a include α-alanina [73].

Designul rațional este un alt instrument puternic de creștere a proprietăților proteinelor, în special cu ajutorul analizei computaționale [75, 76]. Pe baza cunoștințelor despre structura și funcția proteinei, se poate prezice ce aminoacid(i) trebuie schimbat pentru a obține funcția dorită. În reproiectarea lui Lactobacillus brevis pentru producerea de alcooli secundari, s-a dorit schimbarea preferinței de cofactor a alcool dehidrogenazei R-specifice de la NADPH la NADH. Un model de calcul bazat pe structură a fost utilizat pentru a identifica substituțiile de aminoacizi potențial benefice și una dintre aceste modificări a crescut de patru ori activitatea dependentă de NADH [77].

În timp ce aceste exemple demonstrează puterea (re)proiectării raționale a enzimelor, această abordare necesită informații detaliate despre structura și mecanismul proteinei, în timp ce mutageneza aleatorie nu. Progresele recente au combinat evoluția direcționată și proiectarea rațională într-o așa-numită abordare „semi-rațională” pentru a îmbunătăți cu succes activitatea enzimatică atunci când sunt disponibile doar informații limitate [78, 79]. Atunci când mutageneza este limitată la reziduuri specifice, așa cum sunt alese din cunoștințele structurale sau funcționale existente, aceste biblioteci „inteligente” sunt mai probabil să dea rezultate pozitive [79]. De exemplu, activitatea catalitică a piranoze-2-oxidazei a fost îmbunătățită prin mutageneza locului activ cunoscut [80].

În timp ce cei 20 de aminoacizi naturali furnizează enzimelor cu o gamă largă de activități posibile, acest interval poate fi extins și mai mult prin utilizarea de aminoacizi nenaturali (UAA). Există mai mult de 40 de UAA-uri disponibile în acest moment și au fost utilizate pentru a sonda funcția proteinelor, a fotocage reziduuri critice și a modifica proprietățile metaloproteinelor [81, 82]. În timp ce această tehnologie este încă în stadiu de dezvoltare, cel puțin un studiu a arătat o îmbunătățire a activității enzimatice după inserarea UAA. Site-ul 124 din E coliNitroreductaza a fost înlocuită cu o varietate de aminoacizi naturali și nenaturali și anumite variante de UAA au avut o creștere mai mare de 2 ori a activității față de cea mai bună variantă de aminoacizi naturali [83]. Această abordare biomimetică a fost extinsă la alți metaboliți, cum ar fi carbohidrații [84] și lipidele [85].

2.4. Evoluţie

După cum s-a descris mai sus, un biocatalizator robust cu randament ridicat, titru și productivitate este esențial pentru ca un proces de fermentație să concureze cu producția pe bază de petrochimie. Modelele actuale și instrumentele de simulare oferă un cadru având în vedere constrângerile funcțiilor proteinelor cunoscute. Dar numeroasele reacții și enzime care rămân necaracterizate nu pot fi incluse în această analiză teoretică. Prin urmare, metodele de proiectare raționale duc adesea la un biocatalizator care funcționează slab în raport cu modelul. Evoluția metabolică oferă o abordare complementară pentru a îmbunătăți productivitatea și robustețea biocatalizatorului, în funcție de proiectarea unei presiuni de selecție adecvate. Acolo unde este posibil, sinteza compusului țintă poate fi cuplată cu producerea de ATP, echilibru redox sau metaboliți cheie care sunt esențiali pentru creștere, iar selecția pentru îmbunătățirea creșterii în timpul evoluției metabolice (transferuri în serie) poate fi utilizată pentru a selecta pentru rate mai mari. sau titruri ale compușilor țintă (Figura 3). Atât echilibrul redox, cât și producția netă de ATP într-un astfel de sistem sintetic sunt cerințe pentru o evoluție de succes.


(A)
(b)
(c)
(A)
(b)
(c) Evoluția metabolică pentru îmbunătățirea producției de L-alanină în E coli [27]. 3 (a) Cale metabolică reproiectată pentru producția de L-alanină: producția de ATP și creșterea celulelor sunt cuplate cu oxidarea NADH și producția de L-alanină. 3(b) Evoluția direcționată îmbunătățește creșterea celulară. Tulpina parentală XZ112 atinge o masă celulară maximă de 0,7 gL -1 după 48 de ore de fermentație tulpina evoluată XZ113 atinge 0,7 gL -1 după 24 de ore și un maxim de 0,9 gL -1 după 48 de ore 3(c) evoluția metabolică pentru a îmbunătăți creșterea celulelor de asemenea, îmbunătățește producția de alanină. Tulpina parentală XZ112 produce 355 mM alanină după 72 de ore de fermentație, tulpina XZ113 dezvoltată produce 484 mM în 48 de ore.

Am folosit această strategie de evoluție metabolică pentru a optimiza biocatalizatorii reproiectați pentru producerea mai multor produse de fermentație [1], inclusiv etanol, D-lactat, L-lactat, L-alanină (Figura 3) și succinat, așa cum este descris mai detaliat mai jos. O schemă de proiectare folosită frecvent este de a cupla sinteza produsului țintă cu creșterea prin inactivarea căilor concurente care consumă NADH. Astfel, singura modalitate prin care celulele regenerează NAD + pentru glicoliză este de a produce compusul țintă. Creșterea crescută a celulelor, susținută de o rată mai mare de producție de ATP în timpul glicolizei, este cuplată cu o rată mai mare de oxidare a NADH și, astfel, strâns cuplată cu sinteza produsului țintă. S-a demonstrat că această strategie de evoluție crește productivitatea cu până la două ordine de mărime.

Cadrele de calcul bazate pe modele metabolice la scară genomică au fost folosite pentru a construi biocatalizatori care cuplează formarea biomasei cu producția chimică [40, 41] și, prin urmare, oferă o bază pentru presiunea selectivă pentru o productivitate ridicată. De exemplu, Optknock a identificat ținte de ștergere a genelor pentru construcția producătoare de lactat E coli, iar apoi evoluția direcționată a îmbunătățit capacitatea de producție [86]. Deși proiectarea rațională a căilor metabolice bazată pe modelele metabolice actuale este o metodă comună pentru maximizarea randamentului compusului țintă, această metodă nu este întotdeauna cea mai bună strategie, datorită înțelegerii noastre limitate a rețelei metabolice complicate și a cineticii dinamice a fiecărei reacții. Evoluția metabolică oferă o metodă alternativă excelentă pentru îmbunătățirea tulpinii, prin care reacțiile care nu sunt previzibile în prezent ar fi selectate pentru a îmbunătăți performanța biocatalizatorului [87]. Pe măsură ce cunoștințele noastre despre comportamentul și metabolismul biocatalizatorului se îmbunătățesc, modelele predictive vor deveni și mai puternice.

3. Reproiectare prin modificarea căilor existente

În această secțiune, evidențiem proiecte care au reproiectat un șasiu pentru a produce compuși țintă la randament și titru ridicat, fără introducerea de căi străine. În secțiunea următoare, descriem reproiectările biocatalizatorilor care au folosit căi străine sau nenaturale.

3.1. succinat

Succinatul, un acid dicarboxilic cu patru atomi de carbon, este utilizat în prezent ca substanță chimică de specialitate în industria alimentară, agricolă și farmaceutică [88], dar poate servi și ca punct de plecare pentru sinteza substanțelor chimice de bază utilizate în materiale plastice și solvenți, cu un potențial piața globală de 15 miliarde de dolari [89]. Succinatul este produs în principal din petrol și există un interes considerabil pentru producția fermentativă de succinat din zaharuri [89].

Mai multe bacterii din rumen pot produce succinat din zaharuri cu randament și productivitate ridicate [90–92], dar necesită nutrienți complexi. Alternativ, tulpini native de E coli fermentează eficient glucoza în mediu de săruri minerale simple, dar produc succinat doar ca produs minor [93]. Prin urmare E coli tulpina C (ATCC 8739) a fost reproiectată pentru producția de succinat la randament, titru și productivitate ridicat [94].

Strategia inițială de reproiectare sa concentrat pe inactivarea căilor competitive, în special pe ștergerea lactat dehidrogenazei (ldhA), alcool/aldehid dehidrogenază (adhE), și acetat kinaza (ackA).Cu toate acestea, tulpina rezultată a crescut slab în mediu de săruri minerale în condiții anaerobe și a acumulat doar urme de succinat. Deoarece oxidarea NADH este cuplată cu sinteza succinatului în această tulpină, evoluția metabolică a fost utilizată pentru a îmbunătăți atât creșterea celulară, cât și producția de succinat. După inactivarea piruvat formiat-liazei și metilglioxal sintetazei pentru a elimina producția de formiat și lactat, tulpina finală, KJ073, a produs aproape 670 mM succinat (80 g/L) în mediu de săruri minerale cu un randament ridicat (1,2 mol/mol glucoză) și productivitate ridicată (0,82 g/L/h) [94]. Inactivarea treonin decarboxilazei (tdcD), 2-cetobutirat formiat-liază (tdcE), și aspartat aminotransferaza (aspC) a crescut suplimentar randamentul de succinat (1,5 mol/mol glucoză), titrul (700 mM) și productivitatea (0,9 g/L/h) [24].

În ciuda puterii sale de îmbunătățire a performanței biocatalizatorului, evoluția metabolică are proprietatea nedorită de a fi o tulpină evoluată cutie neagră care prezintă proprietățile dorite de biocatalizator, dar procesul de evoluție metabolică nu îmbunătățește înțelegerea biocatalizatorului. Prin urmare, ingineria inversă a tulpinilor evoluate ne poate ajuta să identificăm mutații cheie care pot fi apoi aplicate rațional altor biocatalizatori. Ingineria inversă a tulpinii producătoare de succinat a relevat două modificări semnificative în metabolismul celular care au crescut eficiența energetică [87]. Prima modificare este că PEP carboxikinaza (pck), care funcționează în mod normal în gluconeogeneză în timpul metabolismului oxidativ al acizilor organici [90, 95, 96], a devenit calea majoră de carboxilare pentru producția de succinat. Expresia la nivel înalt a CO dominat de PCK2 fixare și randament crescut de ATP (1 ATP per oxalacetat produs). A doua modificare este că sistemul nativ de fosfoenolpiruvat (PEP) dependent de fosfotransferază pentru absorbția glucozei a fost inactivat și înlocuit cu o cale alternativă de absorbție a glucozei: permeaza GalP (galP) și glucokinaza (glk). Aceste modificări au crescut cantitatea de PEP disponibilă pentru menținerea echilibrului redox, precum și creșterea eficienței energetice prin eliminarea necesității de a produce PEP suplimentar din piruvat, o reacție care necesită doi echivalenți de ATP [97].

În timp ce proiectarea rațională bazată pe înțelegerea metabolică actuală este o componentă cheie a ingineriei metabolice și a biologiei sintetice, înțelegerea noastră limitată a rețelei metabolice complicate și a cineticii dinamice a fiecărei reacții poate duce la eșecul modelelor predictive. În acest exemplu, evoluția metabolică a fost demonstrată ca o metodă alternativă excelentă pentru îmbunătățirea tulpinii, prin care reacțiile imprevizibile în prezent ar fi selectate pentru a extinde capacitatea metabolică celulară [87]. Prin înțelegerea mutațiilor care au permis performanța dezirabilă a tulpinii producătoare de succinat, avem mai multe opțiuni disponibile pentru reproiectarea sistemelor viitoare. Pentru a demonstra acest lucru, E coli a fost din nou reproiectat pe baza constatărilor din tulpina evoluată [98]. De data aceasta, strategia de proiectare a trecut de la inactivarea căilor de fermentație competitive la recrutarea căilor de conservare a energiei pentru producția eficientă de succinat (Figura 4(e)). După ce a crescut pck expresia genelor și inactivarea sistemului nativ de glucoză PTS, cel nativ E coli sistemul metabolic a fost transformat într-un sistem sintetic succinat eficient, echivalent cu calea nativă a bacteriilor din rumen producătoare de succinat [98].


(A)
(b)
(c)
(d)
(e)
(A)
(b)
(c)
(d)
(e) Căi sintetice ale E coli pentru producția de combustibili și substanțe chimice în laboratorul nostru: 4(a) Căile metabolice native ale fermentației glucozei în E coli 4(b) căi sintetice pentru producerea de D-lactat, etanol, L-lactat și L-alanină 4(c) căi sintetice pentru producerea de piruvat și acetat 4(d) cale sintetică pentru producerea de xilitol, 4(e) sintetic calea de producere a succinatului. ★ indică ștergerea genei. Gene și enzime: ackA, acetat kinaza adhAB, alcool dehidrogenază (Z. mobilis) adhE, alcool/aldehid dehidrogenază alaD, L-alanin dehidrogenaza (G. stearothermophilus) crr, componenta IIA a enzimei fosfotransferaze specifice glucozei frd, fumarat reductază fum, fumaraza galP, simportor galactoză-protoni (permează de glucoză) glk, glucokinaza ldhA, D-lactat dehidrogenază ldhL, L-lactat dehidrogenază (P. acidilactici) mdh, malat dehidrogenază pdc, piruvat decarboxilază pflB, piruvat formiat-liază ppc, fosfoenolpiruvat carboxilază pta, fosfat acetiltransferaza ptsG, componenta EIICB specifică glucozei sistemului PTS ptsH, proteină fosfopurtător HPr ptsI, fosfoenolpiruvat-protein fosfotransferaza (sistemul fosfotransferaza, enzima I) pyk, piruvat kinaza xrd, xilozo reductază (C. boidinii) xylB, xilulokinază. Metaboliți: G6P, glucoză-6-fosfat G3P, glicerol-3-fosfat PEP, fosfoenol piruvat X5P, D-xiluloză-5-fosfat.
3.2. D-lactat

D-lactatul este utilizat pe scară largă ca substanță chimică de specialitate în industria alimentară și farmaceutică. De asemenea, poate fi combinat cu L-lactat pentru producerea de acid polilactic (PLA), un plastic bioregenerabil și biodegradabil din ce în ce mai popular [99, 100] al cărui succes comercial depinde în mod evident de costul de producție. Deși glucoza este substratul actual pentru producția fermentativă de lactat, este de dorit să se producă această substanță chimică de bază din materie primă lignocelulozică, care conține un amestec de zaharuri. Unele bacterii de acid lactic au capacitatea nativă dorită de a produce o cantitate mare de D-lactat în condiții de pH scăzut, unde pH-ul scăzut reduce costul procesului [101, 102]. Cu toate acestea, aceste bacterii lactice necesită nutrienți complecși, iar multe dintre ele nu au capacitatea de a fermenta zaharurile pentoze. Bacteriile lactice care fermentează zaharurile pentoze, din păcate, produc un amestec de lactat și acetat și, prin urmare, nu sunt un șasiu bun pentru producția comercială de D-lactat. In timp ce E coli poate fermenta multe zaharuri în mod eficient într-un mediu de săruri minerale simple, productivitatea inerentă a D-lactatului este scăzută și sunt produși și alți metaboliți nedoriți [103]. De aceea E coli sistemul metabolic a fost reproiectat pentru a atinge proprietățile dorite de randament ridicat și productivitate a D-lactatului.

E coli tulpina W3110 a fost utilizată ca șasiu pentru producția de D-lactat cu o strategie de reproiectare care sa concentrat pe inactivarea căilor de fermentație competitive [104]. După ștergerea genelor care codifică fumarat reductază (frdABCD), alcool/aldehid dehidrogenază (adhE), piruvat formiat liaza (pflB), și acetat kinaza (ackA), tulpina rezultată, SZ63, poate oxida numai NADH prin sinteza D-lactat (Figura 4(b)). Deși această tulpină ar putea utiliza complet 5% (g/v) glucoză într-un mediu de săruri minerale cu un randament aproape de maximul teoretic (96%), productivitatea D-lactatului volumetric de 0,42 g/L/h a fost relativ scăzută în comparație cu acidul lactic. bacterii [35]. În plus, această tulpină nu poate nici să utilizeze zaharoza, nici să utilizeze complet zahăr 10% (g/v) [35]. Prin urmare, an E coli Tulpina derivată W a fost aleasă ca șasiu pentru o producție mai robustă de D-lactat [35, 105]. După reproiectarea metabolismului central, astfel încât producția de D-lactat să fie singurul mijloc de oxidare a NADH, evoluția metabolică a fost folosită pentru a îmbunătăți în continuare creșterea celulelor și productivitatea D-lactatului. Tulpina rezultată, SZ194, a consumat eficient 12% (g/v) glucoză în mediu de săruri minerale și a produs 110 g/L D-lactat [105] cu o productivitate volumetrică de 2,14 g/L/h, o creștere de 5 ori față de derivatul W3110. Biocatalizatorul a fost optimizat în continuare prin ștergerea genei metilglioxal sintetazei (mgsA) pentru a elimina producția de L-lactat, iar prin evoluția metabolică pentru a crește randamentul și productivitatea. Tulpina finală producătoare de D-lactat, TG114, ar putea converti 12% (g/v) glucoză în 118 g/L D-lactat cu un randament excelent (98%) și productivitate (2,88 g/L/h) [22].

3.3. Acetat

Acetatul este o substanță chimică de bază, cu producția mondială în 2001 estimată la 6,8 milioane de tone metrice [23]. Producția biologică de acetat reprezintă doar 10% din producția mondială, în principal sub formă de oțet, restul producției pe căi petrochimice [106–108]. Producția biologică de substanțe chimice de bază s-a concentrat istoric pe producția anaerobă de produse reduse, deoarece pierderea substratului ca masă celulară și CO2 este minimă, iar randamentele de produs sunt mari. În contrast, acetatul este o substanță chimică oxidată, iar producția biologică tradițională implică un proces complex în două etape: fermentarea zaharurilor în etanol prin Saccharomyces, urmată de oxidarea aerobă a etanolului în acetat de Acetobacter [106–108]. Pentru a permite producția microbiană de produse redox neutre sau oxidate cu un randament ridicat, metabolismul biocatalizatorului trebuie reproiectat pentru a combina atributele atât ale metabolismului fermentativ, cât și ale metabolismului oxidativ.

Reproiectare a E coli Metabolismul W3110 pentru producția de acetat sa concentrat pe trei căi majore: metabolismul fermentativ, metabolismul oxidativ și furnizarea de energie (Figura 4(c)) [23]. Căile competitive de fermentație (pflB, ldhA, frd, adhE) au fost inactivate pentru a preveni consumul de precursor comun piruvat, iar ciclul acidului tricarboxilic oxidativ (TCA) a fost întrerupt pentru a reduce pierderea de carbon sub formă de CO2. În cele din urmă, fosforilarea oxidativă a fost întreruptă (atpFH) pentru a reduce producția de ATP, menținând în același timp capacitatea de a oxida NADH de către sistemul de transport de electroni, crescând astfel fluxul glicolitic pentru o producție mai mare de ATP prin fosforilarea la nivel de substrat. Deși concepută rațional, tulpina rezultată, TC32, a avut o cerință auxotrofică nedorită pentru succinat în timpul creșterii în mediu minim de glucoză. Evoluția a fost folosită pentru a elimina această auxotrofie și tulpina finală, TC36, a produs 878 mM acetat (53 g/L) în mediu de săruri minerale cu 75% din randamentul teoretic maxim. Deși acesta este un titru mai mic decât acetatul produs din oxidarea etanolului de către AcetobacterTC36 are o rată de producție de două ori mai mare, necesită doar mediu de săruri minerale și poate metaboliza o gamă largă de surse de carbon într-un proces simplu într-o singură etapă [23].

3.4. Alții

Butanolul este un combustibil alternativ excelent pentru transport, cu mai multe avantaje în comparație cu etanolul, inclusiv conținut mai mare de energie, volatilitate mai scăzută, hidroscopicitate mai mică și corozivitate mai mică [109]. Reproiectarea E coli pentru producția de butanol este discutată mai jos. C. acetobutylicum ATCC 824 produce în mod natural butanol și a fost reproiectat pentru a crește producția de butanol și a reduce acumularea de coprodus. Modificările de tip inginerie metabolică, cum ar fi supraexprimarea căii de formare a acetonei pentru a crește formarea precursorului de butanol butiril-CoA, inactivarea represorului transcripțional SolR și supraexprimarea alcoolului/aldehidei dehidrogenazei, toate au crescut producția de butanol [110-112]. Într-un exemplu excelent de aplicații de tip biologie sintetică, expresia genei butirat kinazei a fost reglată fin de un ARN antisens proiectat rațional pentru a crește producția de butanol [113].

1,2-propandiolul (1,2-PD) este o substanță chimică de bază majoră derivată în prezent din propilenă. E coli produce în mod natural cantități scăzute de 1,2-PD și, prin urmare, metabolismul său a fost reproiectat pentru a produce 1,2-PD cu randament și titru ridicat din glucoză, acest lucru a fost realizat prin inactivarea căilor concurente (lactat dehidrogenaza și glioxalaza I) și supraexprimarea genele esențiale ale căii sintetice 1,2-PD (metilglioxal sintază, glicerol dehidrogenază și 1,2-PD oxidoreductaza) [114]. Evolution a fost, de asemenea, utilizat în combinație cu proiectarea rațională pentru creșterea producției de 1,2-PD [115].

L-valina, un aminoacid hidrofob esențial și cu lanț ramificat, este utilizat în cosmetice, produse farmaceutice și aditivi pentru hrana animalelor [116]. E coli a fost reproiectat pentru producția de L-valină la randament și titru ridicat din glucoză printr-o combinație de inginerie metabolică tradițională și biologie sintetică. Ingineria metabolică tradițională a fost folosită pentru a inactiva căile concurente și pentru a supraexprima acetohidroxi acid sintaza I (ilvBN), parte a căii de biosinteză a valinei. Din păcate, E coli șasiul are elemente de reglementare care controlează în mod strâns biosinteza L-valinei, făcând dificilă producția de valine la randament ridicat și titru. Inhibarea feedback-ului a fost eliminată prin mutageneza rațională direcționată pe situs a acetohidroxi acid sintetazei III. Într-o demonstrație excelentă a tehnicilor de reglare a expresiei genelor discutate mai sus, atenuarea transcripțională a genelor de biosinteză a valinei ilvGMEDA a fost eliminată prin înlocuirea regiunii conducătoare a atenuatorului cu cea constitutivă tac promotor. Analiza transcriptomului și in Silicon simularea a ghidat selecția de gene țintă suplimentare pentru amplificare și ștergere, iar biocatalizatorul final a produs 0,378 g L-valină per g glucoză, dând un titru de 7,55 g/L valină de la 20% (g/v) glucoză [116]. O strategie similară a fost folosită și pentru producția de L-treonină [117].

4. Reproiectare prin introducerea de căi străine sau nenaturale

4.1. Căi străine
4.1.1. Etanol

Etanolul este un combustibil regenerabil pentru transport. Înlocuirea benzinei cu etanol ar reduce semnificativ dependența de petrol din importul SUA, ar crește securitatea națională și ar reduce poluarea mediului [118]. Cu toate acestea, doar 9 miliarde de galoane de etanol au fost produse în 2008 și toate proveneau din producție pe bază de porumb. Lignoceluloza este în general privită ca o sursă excelentă de zaharuri pentru transformarea în etanol combustibil. Prin urmare, este de dorit să se proiecteze sau să se obțină biocatalizatori care să poată utiliza toate componentele de zahăr din lignoceluloză și să le transforme în etanol cu ​​randament și productivitate ridicate în mediu de săruri minerale. Nativ S. cerevisiae și Z. mobilis tulpinile pot converti eficient glucoza în etanol, dar nu pot utiliza zaharuri pentoze. În contrast, E coli Tulpinile pot utiliza toate componentele de zahăr ale lignocelulozelor, dar etanolul este doar un produs de fermentație minor, cu acizi amestecați acumulându-se ca produs major de fermentație [103]. În timp ce s-au făcut progrese recente în proiectarea nativului E coli căi metabolice pentru producerea de etanol [119], cel mai de succes exemplu a folosit o cale metabolică străină pentru a permite producția de etanol din E coli tulpina W (ATCC# 9637) [1].

Reproiectarea pentru producția de etanol a fost decuplată în trei părți: construirea unei căi metabolice pentru producția de etanol ca produs major de fermentație, eliminarea căilor competitive de oxidare a NADH și întreruperea formării produselor secundare. The Z. mobilis Calea homoetanolului (piruvat decarboxilază și alcool dehidrogenază) a fost introdusă ca o cale străină, permițând producția echilibrată de redox a etanolului la randament ridicat [120] (Figura 4(b)). Apoi fumarat reductază (frd) a fost întreruptă pentru a crește randamentul de etanol. Tulpina rezultată, KO11, a produs etanol cu ​​un randament de 95% într-un mediu complex [121]. Această tulpină a fost dezvoltată în zorii ingineriei metabolice și a fost folosită pentru a produce etanol dintr-o varietate de materiale lignocelulozice, așa cum este analizat în [1].

Deși rata de producție de etanol a KO11 a fost la fel de mare ca drojdia, toleranța și performanța etanolului în mediu minim nu au îndeplinit standardele dorite. Prin urmare, tulpina SZ110, un derivat al KO11 modificat pentru producerea de lactat în medii de săruri minerale [35], a fost reproiectată pentru producerea de etanol [122]. Ca și în cazul proiectării lui KO11, reproiectarea lui SZ110 a fost decuplată de construcția unei căi sintetice de etanol, eliminarea căilor competitive de oxidare a NADH și blocarea formării produselor secundare. Cu toate acestea, această strategie de reproiectare a inclus și accelerarea coutilizarii zahărului mixt. Calea producătoare de lactat a fost întreruptă și Z. mobilis Calea homoetanolului a fost integrată în cromozom prin inserție aleatorie pentru a selecta expresia optimă. The Pseudomonas putida esterază cu lanț scurt (estZ) [123] a fost introdus pentru a scădea nivelurile de acetat de etil în bulionul de fermentație și pentru a reduce costul de purificare în aval. În plus, metilglioxal sintetaza (mgsA) a fost inactivată, ducând la co-metabolismul glucozei și xilozei și a accelerat metabolismul unui amestec de 5 zaharuri (manoză, glucoză, arabinoză, xiloză și galactoză) la etanol [25]. După utilizarea evoluției pentru a crește creșterea și producția celulară, tulpina finală, LY168, ar putea metaboliza concomitent o combinație complexă a celor cinci zaharuri principale prezente în biomasa lignocelulozică cu un randament și productivitate ridicate în mediul sărurilor minerale [25].

4.1.2. L-lactat

După cum este descris mai sus, L-lactatul este componenta majoră a PLA din plastic biodegradabil. Deși multe bacterii lactice produc L-lactat cu randament și productivitate ridicate [124], ele necesită de obicei nutrienți complexi. E coli nu are o cale nativă pentru producția de L-lactat și, prin urmare, a fost necesară introducerea unei căi străine.

Strategia de reproiectare E coli W3110 pentru producția de L-lactat a fost de a elimina căile competitive de oxidare a NADH și apoi de a construi calea sintetică de L-lactat dorită (Figura 4 (b)) [125]. Calea de producere a L-lactatului, L-lactat dehidrogenaza (ldhL) din Pediococcus acidilactici, a fost folosit și regiunea sa de codare și terminatorul au fost integrate în E coli cromozom la ldhA site, astfel încât ldhL ar putea fi exprimat sub nativ ldhA promotor. În plus, din moment ce ldhL gena conține o regiune slabă de legare ribozomală, această regiune a fost înlocuită în mod rațional cu ldhARBS a lui [125]. După o perioadă de evoluție metabolică, tulpina rezultată, SZ85, a sintetizat 45 g/L L-lactat într-un mediu de săruri minerale cu randament aproape de maximul teoretic (94%). Cu toate acestea, această tulpină era un derivat K-12 și prezenta aceleași probleme observate cu tulpina producătoare de D-lactat pe bază de K12 descrisă mai sus, ceea ce înseamnă că nu a fost capabilă să fermenteze complet concentrații mari de zahăr și a avut o productivitate scăzută (0,65 g/ L/h). Prin urmare, aceeași strategie de proiectare a fost implementată într-un E coli derivat W (ATCC# 9637). După ștergerea în continuare mgsA gena pentru a îmbunătăți puritatea chirală și folosind evoluția metabolică pentru a îmbunătăți creșterea și productivitatea celulelor, tulpina finală producătoare de L-lactat, TG108, ar putea converti 12% glucoză la 116 g/L L-lactat cu un randament excelent (98%) și productivitate. (2,29 g/L/h) [22].

4.1.3. Xilitol

Pentahidroxi-zahărul alcool xilitol este utilizat în mod obișnuit pentru a înlocui zaharoza în alimente și ca îndulcitor natural, nenutritiv, care inhibă cariile dentare [126]. Xilitolul poate fi, de asemenea, utilizat ca un bloc de construcție pentru sintetizarea de noi polimeri [127]. Producția comercială curentă de xilitol implică hidrogenarea xilozei derivate din hemiceluloză cu un catalizator metalic activ [127]. Procesele bazate pe biologic au fost, de asemenea, dezvoltate recent, dar deși un titru ridicat de xilitol a fost atins de unele drojdii, procesul necesită un mediu complex cu numeroase suplimente de vitamine costisitoare [128]. In timp ce E coli nu are capacitatea nativă de a sintetiza xilitol, a fost propusă o strategie de reproiectare pentru tulpina W3110 care implică o cale metabolică străină [26].În reproiectarea propusă, glucoza ar sprijini creșterea celulelor și ar oferi echivalenți reducători, în timp ce xiloza ar fi utilizată ca substrat pentru sinteza xilitolului (Figura 4 (d)). Strategia de proiectare a constat din trei componente majore: permiterea co-utilizarii glucozei și xilozei, separarea metabolismului xilozei de metabolismul central și construirea unei căi de producție a xilitolului (Figura 4 (d)). Pentru a permite coutilizarea glucozei și a xilozei, reprimarea mediată de glucoză a metabolismului xilozei a fost eliminată prin înlocuirea nativei. crp genă cu un mutant independent de cAMP (CRP*). Metabolismul xilozei a fost separat de metabolismul central prin eliminarea xilulokinazei (xylB), prevenind pierderea carbonului xilozei către metabolismul central. În cele din urmă, xilozo reductază și xilitol dehidrogenaza de la mai multe microorganisme au fost testate pentru capacitatea de sinteză a xilitolului, iar xiloza reductază dependentă de NADPH din C. boidinii (CbXR) s-a dovedit a susține producția optimă de xilitol. Tulpina finală, PC09 (CbXR), ar putea produce 250 mM (38 g/L) xilitol în mediu de săruri minerale. Randamentul a fost de 1,7 mol xilitol per mol de glucoză consumat, care a fost îmbunătățit la 4,7 mol/mol prin utilizarea celulelor de repaus. S-a propus că producția de xilitol ar putea fi îmbunătățită în continuare prin creșterea ofertei de echivalenți reducători [129].

4.1.4. L-Alanina

L-alanina poate fi utilizată cu alți L-aminoacizi ca terapie nutrițională pre și postoperatorie în aplicații farmaceutice și veterinare [130]. De asemenea, este folosit ca aditiv alimentar datorită gustului său dulce. Producția anuală la nivel mondial de L-alanină este de aproximativ 500 de tone [131], iar această piață este în prezent limitată de costurile de producție. Procesul de producție comercial actual transformă aspartatul în alanină prin aspartat decarboxilază, unde aspartatul este produs din fumarat prin cataliza aspartat amoniac-lază [27]. Un proces de fermentație eficient cu o materie primă regenerabilă, cum ar fi glucoza, oferă potențialul de a reduce costul L-alaninei și de a facilita o extindere largă a pieței alaninei în alte produse.

SZ194, un derivat al E coli W (ATCC# 9637), care a fost proiectat anterior pentru producția de D-lactat, a fost folosit ca șasiu pentru producția de L-alanine [27] (Figura 4(b)). Producția de alanină în tulpina nativă utilizează glutamat-piruvat aminotransferaza dependentă de glutamat și NADPH. Este de preferat să se producă L-alanină direct din piruvat și amoniac folosind o enzimă dependentă de NADH și, prin urmare, L-alanin dehidrogenază (alaD) de Geobacillus stearothermophilus a fost angajat. Situl nativ de legare a ribozomului, regiunea de codificare și terminatorul alaD gena au fost integrate în E coli cromozom la ldhA site, astfel încât expresia a alaD ar putea fi controlat de promotorul nativ al ldhA, un promotor care a funcționat bine pentru producerea de D- și L-lactat, așa cum este descris mai sus. Reproiectare suplimentară axată pe eliminarea urmelor de lactat și pe creșterea purității chirale a L-alaninei prin ștergere. mgsA și gena majoră a alaninei racemazei (tataX). Evoluția metabolică a crescut titrul final și productivitatea de 15 și, respectiv, de 30 de ori (Figura 3). Cea mai recentă tulpină producătoare de L-alanină, XZ132, a convertit 12% glucoză în 114 g/L L-alanină cu un randament de 95% și o productivitate volumetrică excelentă de 2,38 g/L/h [27].

4.1.5. Combinarea mai multor căi străine într-un singur șasiu

Deși munca descrisă mai sus s-a bazat pe introducerea unei singure căi străine, există alte exemple excelente care folosesc căi de la mai mult de un organism într-o singură gazdă.

E coli a fost reproiectat pentru producția de 1,3-propandiol folosind S. cerevisiae calea de transformare a glucozei în glicerol și a K. pneumonie cale de transformare a glicerolului în 1,3-propandiol [132]. E coli a fost, de asemenea, reproiectat pentru producerea de izopropanol prin combinarea acetil CoA acetiltransferazei (thl) și acetoacetat decarboxilază (adc) din C. acetobutylicum cu a doua alcool dehidrogenază (adh) din C. beijerinckii și E colipropria acetoacetil-CoA transferaza (atoAD) [133]. Acidul artemisinic, un precursor al medicamentului antimalaric artemisinei, a fost produs de E coli în urma combinaţiei unei căi mevalonate din S. cerevisiae și E coli, amorfadien sintaza și o nouă monooxigenază citocrom P450 (CYP71AV1) de la Artemisia annua [12, 134].

S. cerevisiae a fost reproiectat pentru producția de flavanonă prin combinare Arabidopsis thaliana cinamat 4-hidroxilaza (C4H), Petroselinum crispum 4-cumaroil: CoA-ligaza (4CL) și Petunie calcon sintetaza (CHS), Petunie chalcon izomeraza (CHI) [135]. Un sistem sintetic similar care produce flavonoli hidroxilați a fost, de asemenea, construit în E coli cu amplificare suplimentară a C. roseus P450 flavonoid

-hidroxilaza (F H) fuzionată cu P450 reductază, Malus domestica flavanonă 3β-hidroxilaza (FHT) și Arabidopsis thaliana flavonol sintază (FLS) [136]. Producția de flavonoide a crescut semnificativ prin reproiectarea în continuare a sistemului metabolic central al E coli pentru a crește precursorul (Malonil-CoA) alimentare [137].

4.2. Modificarea căilor naturale pentru producerea de compuși nenaturali

Unul dintre scopurile biologiei sintetice este de a proiecta sau construi noi circuite genetice. În exemplele date până acum, părțile biologice existente au fost reasamblate pentru a crea un biocatalizator care produce eficient un produs care există deja în natură. Cu toate acestea, căile metabolice pot fi, de asemenea, construite pentru a produce compuși nenaturali.

După cum sa discutat mai sus, evoluția dirijată a proteinelor le poate modifica activitatea astfel încât noi substraturi sunt recunoscute sau se formează noi produse [138]. De exemplu, noi compuși carotenoizi au fost generați prin evoluția a două enzime sintetice carotenoide cheie, fitoen desaturaza și licopen ciclaza [139]. În plus, biosinteza combinatorie, care combină gene de la diferite organisme într-o gazdă heterologă, poate genera, de asemenea, noi produse [140]. De exemplu, patru carotenoizi necunoscuti anterior au fost produși prin biosinteză combinatorie în E coli [141].

4.3. De Novo Pathway Design

Pentru a lărgi spațiul de biosinteză disponibil, este esențial să depășim căile naturale și căile de proiectare de novo [142]. Deși această strategie de design interesantă are încă multe provocări, au fost raportate câteva exemple de succes.

De exemplu, a fost concepută o cale sintetică pentru producerea acidului 3-hidroxipropionic (3-HP) care implică izomerizarea nenaturală a α-alanina la β-alanina, așa cum sa menționat mai sus. În acest exemplu, cercetătorii au folosit evoluția direcționată pentru a extinde specificitatea de substrat a lizinei 2,3-aminomutazei pentru a include α-alanina [73]. Rezultați β-alanina poate fi apoi convertită în 3-HP prin căile metabolice existente.

Căi nenaturale pentru o producție mai mare de alcool în E coli au fost concepute prin combinarea căilor native de sinteză a aminoacizilor cu o decarboxilază 2-cetoacizilor din Lactococcus lactis si alcool dehidrogenaza din S. cerevisiae [143]. Intermediarii 2-cetoacizi din căile de biosinteză a aminoacizilor au fost redirecționați de la producția de aminoacizi la producția de alcool, permițând producerea de 3-metil-1-pentanol. Această cale a fost apoi extinsă pentru producerea de alcooli nenaturali prin reproiectarea rațională a două enzime, biocatalizatorii rezultați având capacitatea de a sintetiza diferiți alcooli nenaturali cu lungimea cuprinsă între cinci și opt atomi de carbon [144].

4.4. Toleranța tehnică la compușii inhibitori

Pe măsură ce repertoriul nostru de compuși produși biologic crește, toleranța la titruri mari de produse devine mai importantă. Biocombustibilii, cum ar fi etanolul și butanolul, pot inhiba creșterea biocatalizatorului și, prin urmare, toleranța biocatalizatorului trebuie îmbunătățită [145-147]. După cum este descris mai sus, scopul nostru este să folosim biomasa lignocelulozică ca substrat pentru producția de combustibili și substanțe chimice de bază. Din păcate, procesele utilizate pentru a transforma biomasa în zaharuri solubile produc, de asemenea, un amestec de produse minore, cum ar fi furfuralul și acidul acetic, care inhibă metabolismul biocatalizatorului [148]. Deși majoritatea acestor inhibitori ar putea fi îndepărtați prin detoxifiere [149], acest proces suplimentar ar crește costul operațional. Prin urmare, este de dorit să se obțină microorganisme care să fie tolerante la acești inhibitori și să poată fermenta direct hidrolizatul de hemiceluloză.

O abordare a creșterii toleranței este înțelegerea mecanismului de inhibiție. Analiza transcriptomului a fost utilizată pentru a testa răspunsul la etanol [145, 150], furfural [151] și butanol [147]. O altă abordare este utilizarea evoluției direcționate, așa cum este evidențiat de exemplul următor. Etanogenic E coli tulpina LY180 (un derivat al LY168 cu utilizarea restabilită a lactozei și integrarea unei endoglucanaze și utilizarea celobiozei) a fost utilizată ca șasiu pentru a selecta rezistența la furfural prin evoluție [148]. Tulpina evoluată, EMFR9, a crescut semnificativ rezistența la furfural. Eforturile de inginerie inversă, inclusiv analiza transcriptomului, au atribuit rezistența la furfural expresiei de tăcere a mai multor oxidoreductaze. Aceste oxidoreductaze folosesc NADPH pentru reducerea furfuralului, epuizând rezervoarele disponibile pentru biosinteză. Astfel, inhibarea creșterii mediată de furfural poate fi atribuită epuizării NADPH [148], o perspectivă care poate fi aplicată altor proiecte de proiectare a biocatalizatorului.

5. Perspective

Deși mulți biocatalizatori au fost reproiectați cu succes pentru producerea de combustibili și substanțe chimice importante din punct de vedere industrial prin inginerie metabolică tradițională, abia începem să vedem potențialul biologiei sintetice în acest domeniu. Unul dintre obiectivele principale ale laboratorului nostru este îmbunătățirea biocatalizatorilor pentru utilizarea biomasei. Pentru a atinge acest obiectiv, toleranța la inhibitorii derivați din hidrolizat trebuie îmbunătățită. Pentru toate aplicațiile, toleranța la titruri mari de substrat și de produs este, de asemenea, importantă. Acest obiectiv de reproiectare a fenotipului unui biocatalizator, adică toleranța, nu este la fel de clar ca reproiectarea metabolismului și o strategie de reproiectare rațională este deosebit de dificilă atunci când mecanismul de inhibare nu este cunoscut.

Pe măsură ce înțelegerea biocatalizatorilor noștri se îmbunătățește, în special prin inginerie inversă a tulpinilor evoluate, modelele la scară genomică pot fi îmbunătățite. Includerea efectelor cinetice și de reglementare va îmbunătăți, de asemenea, acuratețea și puterea predictivă a acestor modele. Rețineți că unele modele au fost dezvoltate recent, care ocolesc însă nevoia de date cinetice [152]. Deoarece enzimele sunt partea funcțională majoră care efectuează sinteza metabolică, instrumentele îmbunătățite de inginerie a proteinelor și noua capacitate catalitică a proteinelor vor ajuta la avansarea acestui domeniu. Este important să se genereze biblioteci de mutageneză a proteinelor de înaltă calitate (biblioteci relativ mici, cu o mare diversitate de enzime) pentru a facilita eforturile eficiente de screening [138]. Screeningul direct din bibliotecile metagenomice a probelor de mediu poate ajuta la izolarea enzimelor cu funcții noi, care nu pot fi obținute prin metodele tradiționale de izolare a tulpinilor [153]. Enzimele pot fi chiar sintetizate de la zero printr-o strategie de proiectare rațională cu ajutor computațional [154]. În sfârșit, noi instrumente pentru mai bine de novo trebuie dezvoltată proiectarea căilor sintetice. Mai multe baze de date, cum ar fi BNICE (Biochemical Network Integrated Computational Explorer) [155] și ReBiT (Retro-Biosynthesis Tool) [142], au fost deja stabilite pentru a facilita identificarea enzimelor pentru a construi o cale sintetică completă pentru producerea compușilor țintă. Este important să se stabilească linii directoare, cum ar fi echilibrul redox, producția de energie și fezabilitatea termodinamică, pentru a selecta printre aceste căi enorme pentru rutele optime.

Prin includerea instrumentelor de biologie sintetică în proiectele de inginerie metabolică și invers, aceste două domenii pot avansa semnificativ în înlocuirea produselor de bază derivate din petrol cu ​​cele produse din carbon și energie bioregenerabile.

Referințe

  1. L. R. Jarboe, T. B. Grabar, L. P. Yomano, K. T. Shanmugan și L. O. Ingram, „Dezvoltarea bacteriilor etanogenice”, Progrese în inginerie biochimică/biotehnologie, vol. 108, pp. 237–261, 2007. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  2. D. G. Gibson, G. A. Benders, C. Andrews-Pfannkoch și colab., „Sinteza chimică completă, asamblarea și clonarea unui genom de Mycoplasma genitalium”, Ştiinţă, vol. 319, nr. 5867, pp. 1215–1220, 2008. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  3. C. Laitigue, S. Vashee, M. A. Algire et al., „Crearea tulpinilor bacteriene din genomi care au fost clonate și modificate în drojdie”, Ştiinţă, vol. 325, nr. 5948, pp. 1693–1696, 2009. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  4. J. E. Bailey, „Către o știință a ingineriei metabolice”, Ştiinţă, vol. 252, nr. 5013, pp. 1668–1675, 1991. Vizualizare la: Google Scholar
  5. G. Stephanopoulos și J. J. Vallino, „Rigiditatea rețelei și ingineria metabolică în supraproducția de metaboliți”, Ştiinţă, vol. 252, nr. 5013, pp. 1675–1681, 1991. Vizualizare la: Google Scholar
  6. G. N. Stephanopoulos, A. A. Aristidou și J. Nielsen, Ingineria metabolică: principii și metodologii, Academic Press, San Diego, California, SUA, 1998.
  7. P. Ball, „Biologie sintetică: pornind de la zero”, Natură, vol. 431, nr. 7009, pp. 624–626, 2004. Vizualizare la: Google Scholar
  8. S. A. Benner și A. M. Sismour, „Biologie sintetică”, Nature Reviews Genetica, vol. 6, nr. 7, pp. 533–543, 2005. Vizualizare la: Google Scholar
  9. R. McDaniel și R. Weiss, „Avansuri în biologia sintetică: pe calea de la prototipuri la aplicații”, Opinie actuală în biotehnologie, vol. 16, nr. 4, pp. 476–483, 2005. Vizualizare la: Google Scholar
  10. J. Pleiss, „Promisiunea biologiei sintetice”, Microbiologie aplicată și biotehnologie, vol. 73, nr. 4, pp. 735–739, 2006. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  11. L. Serrano, „Biologie sintetică: promisiuni și provocări”, Biologia sistemelor moleculare, vol. 3, articolul 158, 2007. Vizualizare la: Site-ul editurii | Google Academic
  12. J. D. Keasling, „Biologie sintetică pentru chimie sintetică”, ACS Biologie chimică, vol. 3, nr. 1, pp. 64–76, 2008. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  13. A. C. Forster și G. M. Church, „Proiecte de biologie sintetică in vitro”, Cercetarea genomului, vol. 17, nr. 1, pp. 1–6, 2007. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  14. D. Greber și M. Fussenegger, „Biologia sintetică a mamiferelor: ingineria rețelelor de gene sofisticate”, Jurnalul de Biotehnologie, vol. 130, nr. 4, pp. 329–345, 2007. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  15. W. Weber și M. Fussenegger, „Impactul biologiei sintetice asupra descoperirii medicamentelor”, Descoperirea drogurilor astăzi, vol. 14, nr. 19-20, pp. 956–963, 2009. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  16. C. E. French, „Biologie sintetică și conversie a biomasei: o potrivire făcută în rai?” Journal of the Royal Society Interface, vol. 6, suplimentul 4, pp. S547–S558, 2009. Vizualizare la: Google Scholar
  17. S. K. Lee, H. Chou, T. S. Ham, T. S. Lee și J. D. Keasling, „Ingineria metabolică a microorganismelor pentru producția de biocombustibili: de la bug-uri la biologia sintetică la combustibili,” Opinie actuală în biotehnologie, vol. 19, nr. 6, pp. 556–563, 2008. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  18. S. Picataggio, „Impactul potențial al biologiei sintetice asupra dezvoltării sistemelor microbiene pentru producția de combustibili și substanțe chimice regenerabile”, Opinie actuală în biotehnologie, vol. 20, nr. 3, pp. 325–329, 2009. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  19. A. M. Feist, C. S. Henry, J. L. Reed și colab., „A genome-scale metabolic reconstruction for Escherichia coli K-12 MG1655 care reprezintă 1260 de ORF-uri și informații termodinamice. Biologia sistemelor moleculare, vol. 3, articolul 121, 2007. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  20. I. M. Keseler, C. Bonavides-Martínez, J. Collado-Vides et al., „EcoCyc: a comprehensive view of Escherichia coli biologie," Cercetarea acizilor nucleici, vol. 37, supliment 1, pp. D464–D470, 2009. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  21. D. Endy, „Fundații pentru biologia inginerească”, Natură, vol. 438, nr. 7067, pp. 449–453, 2005. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  22. T. B. Grabar, S. Zhou, K. T. Shanmugam, L. P. Yomano și L. O. Ingram, „Methylglyoxal bypass identificat ca sursă de contaminare chirală în fermentațiile L(+) și D(-)-lactat prin recombinare. Escherichia coli,” Scrisori de biotehnologie, vol. 28, nr. 19, pp. 1527–1535, 2006. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  23. T. B. Causey, S. Zhou, K. T. Shanmugam și L. O. Ingram, „Engineering the metabolism of Escherichia coli W3110 pentru conversia zahărului în produse redox neutre și oxidate: producția de homoacetat,” Proceedings of the National Academy of Sciences din Statele Unite ale Americii, vol. 100, nr. 3, pp. 825–832, 2003. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  24. K. Jantama, X. Zhang, J. C. Moore, K. T. Shanmugam, S. A. Svoronos și L. O. Ingram, „Eliminating side products and growing succinate yields in engineered strains of Escherichia coli C,” Biotehnologie și Bioinginerie, vol. 101, nr. 5, pp. 881–893, 2008. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  25. L. P. Yomano, S. W. York, K. T. Shanmugam și L. O.Ingram, „Ștergerea genei metilglioxal sintetazei (mgsA) a crescut cometabolismul zahărului în producția de etanol Escherichia coli,” Scrisori de biotehnologie, vol. 31, nr. 9, pp. 1389–1398, 2009. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  26. P. C. Cirino, J. W. Chin și L. O. Ingram, „Engineering Escherichia coli pentru producția de xilitol din amestecuri de glucoză-xiloză”, Biotehnologie și Bioinginerie, vol. 95, nr. 6, pp. 1167–1176, 2006. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  27. X. Zhang, K. Jantama, J. C. Moore, K. T. Shanmugam și L. O. Ingram, „Production of L-alanine by metabolically engineered Escherichia coli,” Microbiologie aplicată și biotehnologie, vol. 77, nr. 2, pp. 355–366, 2007. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  28. R. S. Senger și E. T. Papoutsakis, „Model la scară genomică pentru Clostridium acetobutylicum – partea I: rezoluția și analiza rețelei metabolice” Biotehnologie și Bioinginerie, vol. 101, nr. 5, pp. 1036–1052, 2008. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  29. K. R. Kjeldsen și J. Nielsen, „Reconstrucția și validarea la scară a genomului in silico a rețelei metabolice de corynebacterium glutamicum”, Biotehnologie și Bioinginerie, vol. 102, nr. 2, pp. 583–597, 2009. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  30. J. Forster, I. Famili, P. Fu et al., „Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network,” Cercetarea genomului, vol. 13, nr. 2, pp. 244–253, 2003. Vizualizare la: Google Scholar
  31. M. R. Andersen, M. L. Nielsen și J. Nielsen, „Modelul metabolic de integrare a bibliomului, genomului, metabolomului și reactomului Aspergillus niger”, Biologia sistemelor moleculare, vol. 4, articolul 178, 2008. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  32. F. R. Blattner și colab., „Secvența completă a genomului Escherichia coli K-12,” Ştiinţă, vol. 277, nr. 5331, pp. 1453–1474, 1997. Vizualizare la: Google Scholar
  33. R. U. Ibarra, J. S. Edwards și B. O. Palsson, „Escherichia coli K-12 suferă o evoluție adaptivă pentru a obține o creștere optimă prezisă in silico. Natură, vol. 420, nr. 6912, pp. 186–189, 2002. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  34. A. P. Bauer, S. M. Dieckmann, W. Ludwig și K.-H. Schleifer, „Identificarea rapidă a Escherichia coli siguranța și liniile de tulpini de laborator bazate pe Multiplex-PCR”, Scrisori de microbiologie FEMS, vol. 269, nr. 1, pp. 36–40, 2007. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  35. S. Zhou, L. P. Yomano, K. T. Shanmugam și L. O. Ingram, „Fermentation of 10% ( w / v ) sugar to D: ( − ) -lactate by engineered Escherichia coli B,” Scrisori de biotehnologie, vol. 27, nr. 23-24, p. 1891–1896, 2005. Vizualizare la: Site-ul editurii | Google Academic
  36. M. Moniruzzaman, X. Lai, S. W. York și L. O. Ingram, „Izolarea și caracterizarea moleculară a mutanților spontani de fermentare a celobiozei de înaltă performanță ai etanologenic Escherichia coli KO11 care conține operonul casAB Klebsiella oxytoca,” Microbiologie aplicată și de mediu, vol. 63, nr. 12, pp. 4633–4637, 1997. Vizualizare la: Google Scholar
  37. G. Posfai, G. Plunkett III, T. Fehér et al., „Emergent properties of reduced-genome Escherichia coli,” Ştiinţă, vol. 312, nr. 5776, pp. 1044–1046, 2006. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  38. M. Durot, P.-Y. Bourguignon și V. Schachter, „Modele la scară genomică ale metabolismului bacterian: reconstrucție și aplicații”, Recenzii de microbiologie FEMS, vol. 33, nr. 1, pp. 164–190, 2009. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  39. N. D. Price, J. A. Papin, C. H. Schilling și B. O. Palsson, „Genome-scale microbial in silico models: the constraints-based approach,” Tendințe în biotehnologie, vol. 21, nr. 4, pp. 162–169, 2003. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  40. P. Pharkya, A. P. Burgard și C. D. Maranas, „OptStrain: un cadru de calcul pentru reproiectarea sistemelor de producție microbiană”, Cercetarea genomului, vol. 14, nr. 11, pp. 2367–2376, 2004. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  41. A. P. Burgard, P. Pharkya și C. D. Maranas, „OptKnock: un cadru de programare pe două niveluri pentru identificarea strategiilor de eliminare a genelor pentru optimizarea tulpinilor microbiene”, Biotehnologie și Bioinginerie, vol. 84, nr. 6, pp. 647–657, 2003. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  42. H. Alper, Y.-S. Jin, J. F. Moxley și G. Stephanopoulos, „Identificarea țintelor genelor pentru ingineria metabolică a biosintezei licopenului în Escherichia coli,” Inginerie metabolică, vol. 7, nr. 3, pp. 155–164, 2005. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  43. C. Bro și J. Nielsen, „Impactul analizelor „ome” asupra ingineriei metabolice inverse”, Inginerie metabolică, vol. 6, nr. 3, pp. 204–211, 2004. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  44. S. Y. Lee, D. Y. Lee și T. Y. Kim, „Sisteme de biotehnologie pentru îmbunătățirea tulpinilor”, Tendințe în biotehnologie, vol. 23, nr. 7, pp. 349–358, 2005. Vizualizare la: Google Scholar
  45. T. Hermann, „Utilizarea genomicii funcționale pentru a îmbunătăți productivitatea în fabricarea produselor biochimice industriale”, Opinie actuală în biotehnologie, vol. 15, nr. 5, pp. 444–448, 2004. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  46. J. H. Choi, S. J. Lee și S. Y. Lee, „Producerea îmbunătățită a proteinei de fuziune a factorului I de creștere asemănătoare insulinei în Escherichia coli prin coexprimarea genelor reglate în jos identificate prin profilarea transcriptomului”, Microbiologie aplicată și de mediu, vol. 69, nr. 8, pp. 4737–4742, 2003. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  47. M.-J. Han, K. J. Jeong, J.-S. Yoo și S. Y. Lee, „Inginerie Escherichia coli pentru o productivitate crescută a proteinelor bogate în serină bazată pe profilarea proteomilor. Microbiologie aplicată și de mediu, vol. 69, nr. 10, pp. 5772–5781, 2003. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  48. B. F. Pfleger, D. J. Pitera, C. D. Smolke și J. D. Keasling, „Combinatorial engineering of intergenic regions in operons tunes expression of multiple genes”, Biotehnologia naturii, vol. 24, nr. 8, pp. 1027–1032, 2006. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  49. S. A. Underwood, M. L. Buszko, K. T. Shanmugam și L. O. Ingram, „Fluxul prin citrat sintetaza limitează creșterea etanologenului Escherichia coli KO11 în timpul fermentației xilozei”, Microbiologie aplicată și de mediu, vol. 68, nr. 3, pp. 1071–1081, 2002. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  50. M. Askenazi, E. M. Driggers, D. A. Holtzman și colab., „Integrarea profilurilor transcripționale și metabolice pentru a direcționa ingineria tulpinilor fungice producătoare de lovastatin”, Biotehnologia naturii, vol. 21, nr. 2, pp. 150–156, 2003. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  51. J. Ohnishi, S. Mitsuhashi, M. Hayashi et al., „O metodologie nouă care utilizează informații despre genomul Corynebacterium glutamicum pentru a genera un nou mutant care produce L-lizină”, Microbiologie aplicată și biotehnologie, vol. 58, nr. 2, pp. 217–223, 2002. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  52. F. Martinez-Morales, A. C. Borges, A. Martinez, K. T. Shanmugam și L. O. Ingram, „Chromosomal Integration of heterologous DNA in Escherichia coli cu îndepărtarea precisă a markerilor și replicooanelor utilizate în timpul construcției,” Jurnalul de bacteriologie, vol. 181, nr. 22, pp. 7143–7148, 1999. Vizualizare la: Google Scholar
  53. K. A. Datsenko și B. L. Wanner, „Inactivarea într-un singur pas a genelor cromozomiale în Escherichia coli K-12 folosind produse PCR,” Proceedings of the National Academy of Sciences din Statele Unite ale Americii, vol. 97, nr. 12, pp. 6640–6645, 2000. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  54. G. Pósfai, M. D. Koob, H. A. Kirkpatrick și F. R. Blattner, „Plasmide de inserție versatile pentru manipulări țintite ale genomului în bacterii: izolarea, ștergerea și salvarea insulei de patogenitate LEE a Escherichia coli O157: genomul H7,” Jurnalul de bacteriologie, vol. 179, nr. 13, pp. 4426–4428, 1997. Vizualizare la: Google Scholar
  55. P. Gay, D. Le Coq, M. Steinmetz și colab., „Procedura de selecție pozitivă pentru captarea elementelor secvenței de inserție în bacteriile gram-negative”, Jurnalul de bacteriologie, vol. 164, nr. 2, pp. 918–921, 1985. Vizualizare la: Google Scholar
  56. G. de la Cueva-Mendez și B. Pimentel, „Gene și supraviețuirea celulelor: lecții din plasmida procariotă R1”, Rapoartele EMBO, vol. 8, nr. 5, pp. 458–464, 2007. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  57. S. Zhou, F. C. Davis și L. O. Ingram, „Integrarea și expresia genelor și secreția extracelulară a endoglucanazei Erwinia chrysanthemi CelY (celY) și CelZ (celZ) în Klebsiella oxytoca P2 etanogenică,” Microbiologie aplicată și de mediu, vol. 67, nr. 1, pp. 6–14, 2001. Vizualizare la: Google Scholar
  58. P. R. Jensen și K. Hammer, „Secvența distanțierilor dintre secvențele consens modulează puterea promotorilor procarioți”, Microbiologie aplicată și de mediu, vol. 64, nr. 1, pp. 82–87, 1998. Vizualizare la: Google Scholar
  59. H. Alper, C. Fischer, E. Nevoigt și G. Stephanopoulos, „Tuning genetic control through promoter engineering,” Proceedings of the National Academy of Sciences din Statele Unite ale Americii, vol. 102, nr. 36, pp. 12678–12683, 2005. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  60. I. Meynial-Salles, M. A. Cervin și P. Soucaille, „Un nou instrument pentru ingineria căilor metabolice în Escherichia coli: metodă într-un singur pas pentru a modula expresia genelor cromozomiale,” Microbiologie aplicată și de mediu, vol. 71, nr. 4, pp. 2140–2144, 2005. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  61. C. Solem și P. R. Jensen, „Modularea expresiei genelor este ușoară”, Microbiologie aplicată și de mediu, vol. 68, nr. 5, pp. 2397–2403, 2002. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  62. T. A. Carrier și J. D. Keasling, „Biblioteca de structuri secundare sintetice 5’ pentru a manipula stabilitatea ARNm în Escherichia coli,” Progresul Biotehnologiei, vol. 15, nr. 1, pp. 58–64, 1999. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  63. Y. S. Park, S. W. Seo, S. Hwang et al., „Design of 5'-untranslated region variants for tunable expression in Escherichia coli,” Comunicări de cercetare biochimică și biofizică, vol. 356, nr. 1, pp. 136–141, 2007. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  64. F. J. Isaacs, D. J. Dwyer, C. Ding, D. D. Pervouchine, C. R. Cantor și J. J. Collins, „Riboregulatorii proiectați permit controlul post-transcripțional al expresiei genelor”, Biotehnologia naturii, vol. 22, nr. 7, pp. 841–847, 2004. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  65. S. Jana și J. K. Deb, „Strategii pentru producția eficientă de proteine ​​heterologe în Escherichia coli,” Microbiologie aplicată și biotehnologie, vol. 67, nr. 3, pp. 289–298, 2005. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  66. H. Alper, J. Moxley, E. Nevoigt, G. R. Fink și G. Stephanopoulos, „Mașini de transcripție de drojdie de inginerie pentru toleranță și producție îmbunătățite la etanol”, Ştiinţă, vol. 314, nr. 5805, pp. 1565–1568, 2006. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  67. H. Alper și G. Stephanopoulos, „Inginerie globală a mașinilor de transcripție: o nouă abordare pentru îmbunătățirea fenotipului celular”, Inginerie metabolică, vol. 9, nr. 3, pp. 258–267, 2007. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  68. I. P. Petrounia și F. H. Arnold, „Evoluția proiectată a proprietăților enzimatice”, Opinie actuală în biotehnologie, vol. 11, nr. 4, pp. 325–330, 2000. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  69. H. Zhao, L. Giver, Z. Shao, J. A. Affholter și F. H. Arnold, „Molecular evolution by staggered extension process (StEP) in vitro recombination,” Biotehnologia naturii, vol. 16, nr. 3, pp. 258–261, 1998. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  70. A. Crameri, S.-A. Raillard, E. Bermudez și W. P. C. Stemmer, „Amestecarea ADN-ului unei familii de gene din diverse specii accelerează evoluția direcționată”, Natură, vol. 391, nr. 6664, pp. 288–291, 1998. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  71. C. Wang, M.-K. Oh, și J. C. Liao, „Evoluția dirijată a ingineriei metabolice Escherichia coli pentru producția de carotenoizi” Progresul Biotehnologiei, vol. 16, nr. 6, pp. 922–926, 2000. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  72. P. C. Cirino și F. H. Arnold, „Protein engineering of oxygenazes for biocatalysis,” Opinie curentă în biologie chimică, vol. 6, nr. 2, pp. 130–135, 2002. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  73. H. H. Liao, „Alanine 2,3-aminomutase”, brevet SUA 7309597, 2007. Vizualizare la: Google Scholar
  74. M. M. Altamirano, J. M. Blackburn, C. Aguayo și A. R. Fersht, „Evoluția direcționată a noii activități catalitice folosind schela α / β -baril”, Natură, vol. 403, nr. 6770, pp. 617–622, 2000. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  75. M. Leisola și O. Turunen, „Ingineria proteinelor: oportunități și provocări”, Microbiologie aplicată și biotehnologie, vol. 75, nr. 6, pp. 1225–1232, 2007. Vizualizare la: Google Scholar
  76. A. Korkegian, M. E. Black, D. Baker și B. L. Stoddard, „Computațională termostabilizare a unei enzime”, Ştiinţă, vol. 308, nr. 5723, pp. 857–860, 2005. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  77. R. Machielsen, L. L. Looger, J. Raedts și colab., „Cofactor engineering of Lactobacillus brevis alcohol dehidrogenase by computational design,” Inginerie în Științe ale Vieții, vol. 9, nr. 1, pp. 38–44, 2009. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  78. J. D. Bloom, M. M. Meyer, P. Meinhold, C. R. Otey, D. MacMillan și F. H. Arnold, „Evolving strategies for enzyme engineering,” Opinie actuală în biologie structurală, vol. 15, nr. 4, pp. 447–452, 2005. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  79. R. A. Chica, N. Doucet și J. N. Pelletier, „Abordări semi-raționale ale activității enzimelor de inginerie: combinând beneficiile evoluției direcționate și ale designului rațional”, Opinie actuală în biotehnologie, vol. 16, nr. 4, pp. 378–384, 2005. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  80. O. Spadiut, I. Pisanelli, T. Maischberger et al., „Ingineria piranozei 2-oxidazei: îmbunătățirea aplicațiilor pentru celulele biocombustibile și alimentare prin proiectarea proteinelor semi-raționale”, Jurnalul de Biotehnologie, vol. 139, nr. 3, pp. 250–257, 2009. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  81. Q. Wang, A. R. Parrish și L. Wang, „Extinderea codului genetic pentru studiile biologice”, Chimie și Biologie, vol. 16, nr. 3, pp. 323–336, 2009. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  82. Y. Lu, „Proiectarea și ingineria metaloproteinelor care conțin aminoacizi nenaturali sau cofactori care conțin metale nenative”, Opinie curentă în biologie chimică, vol. 9, nr. 2, pp. 118–126, 2005. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  83. J. C. Jackson, S. P. Duffy, K. R. Hess și R. A. Mehl, „Îmbunătățirea site-ului activ al enzimelor naturii cu aminoacizi nenaturali codificați genetic”, Jurnalul Societății Americane de Chimie, vol. 128, nr. 34, pp. 11124–11127, 2006. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  84. D. B. Walker, G. Joshi și A. P. Davis, „Progres în recunoașterea carbohidraților biomimetici”, Științe celulare și moleculare ale vieții, vol. 66, nr. 19, pp. 3177–3191, 2009. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  85. M. P. Cashion și T. E. Long, „Proiectarea biomimetică și performanța lipidelor polimerizabile”, Conturile cercetării chimice, vol. 42, nr. 8, pp. 1016–1025, 2009. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  86. S. S. Fong, A. P. Burgard, C. D. Herring et al., „Proiectarea in silico și evoluția adaptivă a Escherichia coli pentru producerea acidului lactic” Biotehnologie și Bioinginerie, vol. 91, nr. 5, pp. 643–648, 2005. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  87. X. Zhang, K. Jantama, J. C. Moore, L. R. Jarboe, K. T. Shanmugam și L. O. Ingram, „Evoluția metabolică a căilor de conservare a energiei pentru producția de succinat în Escherichia coli,” Proceedings of the National Academy of Sciences din Statele Unite ale Americii, vol. 106, nr. 48, pp. 20180–20185, 2010. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  88. J. G. Zeikus, M. K. Jain și P. Elankovan, „Biotehnologia producției de acid succinic și a piețelor pentru produse industriale derivate”, Microbiologie aplicată și biotehnologie, vol. 51, nr. 5, pp. 545–552, 1999. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  89. J. B. McKinlay, C. Vieille și J. G. Zeikus, „Perspective for a bio-based succinate industry”, Microbiologie aplicată și biotehnologie, vol. 76, nr. 4, pp. 727–740, 2007. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  90. N. S. Samuelov, R. Lamed, S. Lowe și I. G. Zeikus, „Influența nivelurilor și pH-ului de CO 2 - HCO 3 asupra creșterii, producției de succinat și activităților enzimatice ale Anaerobiospirillum succiniciproducens,” Microbiologie aplicată și de mediu, vol. 57, nr. 10, pp. 3013–3019, 1991. Vizualizare la: Google Scholar
  91. M. J. Vander Werf, M. V. Guettler, M. K. Jain și J. G. Zeikus, „Factorii de mediu și fiziologici care afectează raportul de produs succinat în timpul fermentației carbohidraților de către Actinobacillus sp. 130Z,” Arhivele de microbiologie, vol. 167, nr. 6, pp. 332–342, 1997. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  92. P. Lee, S. Lee, S. Hong și H. Chang, „Izolarea și caracterizarea unei noi bacterii producătoare de acid succinic, Mannheimia succiniciproducens MBEL55E, din rumenul bovinelor,” Microbiologie aplicată și biotehnologie, vol. 58, nr. 5, pp. 663–668, 2002. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  93. D. G. Fraenkel, „Glycolysis”, în Escherichia coli și Salmonella: Biologie celulară și moleculară, F. C.Neidhardt, Ed., ASM Press, Washington, DC, SUA, 1996. Vizualizare la: Google Scholar
  94. K. Jantama, M. J. Haupt, S. A. Svoronos et al., „Combinând ingineria metabolică și evoluția metabolică pentru a dezvolta tulpini nerecombinante de Escherichia coli C care produc succinat și malat”, Biotehnologie și Bioinginerie, vol. 99, nr. 5, pp. 1140–1153, 2008. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  95. M.-K. Oh, L. Rohlin, K. C. Kao și J. C. Liao, „Global expression profile of acetate-grown Escherichia coli,” Jurnalul de chimie biologică, vol. 277, nr. 15, pp. 13175–13183, 2002. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  96. K. C. Kao, L. M. Tran și J. C. Liao, „Un rol regulator global al genelor gluconeogenice în Escherichia coli dezvăluite prin analiza rețelei transcriptomului”, Jurnalul de chimie biologică, vol. 280, nr. 43, pp. 36079–36087, 2005. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  97. R. Patnaik, W. D. Roof, R. F. Young și J. C. Liao, „Stimularea catabolismului glucozei în Escherichia coli printr-un potențial ciclu inutil”, Jurnalul de bacteriologie, vol. 174, nr. 23, pp. 7527–7532, 1992. Vizualizare la: Google Scholar
  98. X. Zhang, K. Jantama, K. T. Shanmugam și L. O. Ingram, „Reengineering Escherichia coli pentru producția de succinat în mediu de săruri minerale,” Microbiologie aplicată și de mediu, vol. 75, nr. 24, pp. 7807–7813, 2009. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  99. S. S. Ray și M. Bousmina, „Polimerii biodegradabili și nanocompozitele lor stratificate de silicat: în ecologizarea lumii materialelor din secolul 21”, Progres în știința materialelor, vol. 50, nr. 8, pp. 962–1079, 2005. Vizualizare la: Google Scholar
  100. A. K. Agrawal și R. Bhalla, „Avansuri în producția de fibre poli(acid lactic). Un comentariu," Journal of Macromolecular Science-Polymer Reviews C, vol. 43, nr. 4, pp. 479–503, 2003. Vizualizare la: Google Scholar
  101. S. Benthin și J. Villadsen, „Producția de D-lactat optic pur de către Lactobacillus bulgaricus și purificarea prin cristalizare și extracție lichid/lichid”, Microbiologie aplicată și biotehnologie, vol. 42, nr. 6, pp. 826–829, 1995. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  102. A. Demirci și A. L. Pometto, „Producția îmbunătățită de acid D(-)-lactic de către mutanții de lactobacillus-delbrueckii ATCC-9649,” Jurnalul de Microbiologie Industrială, vol. 11, nr. 1, pp. 23–28, 1992. Vizualizare la: Google Scholar
  103. D. G. Fraenkel, „Glycolysis”, în Escherichia coli și Salmonella: Biologie celulară și moleculară, F. C. Neidhardt, Ed., voi. 1, capitolul 14, ASM Press, Washington DC, SUA, ediția a 2-a, 1996. Vizualizare la: Google Scholar
  104. S. Zhou, T. B. Causey, A. Hasona, K. T. Shanmugam și L. O. Ingram, „Producția de acid D-lactic optic pur în mediu de săruri minerale prin inginerie metabolică Escherichia coli W3110,” Microbiologie aplicată și de mediu, vol. 69, nr. 1, pp. 399–407, 2003. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  105. S. Zhou, K. T. Shanmugam, L. P. Yomano, T. B. Grabar și L. O. Ingram, „Fermentation of 12% (w / v) glucose to 1.2 M lactate by Escherichia coli tulpina SZ194 folosind săruri minerale mediu,” Scrisori de biotehnologie, vol. 28, nr. 9, pp. 663–670, 2006. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  106. M. Cheryan, S. Parekh, M. Shah și K. Witjitra, „Producția de acid acetic de către Clostridium thermoaceticum”, Progrese în microbiologia aplicată, vol. 43, pp. 1–33, 1997. Vizualizare la: Google Scholar
  107. C. Berraud, „Producția de oțet foarte concentrat în cultură alimentată”, Scrisori de biotehnologie, vol. 22, nr. 6, pp. 451–454, 2000. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  108. S. N. Freer, „Producerea acidului acetic de către drojdiile Dekkera/Bretanomyces”, Jurnalul Mondial de Microbiologie și Biotehnologie, vol. 18, nr. 3, pp. 271–275, 2002. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  109. S. Y. Lee, J. H. Park, S. H. Jang, L. K. Nielsen, J. Kim și K. S. Jung, „Fermentative butanol production by clostridia”, Biotehnologie și Bioinginerie, vol. 101, nr. 2, pp. 209–228, 2008. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  110. L. D. Mermelstein, E. T. Papoutsakis, D. J. Petersen și G. N. Bennett, „Ingineria metabolică a Clostridium acetobutylicum ATCC 824 pentru creșterea producției de solvenți prin îmbunătățirea activităților enzimatice de formare a acetonei folosind un operon sintetic de acetonă” Biotehnologie și Bioinginerie, vol. 42, nr. 9, pp. 1053–1060, 1993. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  111. L. Harris, L. Blank, R. P. Desai, N. E. Welker și E. T. Papoutsakis, „Caracterisarea fermentației și analiza fluxului tulpinilor recombinate de Clostridium acetobutylicum cu o genă soIR inactivată”, Jurnal de Microbiologie Industrială și Biotehnologie, vol. 27, nr. 5, pp. 322–328, 2001. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  112. R. V. Nair, E. M. Green, D. E. Watson, G. N. Bennett și E. T. Papoutsakis, „Regularea genelor sol locus pentru butanol și formarea acetonei în Clostridium acetobutylicum ATCC 824 de către un presupus represor transcripțional,” Jurnalul de bacteriologie, vol. 181, nr. 1, pp. 319–330, 1999. Vizualizare la: Google Scholar
  113. R. P. Desai și E. T. Papoutsakis, „Strategii ARN antisens pentru ingineria metabolică a Clostridium acetobutylicum”, Microbiologie aplicată și de mediu, vol. 65, nr. 3, pp. 936–945, 1999. Vizualizare la: Google Scholar
  114. N. E. Altaras și D. C. Cameron, „Producția îmbunătățită de (R)-1,2-propandiol prin inginerie metabolică Escherichia coli,” Progresul Biotehnologiei, vol. 16, nr. 6, pp. 940–946, 2000. Vizualizare la: Google Scholar
  115. P. Soucaille, I. Meynial-Salles, F. Voelker și R. Figge, „Microorganisms and methods for prodcution of 1,2-propanediol and acetol”, WO, 2008, 2008/116853. Vizualizați la: Google Scholar
  116. J. H. Park, K. H. Lee, T. Y. Kim și S. Y. Lee, „Ingineria metabolică a Escherichia coli pentru producerea de L-valină bazată pe analiza transcriptomului și simularea knockout a genei in silico. Proceedings of the National Academy of Sciences din Statele Unite ale Americii, vol. 104, nr. 19, pp. 7797–7802, 2007. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  117. K. H. Lee, J. H. Park, T. Y. Kim, H. U. Kim și S. Y. Lee, „Systems metabolic engineering of Escherichia coli pentru producția de L-treonină,” Biologia sistemelor moleculare, vol. 3, articolul 149, 2007. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  118. L. O. Ingram, P. F. Gomez, X. Lai și colab., „Ingineria metabolică a bacteriilor pentru producția de etanol”, Biotehnologie și Bioinginerie, vol. 58, nr. 2-3, pp. 204–214, 1998. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  119. Y. Kim, L. O. Ingram și K. T. Shanmugam, „Construction of an Escherichia coli Mutant K-12 pentru fermentația homoetanogenică a glucozei sau xilozei fără gene străine. Microbiologie aplicată și de mediu, vol. 73, nr. 6, p. 1766–1771, 2007. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  120. L. O. Ingram, T. Conway, D. P. Clark, G. W. Sewell și J. F. Preston, „Ingineria genetică a producției de etanol în Escherichia coli”, Microbiologie aplicată și de mediu, vol. 53, nr. 10, pp. 2420–2425, 1987. Vizualizare la: Google Scholar
  121. K. Ohta, D. S. Beall, J. P. Mejia, K. T. Shanmugam și L. O. Ingram, „Îmbunătățirea genetică a Escherichia coli pentru producția de etanol: integrarea cromozomială a genelor Zymomonas mobilis care codifică piruvat decarboxilaza și alcool dehidrogenaza II,” Microbiologie aplicată și de mediu, vol. 57, nr. 4, pp. 893–900, 1991. Vizualizare la: Google Scholar
  122. L. P. Yomano, S. W. York, S. Zhou, K. T. Shanmugam și L. O. Ingram, „Re-ingineria Escherichia coli pentru producția de etanol” Scrisori de biotehnologie, vol. 30, nr. 12, pp. 2097–2103, 2008. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  123. A. Hasona, S. W. York, L. P. Yomano, L. O. Ingram și K. T. Shanmugam, „Scăderea nivelului de acetat de etil în bulioanele de fermentație etanolică ale Escherichia coli KO11 prin exprimarea Pseudomonas putida estZ esteraza”, Microbiologie aplicată și de mediu, vol. 68, nr. 6, pp. 2651–2659, 2002. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  124. K. Hofvendahl și B. Hahn-Hagerdal, „Factorii care afectează producția de acid lactic fermentativ din resurse regenerabile”, Tehnologia enzimatică și microbiană, vol. 26, nr. 2–4, pp. 87–107, 2000. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  125. S. D. Zhou, K. T. Shanmugam și L. O. Ingram, „Înlocuirea funcțională a Escherichia coli Gena D-(-)-lactat dehidrogenazei (ldhA) cu gena L-(+)-lactat dehidrogenazei (ldhL) de la Pediococcus acidilactici,” Microbiologie aplicată și de mediu, vol. 69, nr. 4, pp. 2237–2244, 2003. Vizualizare la: Google Scholar
  126. J. C. Parajó, H. Domínguez și J. M. Domínguez, „Producția biotehnologică de xilitol – partea 1: interesul xilitolului și elementele fundamentale ale biosintezei sale”, Tehnologia resurselor biologice, vol. 65, nr. 3, pp. 191–201, 1998. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  127. T. Werpy și G. Petersen, Eds., Substanțe chimice cu valoare adăugată superioară din biomasă: volumul I — Rezultatele screening-ului pentru potențialii candidați din zaharuri și gaze de sinteză, Pacific Northwest National Laboratory și National Renewable Energy Laboratory, 2004.
  128. T. B. Kim și D. K. Oh, „Producerea de xilitol de către Candida tropicalis într-un mediu definit chimic”, Scrisori de biotehnologie, vol. 25, nr. 24, pp. 2085–2088, 2003. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  129. J. W. Chin, R. Khankal, C. A. Monroe, C. D. Maranas și P. C. Cirino, „Analysis of NADPH supply during xylitol production by engineered Escherichia coli,” Biotehnologie și Bioinginerie, vol. 102, nr. 1, pp. 209–220, 2009. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  130. P. Hols, M. Kleerebezem, A. N. Schanck și colab., „Conversia Lactococcus lactis de la fermentația homolactică la homoalanina prin inginerie metabolică”, Biotehnologia naturii, vol. 17, nr. 6, pp. 588–592, 1999. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  131. M. Ikeda, „Procesele de producție de aminoacizi”, Progrese în inginerie biochimică/biotehnologie, vol. 79, pp. 1–35, 2003. Vizualizare la: Google Scholar
  132. C. E. Nakamura și G. M. Whited, „Inginerie metabolică pentru producția microbiană de 1,3-propandiol”, Opinie actuală în biotehnologie, vol. 14, nr. 5, pp. 454–459, 2003. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  133. T. Hanai, S. Atsumi și J. C. Liao, „Cale sintetică proiectată pentru producția de izopropanol în Escherichia coli,” Microbiologie aplicată și de mediu, vol. 73, nr. 24, pp. 7814–7818, 2007. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  134. D.-K. Ro, E. M. Paradise, M. Quellet și colab., „Producția acidului artemisinic precursor de medicament antimalaric în drojdie artificială,” Natură, vol. 440, nr. 7086, pp. 940–943, 2006. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  135. Y. Yan, A. Kohli și M. A. G. Koffas, „Biosinteza flavanonelor naturale în Saccharomyces cerevisiae”, Microbiologie aplicată și de mediu, vol. 71, nr. 9, pp. 5610–5613, 2005. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  136. E. Leonard, Y. Yan și M. A. G. Koffas, „Expresia funcțională a unei hidroxilaze flavonoide P450 pentru biosinteza flavonolilor hidroxilați specifici plantelor în Escherichia coli,” Inginerie metabolică, vol. 8, nr. 2, pp. 172–181, 2006. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  137. E. Leonard, K. H. Lim, P.-N. Saw și M. A. G. Koffas, „Ingineria căilor metabolice centrale pentru producția de flavonoide de nivel înalt în Escherichia coli,” Microbiologie aplicată și de mediu, vol. 73, nr. 12, pp. 3877–3886, 2007. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  138. A. L. de Boer și C. Schmidt-Dannert, „Eforturi recente în proiectarea celulelor microbiene pentru a produce noi compuși chimici”, Opinie curentă în biologie chimică, vol. 7, nr. 2, pp. 273–278, 2003. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  139. C. Schmidt-Dannert, D. Umeno și F. H. Arnold, „Molecular breeding of carotenoid biosynthetic pathways,” Biotehnologia naturii, vol. 18, nr. 7, pp. 750–753, 2000. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  140. G. Sandmann, „Biosinteza combinată a carotenoidelor într-o gazdă heterologă: o abordare puternică pentru biosinteza structurilor noi”, ChemBioChem, vol. 3, nr. 7, pp. 629–635, 2002. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  141. M. Albrecht, S. Takaichi, S. Steiger, Z.-Y. Wang și G. Sandmann, „Hidroxicarotenoide noi cu proprietăți antioxidante îmbunătățite, produse de combinația de gene în Escherichia coli,” Biotehnologia naturii, vol. 18, nr. 8, pp. 843–846, 2000. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  142. K. L. J. Prather și C. H. Martin, „Căile biosintetice de novo: proiectarea rațională a fabricilor de produse chimice microbiene”, Opinie actuală în biotehnologie, vol. 19, nr. 5, pp. 468–474, 2008. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  143. S. Atsumi, T. Hanai și J. C. Liao, „Căi non-fermentative pentru sinteza alcoolilor superiori cu lanț ramificat ca biocombustibili”, Natură, vol. 451, nr. 7174, pp. 86–89, 2008. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  144. K. Zhang, M. R. Sawaya, D. S. Eisenberg și J. C. Liao, „Extinderea metabolismului pentru biosinteza alcoolilor nenaturali”, Proceedings of the National Academy of Sciences din Statele Unite ale Americii, vol. 105, nr. 52, pp. 20653–20658, 2008. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  145. R. Gonzalez, H. Tao, J. E. Purvis, S. W. York, K. T. Shanmugam și L. O. Ingram, „Identificarea bazată pe matrice genetică a modificărilor care contribuie la toleranța la etanol în etanogenic. Escherichia coli: comparație între KO11 (părinte) cu LY01 (mutant rezistent),” Progresul Biotehnologiei, vol. 19, nr. 2, pp. 612–623, 2003. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  146. L. P. Yomano, S. W. York și L. O. Ingram, „Izolarea și caracterizarea mutanților toleranți la etanol ai Escherichia coli KO11 pentru producția de etanol de combustibil”, Jurnal de Microbiologie Industrială și Biotehnologie, vol. 20, nr. 2, pp. 132–138, 1998. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  147. M. P. Brynildsen și J. C. Liao, „O abordare de rețea integrată identifică rețeaua de răspuns la izobutanol a Escherichia coli,” Biologia sistemelor moleculare, vol. 5, articolul 277, 2009. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  148. E. N. Miller și colab., „Tăcerea genelor oxidoreductazei dependente de NADPH (yqhD și dkgA) în etanogenic rezistent la furfural Escherichia coli,” Microbiologie aplicată și de mediu, vol. 75, nr. 13, pp. 4315–4323, 2009. Vizualizare la: Google Scholar
  149. A. Martinez, M. E. Rodriguez, M. L. Wells, S. W. York, J. F. Preston și L. O. Ingram, „Detoxification of dilute acid hydrolysates of lignocelulose with lime,” Progresul Biotehnologiei, vol. 17, nr. 2, pp. 287–293, 2001. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  150. R. Gonzalez, H. Tao, K. T. Shanmugam, S.W. York și L. O. Ingram, „Analiza transcriptomului etanogenic Escherichia coli tulpini: toleranță la etanol”, în Lucrările celei de-a 225-a întâlniri naționale ACS, p. U200, New Orleans, La, SUA, martie 2003. Vizualizare la: Google Scholar
  151. E. N. Miller, L. R. Jarboe, P. C. Turner și colab., „Furfural inhibă creșterea prin limitarea asimilației sulfului în etanogenic Escherichia coli tulpina LY180,” Microbiologie aplicată și de mediu, vol. 75, nr. 19, pp. 6132–6141, 2009. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  152. L. M. Tran, M. L. Rizk și J. C. Liao, „Modelarea ansamblului rețelelor metabolice”, Jurnalul Biofizic, vol. 95, nr. 12, pp. 5606–5617, 2008. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  153. P. D. Schloss și J. Handelsman, „Perspective biotehnologice din metagenomică”, Opinie actuală în biotehnologie, vol. 14, nr. 3, pp. 303–310, 2003. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  154. L. Jiang, E. A. Althoff, F. R. Clemente și colab., „De novo computational design of retro-aldol enzymes,” Ştiinţă, vol. 319, nr. 5868, pp. 1387–1391, 2008. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  155. V. Hatzimanikatis, C. Li, J. A. Ionita, C. S. Henry, M. D. Jankowski și L. Broadbelt, „Exploring the diversity of complex metabolic networks,” Bioinformatica, vol. 21, nr. 8, p. 1603–1609, 2005.Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic

Drepturi de autor

Copyright © 2010 Laura R. Jarboe et al. Acesta este un articol cu ​​acces deschis distribuit sub Licența de Atribuire Creative Commons, care permite utilizarea, distribuirea și reproducerea fără restricții pe orice mediu, cu condiția ca lucrarea originală să fie citată corespunzător.


Tehnici viitoare de control al înălțimii

Condiționare mecanică. Se știe de mult timp că solicitările mecanice precum periajul repetat, scuturarea sau îndoirea cauzate de mișcarea aerului sau contactul cu obiecte animate sau neînsuflețite pot reduce creșterea plantelor. Cercetări recente efectuate de Dr. Joyce Latimer de la Universitatea din Georgia au demonstrat potențialul comercial al acestei tehnici pentru controlul înălțimii transplanturilor de legume, în special de roșii. Această activitate a fost stimulată, parțial, de faptul că B- Nine nu mai este înregistrată pentru utilizare pe culturi comestibile. Un sistem de condiționare mecanică adaptat serelor comerciale implică trasarea unei bare peste

Figura 2. Creșterea gălbenelelor este afectată de momentul în care îngrășământul este reținut pentru perioade scurte în momente diferite în timpul culturii.

vârfurile plantelor o dată sau de două ori pe zi. Bara este setată suficient de jos pentru a intra în contact cu plantele, dar nu atât de jos încât plantele să fie rănite sau smulse. Cu acest sistem au fost raportate reduceri de înălțime cu 30 până la 40%. Alte sisteme implică agitare periodică, tratamente cu aer cu suflare sau pulverizări de apă. Pentru ca acest lucru să devină util cultivatorilor de flori este nevoie de cercetare pentru a determina răspunsul culturilor de flori.

Filtre de lumină. Fiziologii plantelor au descoperit că schimbarea raportului dintre lumina roșie și roșie îndepărtată poate influența alungirea și ramificarea tulpinii. Lumina roșie inhibă alungirea tulpinii în comparație cu lumina roșie îndepărtată care promovează alungirea tulpinii. Lumina roșie promovează, de asemenea, ramificarea prin stimularea creșterii mugurilor laterali. În natură există schimbări zilnice și sezoniere ale raportului roșu:depărtat-roșu. Lumina naturală în mijlocul zilei și vara are o proporție mai mare de roșu decât răsăritul și apusul soarelui și iarna. Efectul de umbrire al copertinelor plantelor modifică, de asemenea, raportul crescând proporția de lumină roșie îndepărtată. Acesta este un factor important de ce plantele se întind atunci când sunt distanțate prea aproape. Cercetările actuale sunt îndreptate spre dezvoltarea acoperirilor de seră care modifică echilibrul roșu:depărtat roșu pentru a controla înălțimea și ramificarea plantelor.


De ce este de dorit să cuplați producția chimică cu creșterea? - Biologie

Ființele vii cresc și se reproduc. Creșterea este o modalitate de a genera materiale pentru reproducere. Reproducerea este o modalitate de a face noi organisme care pot crește. Astfel, „obiectivul” aparent al fiecărui organism este să umple lumea disponibilă cu urmașii ei, adică cu „sinele”. S-a sugerat că fiecare unitate de moștenire în sine, fiecare genă, este egoistă în acest fel. Acționează în așa fel încât să-și mărească șansele de răspândire la toți indivizii disponibili ai unei populații. Dacă alte gene sunt utile în acest sens, bine. Dacă nu, nu colabora.

Uniunea fără minte către expansiune care este semnul distinctiv al viețuitoarelor este un program inventat devreme în istoria vieții. S-a dovedit un mare succes. (A fost reinventat de piața liberă ca un program de succes pentru organizațiile care trăiesc în lumea economică.) Scopul programului nu poate fi atins niciodată, deoarece organismele depind unele de altele pentru existența lor. Astfel, există un „feedback negativ” asupra creșterii fiecărui organism care menține lucrurile în echilibru, într-un fel. Oamenii, în ultimul timp, au avut succes în special în evitarea sau neutralizarea feedback-ului negativ asupra creșterii populației (cum ar fi boala sau lipsa hranei). Drept urmare, ei au descoperit că mediul își pierde proprietățile dorite pe măsură ce este plin de oameni și că resursele devin rare. Această descoperire a dat naștere noțiunii de „dezvoltare durabilă”, care poate fi tradusă ca „creștere fără consecințe negative”. Rămâne de văzut dacă impulsul fără minte spre expansiune pe care îl împărtășim cu toate celelalte organisme poate fi verificat prin feedback intern inteligent înainte de a fi oprit de lipsa resurselor.

Toată creșterea depinde de însuşirea materiei exterioare, adică de „mâncare” într-un fel. Ecologiștii au clasificat diferitele moduri în care organismele mănâncă (toate în greacă, pentru stil):

Organismele care mănâncă pe alții (alți mâncători) sunt numite „heterotrofe”. Dacă acest lucru se întâmplă într-un mediu oxigenat și oxigenul este folosit pentru a „arde” alimentele, vorbim de „respirație aerobă”. Noi, oamenii, suntem heterotrofe și folosim respirația aerobă pentru a ne menține corpul. (Respirăm oxigen și dioxid de carbon afară.) Alți heterotrofe pot folosi respirația anaerobă pentru a procesa alimente (eliberează oxigenul din molecule precum nitrat sau sulfat) sau pot folosi fermentația (toacă moleculele organice și rearanjează părțile, la fel ca drojdia). Organismele care se hrănesc folosind lumina soarelui pentru a construi materie organică nouă (auto-hrănitori) se numesc foto-autotrofe. În mod normal, oxigenul este produs atunci când se face acest lucru ("fotosinteză oxigenată"), așa cum este descris de ecuația fotosintetică. Un al treilea mod de a-ți câștiga existența, în afară de a mânca pe alții sau de a te hrăni folosind lumina soarelui, este folosirea gradienților chimici ca sursă de energie pentru sinteză (mai degrabă decât lumina soarelui). Astfel de organisme sunt numite „chemo-auto-trof”. Toți sunt microbi dintr-o clasă specială de bacterii în sens larg („arhea”) și au adaptări speciale pentru a face față unor medii neobișnuite din punct de vedere chimic (foarte acide, bogate în sulf etc.). Sunt cele care sunt „anaerobe” (adică nu există oxigen molecular disponibil) și cele care sunt „aerobe” (adică folosesc oxigenul molecular disponibil pentru a schimba chimia locală și a produce energie). Printre formele anaerobe se numără, de exemplu, producătorii de metan și sulfuri. (Metanul se formează în intestinele sulfurei de bovine produce mirosul de ou stricat). Printre formele aerobe se numără oxidanții de sulfuri și oxidanții de fier. (Primele produc scurgerile acide din mine. Cele din urmă produc rugina pe rocile umede.)


Te-ai săturat să vezi Buttercup în pășunea ta?

Te-ai săturat să te uiți peste pășunile tale/campurile de fân și să vezi acea „mare de galben” în fiecare primăvară? Unul dintre semnele că primăvara a sosit este când încep să apară florile galbene de ranun, dar în lunile de iarnă are loc creșterea vegetativă a ranunului. Ca buruiană de sezon rece, această plantă înflorește adesea în câmpurile de pășune peste pășuni, cu standuri sărace de furaje de dorit. De fapt, multe câmpuri care au populații dense de ranuncul sunt câmpuri pășunate intens de animale în timpul toamnei până la începutul lunilor de primăvară. Ranunculii sunt uneori clasificați ca plante perene de scurtă durată, dar adesea cresc ca anuale de iarnă.

Buttercup este toxic pentru toate speciile de animale. Toxina protanemonină este eliberată atunci când planta este mestecată sau rănită în alt mod și este prezentă în toate părțile plantei. Animalele care mănâncă ranuncul pot suferi de vezicule ale gurii și părților interne ale tractului gastrointestinal, diaree, colici și, în cazuri severe, moarte. Din fericire, majoritatea animalelor nu vor mânca ranuncul pentru că este negustător. Toxina devine inactivată atunci când este uscată, astfel încât ranuncul nu este o problemă în fân.

Cele mai multe plante de ranuncul ies din semințe în timpul lunilor de toamnă sau de sfârșit de iarnă. Prin urmare, practicile de gestionare a pășunilor care îmbunătățesc și promovează creșterea plantelor dorite în aceste luni este una dintre cele mai bune metode de a ajuta la concurența împotriva apariției și creșterii acestei plante. Cosirea câmpurilor sau tăierea plantelor aproape de pământ la începutul primăverii, înainte ca plantele de ranun să poată produce flori, pot ajuta la reducerea cantității de semințe noi produse, dar cosirea singură nu va elimina total producția de semințe.

Pentru controlul chimic, erbicidele înregistrate pentru utilizare pe pășunile de iarbă care conțin 2,4-D vor controla eficient rancul. În funcție de alte buruieni, se pot utiliza, de asemenea, produse care conțin dicamba+2,4-D (de ex. Weedmaster), aminopiralid (de ex. ForeFront, Milestone), triclopir (de ex. PastureGard, Crossbow) sau metsulfuron (de ex. Cimarron). . Cu toate acestea, leguminoasele, cum ar fi trifoiul intersemănat cu pășunile de iarbă, pot fi grav rănite sau ucise de aceste produse erbicide. Pentru rezultate optime, aplicați un erbicid la începutul primăverii (februarie – aprilie) înainte de observarea florilor, când plantele de ranuncul sunt încă mici și cresc activ. Pentru cea mai bună activitate de erbicid, așteptați până când temperaturile aerului în timpul zilei sunt mai mari de 50 F timp de două până la trei zile consecutive. Când determinați care produs este cel mai bun pentru operațiunea dvs., asigurați-vă că citiți etichetele produselor pentru a afla detalii despre restricțiile privind pășunatul și fânul, deoarece acestea variază foarte mult între aceste produse.

Un program eficient de control al buruienilor este esențial pentru stabilirea și menținerea pășunilor foarte productive și a performanței animalelor. Trebuie să ne amintim că “Un gram de prevenire merită un kilogram de vindecare.” Selectați specii de iarbă și/sau leguminoase bine adaptate, care vor crește și se vor stabili rapid. Acest lucru va minimiza durata de timp pentru care buruienile invadează cu ușurință. Calcarați și fertilizați conform recomandărilor de testare a solului. PH-ul și starea adecvată a nutrienților vor ajuta la asigurarea că furajul va crește rapid și va fi mai competitiv cu buruienile. Gestionați corespunzător pășunatul. Pășunatul excesiv este o cauză comună a problemelor cu buruienile. Presiunea mare de pășunat poate favoriza creșterea buruienilor în detrimentul ierbii. Identificați problemele cu buruienile și locația și selectați opțiunea sau combinația de opțiuni pe care intenționați să utilizați pentru controlul buruienilor (mecanic, chimic sau gestionarea pășunatului), dar cel mai important este să o puneți în practică și să evaluați rezultatul.

Extensia cooperativă de stat Mississippi

Extensia cooperativă din Maryland


Molecula de zaharoză

Click pe imagine pentru a o mari

Figura 1. Zaharoza este produsă din reacția chimică dintre două zaharuri simple numite glucoză și fructoză.

Anthony Fernandez

Click pe imagine pentru a o mari

Figura 2. Model de umplere a spațiului al unei molecule de zaharoză

Shutterstock

Într-un cristal de zahăr, moleculele de zaharoză sunt aranjate într-un model repetat care se extinde în toate cele trei dimensiuni și toate aceste molecule sunt atrase unele de altele de forțe intermoleculare - un tip de interacțiune care leagă moleculele împreună și este mai slabă decât legăturile dintre atomi dintr-o moleculă.

Când adăugați zahăr granulat în apă, unele dintre moleculele de zaharoză încep să se separe unele de altele, deoarece sunt atrase de moleculele de apă (Fig. 3). Când apa și moleculele de zaharoză sunt aproape unele de altele, ele interacționează prin forțe intermoleculare care sunt similare cu forțele intermoleculare dintre moleculele de zaharoză.

Click pe imagine pentru a o mari

Figura 3. Când se adaugă zahăr granulat în apă, acesta se desface deoarece moleculele de apă sunt atrase de moleculele de zaharoză prin forțe intermoleculare. Ca rezultat, fiecare moleculă de zaharoză este înconjurată de molecule de apă și este transportată în soluție.

Procesul de dizolvare implică două etape: în primul rând, moleculele de apă se leagă de moleculele de zaharoză și în al doilea rând, moleculele de apă trage moleculele de zaharoză departe de cristal și în soluție.

În general, doar o anumită cantitate dintr-un solid poate fi dizolvată în apă la un anumit volum și temperatură. Dacă adăugăm mai mult decât această cantitate, nu se va dizolva mai mult din acel solid. În această etapă, spunem că soluția este saturate. Solidul suplimentar cade doar pe fundul recipientului.

De ce este așa? Dacă ai putea vedea moleculele de zaharoză și apă, ai observa că, la început, când adaugi o cantitate mică de zahăr granulat în apă, majoritatea moleculelor de zaharoză părăsesc cristalele de zahăr, trase de molecule de apă. De asemenea, veți observa că unele dintre moleculele de zaharoză dizolvate se cristalizează și ele, adică nu numai că moleculele de zaharoză părăsesc cristalele de zahăr, dar și alte molecule de zaharoză se reunesc cu cristalele de zahăr (Fig. 4). Motivul este că moleculele de zaharoză se mișcă în mod constant în soluție, așa că nimic nu le împiedică pe unele dintre ele să se lege din nou de moleculele de zaharoză din cristalele de zahăr. Cu toate acestea, viteza de dizolvare este mai mare decât viteza de cristalizare - cel puțin până când soluția este saturată - așa că, în general, cristalele de zahăr rămân dizolvate în apă.

Click pe imagine pentru a mari

Figura 4. Când un cristal de zahăr este adăugat la o cană de apă, unele molecule de zaharoză se separă de cristal, în timp ce altele se alătură cristalului. Dacă cristalul se dizolvă în apă sau crește în dimensiune este determinat prin compararea numărului relativ de molecule de zaharoză care se dizolvă și părăsesc cristalul cu numărul de molecule de zaharoză care părăsesc soluția și se unesc cu cristalul.

Pe măsură ce adăugăm mai mult zahăr granulat în soluție, viteza de dizolvare scade și viteza de cristalizare crește, astfel încât la un moment dat, ambele rate sunt egale. Cu alte cuvinte, numărul de molecule de zaharoză plecând cristalele este același cu numărul de molecule de zaharoză alăturarea cristalele. Acesta este ceea ce se întâmplă atunci când soluția este saturată.

Ca urmare, trecut de acel punct, dacă adăugăm mai multe cristale de zahăr, procesul de dizolvare va continua, dar va fi exact echilibrat de procesul de recristalizare. Deci cristalele de zahăr nu se mai pot dizolva în apă. În acest caz, cristalele și soluția sunt în echilibru dinamic. Aceasta înseamnă că dimensiunea cristalelor rămâne aceeași, chiar dacă moleculele de zaharoză schimbă constant locurile între soluție și cristale.

Pentru a face bomboane, am folosit inițial mai mult zahăr decât se putea dizolva în apă la temperatura camerei (trei căni de zahăr pentru o cană de apă). Singura modalitate de a dizolva tot zahărul este să încălziți apa, deoarece creșterea temperaturii face ca mai mult zahăr să se dizolve în apă. Cu alte cuvinte, echilibrul dinamic este afectat de o schimbare a temperaturii. Dacă creștem temperatura, creștem procesul de dizolvare, iar dacă reducem temperatura, scadem procesul de dizolvare.

Procesul de cristalizare este explicat de principiul lui Le Châtelier, care afirmă că un sistem care este deplasat de la echilibru acționează pentru a restabili echilibrul reacționând în opoziție cu schimbarea. Deci o creștere a temperaturii face ca sistemul să scadă energia, în încercarea de a scădea temperatura. Deoarece ruperea legăturilor chimice absoarbe întotdeauna energie, răcește sistemul, astfel încât mai multe molecule de zaharoză se despart și se dizolvă în soluție.

Ce se întâmplă când soluția se răcește? În acest moment, vedem formarea de cristale de zahăr. Acest lucru se explică și prin principiul lui Le Châtelier: o scădere a temperaturii determină un sistem să genereze energie, în încercarea de a crește temperatura. Deoarece formarea de legături chimice eliberează întotdeauna energie, mai multe molecule de zaharoză se vor alătura cristalului în încercarea de a crește temperatura. Aceasta explică de ce se formează cristale atunci când temperatura scade.

Odată ce soluția saturată începe să se răcească, devine suprasaturată. O soluție suprasaturată este instabilă – conține mai multă substanță dizolvată (în acest caz, zahăr) decât poate rămâne în soluție – așa că, pe măsură ce temperatura scade, zahărul iese din soluție, formând cristale. Cu cât temperatura este mai scăzută, cu atât mai multe molecule se alătură cristalelor de zahăr și așa se creează bomboanele rock.


Ce înseamnă pentru investitori?

Dacă faci un pas înapoi și evaluezi fiecare afirmație pe care Intrexon a făcut-o cu privire la platforma sa de fermentare a gazelor, statutul promis al tehnologiei începe să-și piardă din strălucire. Compania face comparații slabe cu tehnologiile existente și nu pare să aibă niciun avantaj real pentru a produce cel puțin trei din cele patru substanțe chimice pe care le dezvoltă în prezent.

Până când compania va ajunge la scară de producție pentru 1,4-BDO și 2,3-BDO -- peste ani -- este probabil ca procesele existente care utilizează fermentația tradițională să fi câștigat deja o cotă de piață semnificativă și să-și reducă costurile de proces mai jos. cel al proceselor petrochimice convenţionale. Alte substanțe chimice din punctul de vedere sunt deja produse în masă la marje sănătoase și nu vin cu riscul tehnic al unui nou proces de fermentare a gazelor. Deci, deși viziunea lui Intrexon sună grozav pe hârtie, există destul de multe obstacole pe care investitorii, managementul și analiștii de pe Wall Street par să treacă cu vederea.


Priveste filmarea: PROGRAMUL TERRA PT Episodul 04 Programul Terra in Egiptul antic - Legea nonhibridarii - partea 1 (Mai 2022).