Informație

Digestie dublă cu enzime de restricție folosind diferite soluții tampon

Digestie dublă cu enzime de restricție folosind diferite soluții tampon



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

În prezent lucrez la pregătirea unei secvențe de 9 kb de ADN pentru digestia de restricție în vectorul de expresie pBAD30. Există foarte puține enzime de restricție care nu au un loc de restricție localizat pe insertul meu și, deoarece folosesc 2 enzime de restricție în digestie, nu am avut de ales în a-mi alege enzimele de restricție. Singurele două enzime de restricție care vor funcționa pentru mine sunt Xmal și KpnI. XmaI folosește tampon CutSmart în timp ce KpnI folosește tampon NEB. Eficiența XmaI în tampon CutSmart este de 100%, în timp ce eficiența KpnI în tampon CutSmart este de 50%. Ar fi mai ușor să efectuați o dublă digestie folosind CutSmart buffer și 2x KpnI decât să efectuați două digestii consecutive?


Din experiența mea, o digestie dublă în tampon CutSmart va funcționa perfect. Reacția poate decurge mai lent, dar incubați-o puțin mai mult și rulați un gel după digestie - veți vedea dacă a funcționat. Ceilalți respondenți, din păcate, nu au menționat asta cel mai bun mod este să verificați singur produsele de restricție pe un gel. Tăiați fragmentul din gelul de care aveți nevoie (și purificați) dacă doriți să evitați plasmida nedigerată. Vedeți dacă dimensiunile fragmentelor de plasmidă corespund locurilor corecte de tăiere. Practică de bază de laborator și durează foarte puțin timp!

Atenție la activitatea stelei - cereți unui tehnician să vă ordoneze fragmentele sau plasmidele pentru a vă asigura că totul merge bine (aceasta este o practică bună de laborator), în cazul în care vedeți benzi neașteptate pe gel care ar putea indica activitate de restricție nedorită. Acest lucru nu este atât de comun, totuși :)


Planificatorul dublu digestie NEB sugerează să utilizați tampon 2.1 pentru combinația dvs. de enzime de restricție (activitate XmaI 50% și KpnI 75%). Aș fi mai îngrijorat de activitatea stea a KpnI în tamponul CutSmart decât de activitatea inferioară. Acesta din urmă poate fi depășit prin prelungirea timpului de reacție sau prin utilizarea mai multor enzime.


Dacă nu ați comandat deja enzima dvs., puteți obține KpnI de înaltă fidelitate, care a fost proiectat pentru utilizare în CutSmart.

De asemenea, puteți lua în considerare efectuarea unei digerări secvențiale mai degrabă decât a unei digestii duble (adică digerați cu o enzimă în tamponul optim, apoi schimbați tamponul pentru digestie cu a doua enzimă). Este mai multă muncă, dar beneficiază de o depanare mai ușoară în cazul în care una dintre enzimele dumneavoastră nu se taie (ceea ce poate apărea frecvent dacă aveți un congelator plin cu enzime vechi de 10 ani).


Digestie dublă cu enzime de restricție folosind diferite soluții tampon - Biologie

Endonucleazele de restricție, cum ar fi EcoRI, recunosc secvențe palindromice specifice și scindează o legătură fosfodiester pe fiecare catenă la acea secvență. După digestia cu o endonuclează de restricție, fragmentele de ADN rezultate pot fi separate prin electroforeză pe gel de agaroză și dimensiunea lor poate fi estimată. O hartă de restricţie este generată prin utilizarea datelor privind dimensiunea fragmentului pentru a determina locaţia secvenţelor specifice de recunoaştere a endonucleazei pe plasmidă.

Fiecare enzimă de restricție necesită condiții de reacție specifice pentru o activitate optimă. Una dintre cele mai importante condiții de reacție care variază între diferitele enzime de restricție este concentrația de sare (de obicei NaCl). Tampoanele enzimatice sunt formulate special pentru a oferi concentrația de sare pentru o activitate enzimatică optimă. Prin urmare, este important ca soluția tampon corectă să fie utilizată pentru o anumită enzimă de restricție.

Mai jos este listată o procedură generală pentru efectuarea rezumatelor de restricții. Rețineți, totuși, că trebuie să consultați întotdeauna recomandările producătorilor privind condițiile optime pentru fiecare enzimă de restricție (Consultați Resurse pentru mai multe informații despre enzimele de restricție).

1. Pentru fiecare digerare, combinați următoarele soluții într-un tub de microcentrifugă.

Articol Cantitate
apă deionizată 6 uL
10x tampon de reacție 1 uL
Plasmid miniprep ADN 3 uL
Total 10 uL
2. Scoateți endonucleaza de restricție (enzimele specifice de utilizat vor fi enumerate pe tabla neagră) din congelator și puneți-o pe gheață. Este important să păstrați enzima la rece. Adăugați 0,5 uL de soluție de enzimă la amestecul pe care l-ați făcut la pasul 1. Dacă digerați cu două enzime de restricție (dublă digerare), adăugați 0,5 uL din a doua enzimă.

3. Atingeți tubul pentru a amesteca conținutul și apoi pulsați în jos tubul într-o microcentrifugă.

4. Se incubează la 37 grade C timp de 2 ore până peste noapte. După incubare, puneți tuburile în congelator.

Primul rezumat al semestrului

Primul dvs. digest de restricție va fi un dublu digest pentru a determina dimensiunea insertului dvs. (ADNc). Un dublu digerare este unul în care două enzime de restricție sunt utilizate pentru a digera ADN-ul într-o singură reacție. În acest caz, veți folosi EcoR I și BamH I. Există doar un singur loc în vectorul plasmidic pentru fiecare dintre aceste enzime și ele sunt situate pe fiecare parte a ADN-ului dumneavoastră inserat.

Digerarea cu ambele va tăia inserția din vector. Săptămâna viitoare veți determina dimensiunea insertului prin separarea ADN-ului digerat pe un gel de agaroză. Inserția poate conține, de asemenea, un loc pentru una sau ambele dintre aceste enzime și, dacă da, insertul va fi tăiat în mai multe bucăți. Adunând dimensiunile fiecărui fragment, puteți determina în continuare dimensiunea insertului.

1. Într-un tub de microcentrifugă puneți 6 uL de apă deionizată, 1 uL de tampon de reacție EcoR I 10x, 3 uL de miniprep plasmid, 0,5 uL de enzimă EcoR I și 0,5 uL de enzimă BamH I. Enzimele și tamponul sunt depozitate în congelator. Tubul cu tampon are un vârf negru. Tubul cu enzima EcoR I are un „E” cu un punct negru în partea de sus, iar tubul cu enzima BamH I are un „B” și un punct maro în partea de sus.

2. Atingeți tubul pentru a amesteca conținutul și apoi pulsați în jos tubul într-o microcentrifugă.

3. Incubați în incubatorul de 37 de grade timp de 1 oră. Fie depozitați-l în congelator, fie pregătiți-l pentru electroforeza pe gel de agaroză.


NheI, EcoRI vector dublu digerare - Problemă obținerea a doua enzimă de tăiat (21.08.2007)

Buna ziua. Sunt nou în clonare și încerc să lighez o inserție de 1,8 kb într-un vector de 5,7 kb (versiunea modificată a pET15b). Încerc să digerez folosind enzimele EcoRI și NheI folosind capete coezive diferite. Dacă uităm de inserție, am probleme la digerarea vectorului. Ambele enzime sunt capabile să taie vectorul eficient, așa cum pot vedea din gelul meu. Cu toate acestea, se pare că nu pot face ca a doua enzimă să se taie. Toate enzimele și tampoanele provin de la NEB. Am încercat rezumate duble, precum și rezumate unice secvențiale folosind două metode:

1. Tăiați vectorul (din Qiagen MiniPrep din celulele DH5A) folosind NheI în tampon EcoRI cu BSA (așa cum este recomandat de NEB pentru digestii duble). Se incubează 37C timp de 2,5 ore. Se inactivează la căldură 65C timp de 20 de minute. Se adaugă EcoRI și se incubează din nou la 37°C timp de 2,5 ore. Adăugați CIP pentru ultima jumătate de oră, păstrând o alicotă ca control fără CIP. Utilizați kitul de curățare Qiagen PCR pentru a curăța proba și apoi configurați ligăturile. Nu am primit colonii la transformarea cu CIP, dar multe colonii fără CIP. Folosesc 1 ul de enzimă în 60 ul de reacție, apoi adaug un al doilea ul la jumătate. Eu folosesc 0,5 ul CIP.

2. Tăiați vectorul folosind EcoRI în tampon EcoRI. Incubați 37C timp de 2,5 ore ca înainte. Utilizați kitul de curățare Qiagen PCR. Se digeră cu NheI, din nou timp de 2,5 ore la 37C, de data aceasta în tamponul NEB 2 cu BSA (recomandat pentru digerări numai cu NheI). Defosforilat cu CIP ca înainte. Curățare cu kit de curățare PCR. Volumele sunt aceleași ca mai sus. Rezultatele transformărilor sunt, de asemenea, aceleași.

Acum, locurile tăiate sunt separate doar de 6 pb (GCTAGC-ATGCAT-GAATTC). NEB spune că NheI ar trebui să poată tăia un vector scindat de EcoRI cu cele două site-uri tăiate la o distanță de 1 bp unul de celălalt pe site-ul lor web. Modul în care interpretez rezultatele transformării este că fiecare enzimă va tăia vectorul prima dată, dar a doua digestie nu funcționează. Ceva idei de ce nu?

În primul rând, aș folosi pur și simplu tamponul NEB 2. Nu mai este nevoie să mai folosim tamponul EcoRI special.

Digerați mai întâi cu NheI, poate timp de 3 ore în tamponul NEB 2 sau 4. Apoi adăugați EcoRI. Nu este nevoie să aveți o etapă intermediară de ucidere a căldurii sau o etapă de purificare. Digerați încă 3 ore.

Aflați cât ADN aveți și defosforilați corespunzător.

Cred că principala cauză a eșecului nu este digerarea, ci defosforilarea. Defosforilarea excesivă va deteriora capetele ADN-ului și va face vectorul neligabil. 30 de minute sunt mult prea lungi (cu excepția cazului în care aveți o mulțime de ADN). Cât vector ești dephos?

regula degetului mare este
1pmol ADN, este defosforilat prin 0,1U CIP în 60 de minute la 37 Celsius într-un volum de 50ul.

NEB CIP, este de aproximativ 10U CIP per 1ul. Deci, pentru majoritatea defosforilării, trebuie să fac o diluție cu care să lucrez.

Vă mulțumim pentru răspunsul dumneavoastră. Voi încerca cu mai puțin CIP. Dar ceea ce nu înțeleg este că dacă aceasta este problema și nu digestia, de ce primesc colonii pe placa mea de control care are vectorul dublu digerat fără tratamentul CIP? De aceea am crezut inițial că problema era cu a doua digestie.

câte colonii vezi de pe placa de control? 100 sau 10s. Dacă numărul este scăzut, se tinde să se presupună că enzimele de restricție funcționează. În plus, enzimele pe care le utilizați sunt enzime bune, se comportă bine. Deci ochiul suspiciunii tinde să cadă ultimul asupra lor.

De obicei, ajung în intervalul 40-50. Aproximativ la fel ca și controlul de ligatură cu un singur diger (tăiat cu o enzimă, apoi ligați). Când am încercat să lig inserția, am recuperat și vectorul original în care încerc să introduc inserția.

1. Este dificil să vezi care dintre enzime nu funcționează dacă aveți doar o diferență de 6 pb, așa că trebuie să vă asigurați că ambele enzime funcționează - adică digerați vectorul cu fiecare enzimă separat, apoi rulați un gel.

2. Dacă ambele enzime funcționează, atunci în mod evident digestiul tău dublu nu funcționează. O posibilă problemă ar putea fi aceea că concentrația de glicerol a enzimelor este prea mare în digerul tău, nu ar trebui să fie niciodată mai mare de 10%.

3. Sunteți sigur că aveți 6 bp între locurile de tăiere? Nu vă bazați pe ceea ce spun oamenii care v-au dat vectorul, cu excepția cazului în care este o plasmidă cumpărată de o companie. Trebuie să aveți secvența reală, așa că faceți o secvențiere.

4. Dacă sunteți sigur că există 6 pb și ambele enzime funcționează separat, atunci trebuie să luați în considerare că enzimele nu lucrează împreună, indiferent de ceea ce spune NEB. Atunci ar trebui să luați în considerare utilizarea altor site-uri de tăiere sau poate clonarea cu primer PCR sau subclonarea unei mici inserții într-unul dintre site-uri, astfel încât veți avea mai mult de 6 bp între site-uri.

Am încercat din nou folosind un lot diferit de celule competente și acum obțin 100 de colonii pe placa de dublă digestie fără defosforilare CIP și numere similare cu controlul EcoRI-digestie/religare.

Am verificat că ambele enzime digeră vectorul nedigerat individual pe un gel. Ambele pot liniiza vectorul. Nu cred că am depășit vreodată concentrația de glicerol de 5%. Am câteva rezultate de secvențiere care au arătat că există șase bp între situsurile de restricție, în concordanță cu secvența care mi-a fost dată. Și știu că fiecare enzimă taie o singură dată din digestia unică, așa cum se arată pe gel. NEB spune că enzimele se scad la un pb una de alta, așa că aș fi surprins dacă nu s-ar putea descurca cu șase, deși în acest moment nu sunt sigur ce altceva ar putea fi.


Activitatea enzimelor de restricție în tampoane PCR

Frecvent, un produs PCR trebuie manipulat în continuare prin scindare cu enzime de restricție. Pentru comoditate, digestia cu enzime de restricție poate fi efectuată direct în amestecul PCR fără nicio purificare a ADN-ului. Acest tabel rezumă activitatea procentuală a enzimelor de restricție asupra ADN-ului Taq, Phusion® sau Q5® PCR amestecuri descrise mai jos.

În aceste reacții, 5 unități de enzimă de restricție au fost incubate la temperatura de reacție adecvată timp de 1 oră într-un amestec PCR care conține 1 microg de ADN și 1 unitate de ADN polimerază într-un volum de reacție de 50 microli cu o concentrație finală de tampon de 1X și suplimentate. cu dNTPs (concentrație finală de 200 µM). Activitatea enzimei a fost analizată prin electroforeză pe gel.

Note: Polimeraza este încă activă și poate modifica capetele fragmentelor de ADN după ce acestea au fost scindate, afectând legarea ulterioară. Primerii care conțin locul de recunoaștere al enzimei de restricție pot acționa ca inhibitori competitivi în reacția de scindare. Utilizarea enzimelor de restricție în condiții non-optime crește probabilitatea activității stelelor. Dacă apar probleme, ADN-ul trebuie purificat utilizând o coloană de centrifugare comercială (recomandăm Monarch PCR & DNA Cleanup Kit, NEB# T1030) sau cu fenol/cloroform urmat de precipitare cu alcool.

*S-a demonstrat că adăugarea unui tampon de enzimă de restricție 1x poate ajuta la îmbunătățirea capacității unor enzime de a scinda.

Legenda diagramei: Clivaj în amestec de extensie cu 5 unități de enzimă:
+++ clivaj complet ++

Enzimă Taq în std Taq Tampon de reacție Taq în tampon de reacție ThermoPol™ Phusion în Phusion HF Buffer Q5 în Q5 tampon* unuTaq în UnuTaq Tampon LongAmp Taq în LongAmp Taq Tampon
AatII § § +++ +++ § ++ § + ++ +++ ++ +++ +++
AclI § +++ +++ § +++ +++ ++ § +++ +++ ++ § § § +++ +++ +++ + +++ § +++ +++ ++ § +++ § +++ - - - + +
AluI § +++ +++ +++ + +++ +++
AlwI § § § +++ +++ § +++ +++ § § +++ +++ +++ ++ ++ +++
ApoI-HF § +++ +++ ++ + +++ +++
AscI § +++ +++ § + +++ + § +++ +++ ++ § +++ +++ +++ § +++ +++ ++ § +++ +++ § +++ +++ +++ § - - ++ § +++ +++ +++ § +++ +++ - § +++ +++ +++ § +++ +++ +++ § +++ +++ ® § - + - - - +
BbvCI § § +++ +++ ++ § § § +++ § - - - - § +++ +++ +++ ++ +++ +++
BclI-HF § +++ +++ - - + +
BcoDI § § § § § § § § § +++ +++ ++ § ++ ++ + § § +++ +++ ++ - § § ++ +++ +++ ++ +++ +++
BsaBI @60°C § § +++ +++ +++ + +++ +++
BsaI-HF®v2 § + + + § +++ +++ ++ § § § +++ +++ ++ § +++ +++ ++ ++ +++ +++
BsgI § § +++ +++ ++ § § ++ +++ +++ ® § - - - - - -
BslI @55°C § +++ +++ +++ ++ +++ +++
BsmAI @55°C § +++ +++ +++ ++ § § § +++ +++ § +++ +++ +++ +++ ++ +++
BspCNI § § § - - § § + § + +++ ++ § § +++ +++ + § § - § § +++ +++ +++ § ++ +++ + § +++ +++ + - +++ +++
BstAPI @60°C § ++ +++ ++ § +++ +++ +++ ++ +++ +++
BstEII @60°C § +++ +++ § + +++ § +++ +++ § +++ +++ § § +++ +++ ® § +++ +++ + - +++ +++
Bsu36I § § § +++ +++ ++ + ++ ++
BtsCI @50°C § +++ +++ § - +++ + - +++ +++
Cac8I § +++ +++ § +++ ++ § § +++ +++ + § - +++ ++ § + +++ +++ + ++ +++
DdeI § +++ +++ + ++ +++ +++
DpnI § § +++ +++ +++ ++ +++ ++
DraI § ++ +++ +++ § + ++ +++ ++ ++ ++
DrdI § ++ +++ +++ § +++ +++ - § +++ + + § + +++ +++ § § ++ +++ § § +++ +++ - § § + + +++ § +++ +++ + § § + + § +++ +++ +++ - + +++
FatI @55°C § ++ ++ +++ § +++ + ++ § +++ +++ § +++ +++ + + +++ +++
FseI § § + § +++ +++ +++ § +++ +++ +++ § +++ § +++ +++ +++ § +++ +++ § ++ +++ + § + +++ § +++ +++ +++ +++ + +++
HinP1I § +++ +++ +++ + +++ +++
HpaI § +++ +++ +++ § + +++ § +++ § + +++ ++ - + ++
HPyCH4III § § ++ +++ § +++ +++ § +++ +++ + § +++ +++ + - § + +++ ++ + +++ +++
Hpy188III § § - +++ +++ § +++ +++ + ++ ++ § ++ ++ ++ - § +++ +++ +++ § +++ +++ ++ + + +
MfeI § ++ +++ § + + - - +++ § +++ + § ++ +++ ++ ++ ++ ++
MluI-HF® § ++ ++ ++ - ++ ++
MlyI § § § +++ +++ + + + +
MscI § § + § +++ +++ + § +++ +++ +++ § +++ +++ +++ § +++ +++ +++ +++ ++ +++
NaeI § § - - ++ § +++ +++ § +++ +++ + § +++ +++ - § ++ § - - + § +++ +++ - § +++ § § § +++ ++ + § ++ +++ § ++ ++ + + ++ ++
NruI-HF® § +++ ++ - - + -
NsiI § +++ +++ +++ + ++ +
NsiI-HF® § +++ +++ +++ ++ +++ +++
NspI § +++ +++ § +++ +++ § +++ +++ § + - - - +++ ++
PCI § + § +++ +++ § + + +++ § + +++ § +++ +++ + § +++ +++ § + - - - + § +++ +++ +++ § +++ +++ § + +++ - - +++ +++
PspGI @75°C § +++ +++ +++ +++ +++ +++
PspOMI § +++ +++ + § +++ +++ ++ § ++ ++ + + § ++ +++ ++ § § +++ +++ +++ § +++ +++ + § ++ + - - § +++ +++ ++ § § +++ +++ + § +++ +++ § +++ +++ +++ § § +++ + +++ § § +++ +++ § § § + + - - § + + § +++ +++ +++ +++ +++ +++
SexAI § +++ +++ +++ § - - ++ § +++ +++ § § +++ +++ +++ § § § § +++ § +++ +++ § +++ +++ § +++ +++ ++ + § +++ +++ + § + § ++ ++ + § +++ +++ § § ++ + § § +++ +++ + § § +++ +++ +++ +++ +++ +++
Tsp45I @65°C § § +++ +++ + § + + § +++ +++ ++ § +++ +++ § +++ +++ + § § +++ +++ + § +++ +++ § +++ +++
§ Este disponibilă o versiune HF a acestei enzime.

Phusion® a fost dezvoltat de Finnzymes Oy, acum parte a Thermo Fisher Scientific. Acest produs este fabricat de New England Biolabs, Inc. în acord cu și în conformitate cu specificațiile de performanță ale Thermo Fisher Scientific.
Phusion® este o marcă înregistrată a Thermo Fisher Scientific.
ThermoPol&trade este o marcă comercială a New England Biolabs, Inc.


Digestie dublă cu enzime de restricție folosind diferite soluții tampon - Biologie

BISC411
BIOLOGIA MOLECULARĂ EXPERIMENTALĂ A CELULEI

Informații de bază despre cartografierea enzimelor de restricție și exerciții/întrebări cu creion

Plasmidele sunt molecule de ADN dublu catenar, extracromozomiale, auto-replicabile. Majoritatea plasmidelor există ca molecule supercoilate (CCC = ADN circular închis covalent). Deși mici, plasmidele codifică o serie de produse genetice importante. Unele pot conferi fenotipuri selectabile celulelor lor receptoare, cum ar fi rezistența la anumite antibiotice sau metale grele, care indică faptul că celula a fost transfectată cu ADN plasmid. Alte gene plasmide sunt esențiale pentru a menține numărul de copii (numărul de molecule de ADN plasmidic per celulă) sau pentru a furniza secvențe de origine care funcționează în inițierea replicării ADN-ului plasmidic. În general, replicarea plasmidei și expresia genei depind în totalitate de factorii gazdă preexistenți necesari pentru a promova aceste procese. Se spune că multe plasmide sunt criptice dacă nu exprimă fenotipuri selectabile în celule. Astfel de plasmide sunt, în general, inutile ca vehicule de donare, deoarece transfecția plasmidelor nu este ușor de testat.

Deși au fost descoperite inițial la procariote, mai multe plasmide au fost izolate sau construite pentru a funcționa în celulele eucariote inferioare, cum ar fi drojdia și în unele plante. În plus, așa-numitele plasmide navetă sau bifuncționale au fost construite astfel încât să se poată replica în mai mult de o specie de bacterii. Pentru a fi utile ca vehicul de donare pentru amplificarea genelor străine inserate, plasmidele ar trebui să aibă greutate moleculară mică, să aibă fenotipuri selectabile și un număr de situsuri unice de tăiere a nucleazei de restricție.

În partea I a acestui experiment, veți izola două plasmide din culturi de celule bacteriene. Plasmidele pe care le veți izola se numesc plasmide de expresie. Aceasta înseamnă că au fost construite astfel încât, atunci când sunt introduse în celulele bacteriene în condiții adecvate, gena inserată să poată fi transcrisă și tradusă de către celule și să genereze proteina codificată de gena inserată. Proteina pe care o vei genera este liozima T4. Plasmida de expresie a fost construită prin inserarea cADN-ului (ADN complementar, care conține numai secvențele de ADN complementare cu ARNm al genei) al lizozimei T4 în aval de un promotor în plasmidă care este inductibil de o substanță chimică numită IPTG. Când IPTG este prezent în cultură, transcipția ADNc-ului este inițiată de la promotor și ARNm este produs și ulterior tradus în proteina lizozimă T4. Cele două tipuri de plasmide pe care le veți utiliza și analiza vor fi discutate amănunțit cu dvs. în pregătirea pentru laboratoare.

Veți face partea I a acestui experiment în Laboratorul 3. Partea 1 constă în spargerea celulelor bacteriene și extragerea și purificarea ADN-urilor plasmide. În timpul Laboratorului 5, veți scinda ADN-urile plasmide cu enzime de restricție și veți separa fragmentele de ADN produse pe gelurile de agaroză. Examinând modelul și dimensiunile acestor fragmente de ADN, veți putea determina care plasmidă este care.

Digestia cu endonuclează de restricție a ADN-ului a fost extrem de utilă în caracterizarea acestor molecule, deoarece ADN-ul poate fi defalcat la dimensiuni gestionabile folosindu-le. Deoarece aceste enzime recunosc o secvență specifică de nucleotide în ADN, aceeași enzimă va produce întotdeauna aceleași fragmente dintr-un anumit ADN. De obicei, primul pas în analiza unui ADN nou este construirea unei hărți de endonuclează de restricție folosind inițial o enzimă, dar în cele din urmă folosind mai multe. Pentru a construi această hartă, este necesar să se determine dimensiunile tuturor fragmentelor de ADN generate de enzime prin electroforeză pe gel de agaroză. O hartă care arată pozițiile în care endonucleaza taie ADN-ul poate fi creată prin ordonarea fragmentelor pe ADN.

pH-ul tamponului de electroforeză utilizat în rularea gelului de agaroză este de 7,5, prin urmare, toate fragmentele de ADN vor avea o sarcină negativă și vor migra către electrodul pozitiv. Cu cât dimensiunea fragmentului de ADN este mai mică, cu atât se va mișca mai repede prin porii agarozei. Veți descoperi că migrarea în timpul electroforezei este proporțională cu inversul logaritmului greutății moleculare (adică distanța de migrare = K/log MW unde K este o constantă pentru fiecare condiție de gel). Fragmentele de ADN sunt ușor de vizualizat în timpul electroforezei prin includerea bromură de etidio (EtBr) în gel. EtBr se interchelază între ADN-ul dublu catenar și, în consecință, are fluorescență puternică atunci când este iluminat cu lumină UV. Deși nu vom face acest lucru, o modalitate de a ordona fragmentele este de a digera ADN-ul doar parțial, astfel încât să nu fie utilizate toate site-urile potențiale de clivaj. Fragmentele „parțiale” sunt apoi izolate, redigerate complet cu aceeași enzimă și fragmentele rezultate sunt analizate din nou prin electroforeză pe gel. Dacă „parțialele” se suprapun, va fi produsă o hartă. O altă modalitate de a ordona fragmentele este de a digera complet ADN-ul separat cu două enzime diferite. Fiecare fragment limită este apoi scindat cu cealaltă endonuclează și fragmentele rezultate sunt analizate din nou. Alternativ, puteți include ambele enzime în aceeași digestie și puteți compara dispariția sau apariția benzilor pentru a deduce modelele de tăiere (vom folosi această abordare). Ca exercițiu pentru creion, utilizați următoarele date pentru a ordona fragmentele generate într-un experiment virtual și pentru a produce o hartă de restricții.

O soluție de ADN al virusului B (moleculă liniară dublu catenară) a fost complet digerată cu EcoRI. Un gel de agaroză din acest digerat de restricție prezintă următoarele fragmente limită: Un fragment limită este ceea ce este generat atunci când ADN-ul este tăiat la toate situsurile sale EcoRI.

Fig. 1. Gelul de agaroză din digerarea EcoRI a ADN-ului virusului B. În mod convenabil, dimensiunile acestor fragmente au fost determinate de utilizarea markerilor Lambda Hind III - datele nu sunt afișate.)

Fiecare dintre aceste fragmente a fost eluat din gel și redigerat cu Taq I.
Au fost produse următoarele modele:

____ 7,1 Kb
____ 5,0 Kb
____ 2,9 Kb
____ 1,5 Kb ____ 2,3 Kb

Figura 2 Figura 3 Figura 4

Fig 2. Gel de agaroză al fragmentelor Taq I din fragmentul EcoRI de 8,6 Kb al ADN-ului virusului B

Fig 3. Gel de agaroză al fragmentelor Taq I din fragmentul EcoRI de 7,9 Kb al ADN-ului virusului B

Fig 4. Gel de agaroză al fragmentelor Taq I din fragmentul EcoRI de 2,3 Kb al ADN-ului virusului B

În plus, s-a făcut o digerare Taq I pe ADN-ul viral intact, dând naștere la următoarele fragmente limită:

Fig 5. Gel de agaroză al fragmentelor Taq I ale ADN-ului virusului B

1. Folosind datele prezentate mai sus, construiți o hartă de restricții care să arate locațiile tuturor siturilor Taq I și EcoRI și care indică distanțele (în Kb) dintre ele. Amintiți-vă că benzile prezentate reprezintă dimensiunile bucăților de ADN realizate după tăierea ADN-ului cu o endonuclează de restricție.

2. Pentru acest experiment, veți face mai multe digestii duble. Gândiți-vă la modul în care aceasta diferă de tehnica descrisă mai sus. Diagramați un gel al fragmentelor de restricție care ar rezulta dintr-o digestie dublă folosind TaqI/EcoRI al ADN-ului virusului B. Care credeți că sunt avantajele sau dezavantajele fiecărei tehnici?

3. Cum se compară aceste abordări (digerare dublă, digerare limitată/eluție/redigestie cu o enzimă diferită) cu digerările parțiale?

4. Multe molecule de ADN virale și bacteriene sunt mai degrabă circulare decât liniare. Cum ar influența acest lucru gradul de dificultate experimentat în construirea unei hărți de restricții? În scopuri ilustrative, schimbați molecula noastră liniară de ADN a virusului B într-o moleculă circulară prin legarea capetelor. Ce se întâmplă cu diferitele modele de fragmente generate? Afișați folosind modele de gel și o hartă de restricții. (Presupunem că ligatura nu generează un site Taq I sau EcoRI.)


Digestie dublă cu enzime de restricție folosind diferite tampoane - Biologie

Exemple de enzime de restricție de clasa II

din
Haemophilus aegytius

din
Haemophilus influenzae Rd

Enzimele de restricție sunt obținute de la multe procariote și au fost izolate aproximativ 1500 de enzime cu situsuri de recunoaștere a secvenței cunoscute. Numirea acestor endonucleaze urmează un sistem propus de Nathans și Smith. Fiecare nume conține cel puțin o literă mare și două litere mici urmate de o cifră romană. Literele sunt inițiale ale genului și speciei de origine, iar numărul reprezintă numărul de enzime descoperite în organism. (În mod istoric, cifra a identificat vârful proteinei în care enzima a eluat în timpul cromatografiei.) Informații suplimentare pot fi adăugate sub formă de literă. Pentru Eco RI, R indică tulpina particulară de E. coli.

Enzimele de restricție din diferite organisme pot recunoaște aceeași secvență de ADN. Dacă enzimele recunosc același loc și se scindează în aceeași poziție, ele sunt etichetate izoschizomerii. Cele care recunosc același site, dar se desprind în poziții diferite sunt heteroschizomeri sau neoschizomeri.

Exemplu de izoschizomer

din
Streptomyces phaeochromogenes

din
Bacillus sp. Bu 17091

Exemplu de heteroizoschizomer sau neoschizomer

din
rom Xanthomonas malvacea

Izo- sau heteroizomerii adaugă flexibilitate designului experimental. Costul, sensibilitățile de metilare și tipurile de „capete” sunt considerații, precum și condiții tampon pentru o activitate optimă.

Câteva condiții tampon se potrivesc aproape tuturor enzimelor de restricție, dar niciun tampon nu permite activitatea fiecărei enzime. Furnizorii de enzime oferă întotdeauna un tampon de reacție (10x concentrat) care este optim pentru enzimă. Componentele tamponului 1x sunt de obicei 10-100 mM Tris la pH 7,3 până la 8,5, diferite niveluri de săruri precum KCI și NaCI (10 până la 150 mM), 10 mM Mg(2+), 2 mM beta-mercaptoetanol. Uneori, 0,01% Triton-X100 (un detergent) și albumină serică bovină sunt incluse ca stabilizatori. (Ca alternativă, gelatina din piele de porc poate fi utilizată și oferă avantajele că este stabilă la autoclavare și costă aproximativ 1/15 cât BSA.)

Deoarece enzimele de restricție pot necesita condiții tampon diferite, trebuie utilizată o anumită strategie pentru a face digerări duble. Metoda preferată este digerarea simultană cu ambele enzime într-un tampon compatibil. Această metodă poate fi utilizată chiar dacă o enzimă nu este complet activă (de exemplu, 75% activă). Se pot adăuga mai multe enzime (de exemplu, 1 U de enzimă A + 1,33 U de enzimă B) pentru o eficiență egală de tăiere. Există limite ale excesului de enzime din cauza creșterii glicerolului în reacție care poate reduce specificitatea unor enzime.

O metodă alternativă este de a digera cu enzima „sare scăzută”, apoi adăugați mai mult tampon și enzima „cu conținut ridicat de sare” pentru a finaliza digestia. Acest lucru, evident, dublează timpul necesar digestiei. În cazuri extreme, ADN-ul poate fi precipitat după o digestie și dizolvat în al doilea tampon de digerare. Digerările se efectuează la 37 de grade C, dacă nu se specifică altfel pentru enzimă.

Clivarea cu specificitate nespecifică sau relaxată sau activitatea „stea” poate apărea dacă sunt utilizate condiții neoptimale. Condițiile care încurajează activitatea vedetă includ:


Digestia ADN-ului bacteriofag lambda folosind o enzimă de restricție

Digestia ADN-ului bacteriofag lambda folosind o enzimă de restricție.

2. Introducere :

Enzimele de restricție au fost descrise în capitolul 3 al acestui manual. Sunt endonucleaze care recunosc și scindează secvențele de ADN specifice numite situsuri de restricție, de exemplu, £coRI (izolat din Escherichia coli) care recunoaște și scindează secvența 5′-GAATTC-3′ pentru a genera capete coezive sau lipicioase.

În mod similar, Hind III izolat din Haemophilus influenzae recunoaște și scindează secvențele 5′-AAGCTT-3′ pentru a genera capete coezive sau lipicioase.

Activitatea enzimatică este reprezentată ca UI (Unitate Internațională). O unitate a unei enzime de restricție este cantitatea de enzimă necesară pentru a digera complet un microgram de ADN lambda [într-un volum de reacție de 50 pi într-o oră în condiții optime de sare, pH și temperatură (aproximativ 37°C pentru majoritatea enzimelor de restricție) ].

3. Principiu :

ADN-ul fag lambda (λ) este o moleculă de ADN dublu catenară care conține 48.502 perechi de baze (bp). ADN-ul său devine circularizat după eliberare (în interiorul celulei E. coli) într-un loc coeziv numit sit COS. Conține cinci locuri de recunoaștere pentru EcoRI și șapte locuri de recunoaștere pentru HindIII.

Digestia completă a ADN-ului lambda cu EcoRI are ca rezultat șase fragmente de ADN cu lungimea de 21, 226, 7421, 5804, 4878 și 3530 bp. În mod similar, o digestia completă a ADN-ului lambda cu Hindllll are ca rezultat opt ​​fragmente de ADN, adică 23, 130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564, 125 bp fragmente lungi.

4. Cerințe :

i. Lambda ADN, enzimă de restricție cum ar fi ZscoRI sau HindIII

ii. Tampon de testare pentru enzimă de restricție, apă sterilizată, vârfuri, tuburi Eppendorf, micropipete

iii. Aparat de electroforeză cu gel de agaroză

5. Procedura

(i) Păstrați întotdeauna enzima de restricție (EcoRI sau HindIII), substratul (X ADN) și tamponul de analiză într-o găleată cu gheață.

(ii) Luați 2-5 pg de ADN lambda ca substrat într-un tub eppendorf și dizolvați într-un volum adecvat de apă.

(iii) Adăugați 2 pi de tampon de testare aproximativ 10X (disponibil cu enzima de restricție) la ADN-ul din tubul eppendorf, urmat de enzima respectivă (5-12 unități de EcoRI sau 10-25 de unități de HindIII, în funcție de cantitatea de ADN utilizat în etapa de reacție (ii).

(iv) Se adaugă apă sterilizată pentru a face volumul final al amestecului de reacție la 20 pi. Centrifugați ușor sau amestecați atingând cu degetele.

(v) Se incubează amestecul de reacție timp de 1 oră la 37°C într-o baie de apă sau într-un incubator.

(vi) Așa cum este descris în experimentul de izolare a plasmidei, între timp se prepară gel de agaroză 1% pentru încărcare și electroforeză.

O singură bandă este văzută pe banda în care a fost încărcată proba ‘B’ (A, ADN). În timp ce a doua bandă în care a fost încărcat eșantionul ‘A’ arată mai multe benzi. Aceasta dezvăluie scindarea probei ‘B’ de către enzimele de restricție respective.

Numărul exact și dimensiunea benzilor obținute depind de enzimele de restricție utilizate pentru digerarea ADN-ului lambda (probă ‘B’). După cum sa explicat mai devreme, se observă 6 fragmente de ADN dacă se utilizează £coRI și se observă 8 fragmente de ADN după utilizarea Hindi I).


Americi

Site-ul va fi afișat în limba engleză.

Folosim aceste cookie-uri pentru a ne asigura că site-ul nostru funcționează în siguranță și în mod corespunzător, acestea sunt necesare pentru ca serviciile noastre să funcționeze și nu pot fi dezactivate în sistemele noastre. De obicei, acestea sunt setate doar ca răspuns la acțiunile efectuate de dvs. care reprezintă o solicitare de servicii, cum ar fi autentificarea, utilizarea unui coș de cumpărături sau completarea formularelor. Puteți seta browserul să vă blocheze sau să vă avertizeze despre aceste cookie-uri, dar unele părți ale serviciilor noastre nu vor funcționa fără ele. La fel ca și celelalte cookie-uri pe care le folosim, cookie-urile strict necesare pot fi fie cookie-uri primare, fie cookie-uri terțe.

Folosim aceste cookie-uri pentru a vă aminti setările și preferințele. De exemplu, este posibil să folosim aceste module cookie pentru a vă aminti preferințele de limbă.
Permite module cookie de preferință

Folosim aceste cookie-uri pentru a colecta informații despre modul în care interacționați cu serviciile noastre și pentru a ne ajuta să le măsurăm și să le îmbunătățim. De exemplu, putem folosi aceste cookie-uri pentru a determina dacă ați interacționat cu o anumită pagină.
Permite cookie-uri de performanță/statistică

Noi și partenerii noștri de publicitate folosim aceste module cookie pentru a furniza reclame, pentru a le face mai relevante și mai semnificative pentru dvs. și pentru a urmări eficiența campaniilor noastre de publicitate, atât pe serviciile noastre, cât și pe alte site-uri web și rețele sociale.
Permite cookie-uri de marketing


Digestie dublă cu enzime de restricție folosind diferite soluții tampon - Biologie

Digestia cu enzime de restricție a devenit o metodă de rutină a biologiei moleculare în urmă cu 2 decenii. Până în prezent, cercetările folosesc enzime de restricție pentru clonare, analiza secvențelor genomice și metilarea ADN-ului. Aici ofer o scurtă prezentare generală a utilizării enzimelor de restricție și câteva sfaturi din experiența mea practică.

Furnizori de enzime de restricție

În prezent, există multe companii diferite care furnizează o mare varietate de enzime de restricție. Am o experiență cu Roche, NEB, Fermentas și Gibco. Toate enzimele pe care le-am încercat sunt de o calitate suficientă, prin urmare decizia mea finală se bazează pe prețul unitar al enzimelor. Momentan majoritatea enzimelor pe care le folosim sunt de la MBI Fermentas. Unele rare sunt de la NEB. Este important de menționat că sistemul tampon NEB este compatibil cu cel al Fermentas.

Digestia ADN-ului cu o singură enzimă

Dacă vrei să digerezi ADN plasmidic cu o enzimă decât protocolul obișnuit va arăta astfel:

ADN până la 1 µg
Buffer (10x) 2 µl
Enzimă (10U/µl) 1 µl
H2O la 20 µli

Pentru a pregăti această reacție, pipetați mai întâi ADN, tampon și apă, amestecați în vortex și adăugați enzima. Se amestecă prin pipetare și se incubează cel puțin 40 de minute la temperatura optimă pentru enzimă (rețineți că majoritatea, dar nu toate enzimele funcționează la 37°C).

Dacă vrei să digerezi ADN genomic, testul tău va arăta oarecum diferit. Două lucruri sunt importante. 1) de obicei, trebuie să digerați mai mult ADN, prin urmare trebuie să vă setați reacția într-un volum mai mare (5-10 µg în 100 µli volum final) și 2) veți avea nevoie de mai mult timp pentru digestia completă (poate fi chiar și 18 ore). ). Reacția tipică pe care am folosit-o pentru a digera ADN-ul genomic uman pentru Southern blot a fost

ADN 10 µg
Buffer (10x) 10 µl
Enzyme (10U/µl) 5 µl
H2O to 100 µl

I incubate such reaction overnight at optimal temperature. Note, that it is better to use an incubator instead of a heating block, since in the block you will have condensation of water on the lid of your tube and this will destroy the reaction. If DNA has to be digested for bisulphite treatment I incubate the samples for a shorter time, since usually I don&rsquot need a complete digestion in this case.

Digestion of DNA with 2 or more different enzymes

In the case of double or triple digestion you have 2 possibilities

Use simultaneous digestion

If you can find a buffer in which all enzymes have sufficient activity (usually not lower than 50%), you can set your digestion will all enzymes simultaneously. It is important that the total volume of enzymes you add to your reaction is not more than 1/10 of the total reaction volume. The reason for this is that some enzymes have star activity if the concentration of glycerol in the reaction exceeds 5%.

For plasmid DNA your digestion reaction will look like this

ADN up to 1 µg
Buffer (10x) 2 µl
Enzyme 1 (10U/µl) 1 µl
Enzyme 2 (10U/µl) 1 µl
H2O to 20 µl

If you do not have a buffer in which all your enzymes function properly you will have to make a buffer exchange. This can be done in several different ways.

The most trivial way is to digest your DNA with one enzyme, then purify it with any kit for purification of DNA out of gel slice and set a reaction with the second enzyme. However in this case you have some losses of your DNA and as well you consume (probably unnecessary) purification reagents.

You can perform you double digestion sequentially using buffer adjustment. This is possible when your first enzyme (enzyme I) functions in a low salt buffer (buffer B from Fermentas, for example) and the second one (enzyme II) functions in a high salt buffer (buffer R or O from Fermentas). In this case you first set a reaction with enzyme I in a smallest possible volume.

ADN 1 µl
Buffer B 1 µl
Enzyme I 1 µl
H2O 7 µl

You perform the digestion for 1 h and then inactivate your enzyme (check in the table, usually 65°C for 10-15 min). Then you set a second step reaction as follows

Reaction 1 10 µl
Buffer R 5 µl
Enzyme II 1 µl
H2O 34 µl

Perform your digestion for 1 h and analyze the result on a gel.

Below is the table that shows you what happens in your reaction tube. As you can see, there is some increase in concentrations in final reaction, but this does not influence the activity of the enzyme.


Prezentare generală experimentală

Procedurile de astăzi implică izolarea ADN-ului plasmidic și digerarea ADN-ului cu enzime de restricție. Asigurați-vă că utilizați pipeta potrivită și setați corect volumul și dacă nu sunteți sigur, apoi întrebați. Înregistrați toate procedurile și datele în caietul dumneavoastră de laborator, indicând „cine” a efectuat o anumită etapă a procedurii, în copii ale paginilor caietului la sfârșitul sesiunii de laborator.

NOTĂ SPECIALĂ: Înregistrați suficiente detalii despre procedură în caietul dvs. în timpul laboratorului de astăzi, astfel încât să puteți repeta aceste proceduri folosind caietul dvs. ca SINGUR resursă. Scrieți metodele în al tau cuvinte (adică, nu doar &ldquocopiați&rdquo pașii din paginile web sau fișe).

DETALII SUPLIMENTARE: pentru fiecare centrifugare, timp de înregistrare, rcf (# x g) și temperatura din laboratorul dvs. NB TOATE centrifugările efectuate în microcentrifuge sunt la &ldquo temperatura camerei&rdquo (indicați ca atare, dar nu trebuie să raportați în grade C)

A) ADN plasmid mini prep

  • Eliminarea deșeurilor: aruncați supernatantul bacterian și colectați vârfurile contaminate într-un pahar mic, vom adăuga înălbitor la 10% timp de 10 minute înainte de a arunca la gunoi și la chiuvetă.
  • Puneți tuburile de cultură în punga transparentă pentru riscuri biologice, aceste pungi vor fi autoclavate înainte de a fi plasate la gunoiul menajer.
  • După ce bacteriile sunt lizate, vârfurile, flacoanele și alte materiale trebuie aruncate la gunoiul obișnuit și la chiuvetă.

B) Enzima de restricție (RE) digeră ADN-ul plasmidic

Doar pentru distractie

Am dori să mulțumim New England Biolabs pentru sprijinul generos acordat programului nostru de laborator


Priveste filmarea: Klonowanie in silico (August 2022).