Informație

4.6E: Vezicule de gaz - Biologie

4.6E: Vezicule de gaz - Biologie



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

obiective de invatare

  • Discutați rolul unei vezicule de gaz în ceea ce privește supraviețuirea.

Veziculele de gaz sunt structuri în formă de fus care se găsesc în unele bacterii planctonice care oferă flotabilitate acestor celule prin scăderea densității lor totale de celule. Este nevoie de flotabilitate pozitivă pentru a menține celulele în partea superioară a coloanei de apă, astfel încât să poată continua să efectueze fotosinteza. Sunt alcătuite dintr-o înveliș de proteine ​​care are o suprafață interioară foarte hidrofobă, făcându-l impermeabil la apă (și împiedicând condensarea vaporilor de apă în interior), dar permeabil la majoritatea gazelor. Deoarece vezicula de gaz este un cilindru gol, este susceptibilă să se prăbușească atunci când presiunea din jur devine prea mare.

Selecția naturală a reglat fin structura veziculei de gaz pentru a-și maximiza rezistența la flambaj prin includerea unei proteine ​​de întărire externă, GvpC, mai degrabă ca firul verde dintr-un furtun împletit. Există o relație simplă între diametrul veziculei de gaz și presiunea la care aceasta se va prăbuși - cu cât vezicula de gaz este mai largă, cu atât devine mai slabă. Cu toate acestea, veziculele de gaz mai largi sunt mai eficiente. Ele oferă mai multă flotabilitate pe unitate de proteină decât veziculele înguste de gaz. Diferite specii produc vezicule de gaz de diferite diametre, permițându-le să colonizeze adâncimi diferite ale coloanei de apă (specie cu creștere rapidă, foarte competitivă, cu vezicule largi de gaz în cele mai multe straturi; specii cu creștere lentă, adaptate la întuneric, cu vezicule puternice de gaz înguste în straturile mai profunde). Diametrul veziculei de gaz va ajuta, de asemenea, la determinarea speciilor care supraviețuiesc în diferite corpuri de apă. Lacurile adânci care experimentează amestecul de iarnă vor expune celulele la presiunea hidrostatică generată de coloana de apă plină. Aceasta va selecta pentru speciile cu vezicule de gaz mai înguste și mai puternice.

Puncte cheie

  • Sunt alcătuite dintr-o înveliș de proteine ​​care are o suprafață interioară foarte hidrofobă, făcându-l impermeabil la apă (și împiedicând condensarea vaporilor de apă în interior), dar permeabil la majoritatea gazelor.
  • Selecția naturală a reglat fin structura veziculei de gaz pentru a-și maximiza rezistența la flambaj, inclusiv o proteină de întărire externă, GvpC, mai degrabă ca firul verde dintr-un furtun împletit.
  • Diametrul veziculei de gaz va ajuta, de asemenea, la determinarea speciilor care supraviețuiesc în diferite corpuri de apă.

Măsurarea dimensiunilor veziculelor de gaz prin microscopie electronică

Grant J. Jensen, Divizia de Biologie și Inginerie Biologică, Institutul de Tehnologie din California, Pasadena, CA 91125.

Mikhail G. Shapiro, Divizia de Chimie și Inginerie Chimică, Institutul de Tehnologie din California, Pasadena, CA 91125.

Divizia de Chimie și Inginerie Chimică, California Institute of Technology, Pasadena, California, SUA

Grant J. Jensen, Divizia de Biologie și Inginerie Biologică, Institutul de Tehnologie din California, Pasadena, CA 91125.

Mikhail G. Shapiro, Divizia de Chimie și Inginerie Chimică, Institutul de Tehnologie din California, Pasadena, CA 91125.

Divizia de Chimie și Inginerie Chimică, California Institute of Technology, Pasadena, California, SUA

Divizia de Chimie și Inginerie Chimică, California Institute of Technology, Pasadena, California, SUA

Divizia de Biologie și Inginerie Biologică, California Institute of Technology, Pasadena, California, SUA

Divizia de Biologie și Inginerie Biologică, California Institute of Technology, Pasadena, California, SUA

Beckman Institute, California Institute of Technology, Pasadena, California, SUA

Divizia de Biologie și Inginerie Biologică, Institutul de Tehnologie din California, Pasadena, California, SUA

Divizia de Chimie și Inginerie Chimică, California Institute of Technology, Pasadena, California, SUA

Divizia de Biologie și Inginerie Biologică, Institutul de Tehnologie din California, Pasadena, California, SUA

Departamentul de Chimie și Biochimie, Universitatea Brigham Young, Provo, Utah, SUA

Grant J. Jensen, Divizia de Biologie și Inginerie Biologică, Institutul de Tehnologie din California, Pasadena, CA 91125.

Mikhail G. Shapiro, Divizia de Chimie și Inginerie Chimică, Institutul de Tehnologie din California, Pasadena, CA 91125.

Divizia de Chimie și Inginerie Chimică, California Institute of Technology, Pasadena, California, SUA

Grant J. Jensen, Divizia de Biologie și Inginerie Biologică, Institutul de Tehnologie din California, Pasadena, CA 91125.

Mikhail G. Shapiro, Divizia de Chimie și Inginerie Chimică, Institutul de Tehnologie din California, Pasadena, CA 91125.

Informații de finanțare: Centrul Caltech pentru interacțiuni microbiene de mediu Heritage Medical Research Institute National Institutes of Health, numere de grant/premie: R01-EB018975, R35-GM122588 Packard Fellowship for Science and Engineering Pew Scholarship in the Biomedical Sciences

Abstract

Veziculele de gaz (GV) sunt nanostructuri proteice cilindrice sau în formă de fus umplute cu aer și utilizate pentru flotație de diferite cianobacterii, bacterii heterotrofe și Archaea. Recent, GV-urile au câștigat interes în aplicațiile biotehnologiei datorită capacității lor de a servi ca agenți de imagistică și actuatori pentru ultrasunete, rezonanță magnetică și mai multe tehnici optice. Diametrul GV-urilor este un parametru crucial care contribuie la stabilitatea lor mecanică, funcția de flotabilitate și evoluția în celulele gazdă, precum și la proprietățile lor în aplicațiile de imagistică. În ciuda importanței sale, diametrele raportate pentru aceleași tipuri de GV diferă în funcție de metoda utilizată pentru evaluarea acestuia. Aici, oferim o explicație pentru aceste discrepanțe și utilizăm tehnici de microscopie electronică (EM) pentru a estima cu precizie diametrul celor mai frecvent studiate tipuri de GV. Arătăm că în timpul uscării cu aer pe grila EM, GV-urile se aplatizează, ducând la a

Creșterea de 1,5 ori a diametrului lor aparent. Demonstrăm că diametrul GV-urilor poate fi determinat cu precizie prin măsurători directe din probe crio-EM sau, alternativ, derivat indirect din lățimi de GV-uri plate prăbușite și colorate negativ. Descoperirile noastre ajută la explicarea inconsecvenței datelor raportate anterior și oferă metode precise de măsurare a dimensiunilor GV-urilor.


Articol CERCETARE ORIGINAL

  • Microbiologie și arhea, Departamentul de Biologie, Universitatea Tehnică din Darmstadt, Darmstadt, Germania

Halobacterium salinarum formează vezicule de gaze formate dintr-un perete proteic care înconjoară un spațiu umplut cu gaz. Proteina hidrofobă de 8 kDa GvpA este constituentul major al peretelui nervurat, stabilizat de GvpC la suprafața exterioară. În plus, sunt implicate opt proteine ​​Gvp accesorii, codificate de gvpFGHIJKLM care sunt co-transcrise în stadiile incipiente de creștere. Majoritatea acestor proteine ​​sunt esențiale, dar funcțiile lor nu sunt încă clare. Aici investigăm dacă GvpF prin GvpM interacționează. Experimentele pull-down efectuate în Haloferax volcanii cu domeniul de legare a celulozei ca etichetă a sugerat multe interacțiuni, iar cele mai multe dintre acestea au fost susținute de analizele split-GFP. Ultimul studiu a indicat că GvpL a atras toate celelalte Gvp accesorii, iar GvpF aferent s-a legat, pe lângă GvpL, și GvpG, GvpH și GvpI. S-a găsit o interacțiune puternică între GvpH și GvpI. GvpG a arătat afinitate pentru GvpF și GvpL, în timp ce GvpJ, GvpK și GvpM au legat doar GvpL. Folosind GvpA pentru analize similare, GvpF este singurul partener de interacțiune. Locul de contact al GvpF a fost limitat la jumătatea N-terminală a GvpA și ulterior mapat la anumiți aminoacizi. Luate împreună, rezultatele noastre susțin ideea că accesoriul Gvp formează un complex timpuriu în ansamblul gaz-veziculă care atrage GvpA prin intermediul GvpF.


Referințe

Ferrara, K., Pollard, R. & amp Borden, M. Agenți de contrast cu microbule cu ultrasunete: elemente fundamentale și aplicare la livrarea genelor și a medicamentelor. Annu. Rev. Biomed. ing. 9, 415–447 (2007).

Kaufmann, B.A. & Lindner, J.R. Imagistica moleculară cu ultrasunete de contrast țintit. Curr. Opinează. Biotehnologia. 18, 11–16 (2007).

Weissleder, R. şi colab. Oxid de fier superparamagnetic ultramic: caracterizarea unei noi clase de agenți de contrast pentru imagistica RM. Radiologie 175, 489–493 (1990).

Lee, J.-H. et al. Nanoparticule magnetice proiectate artificial pentru imagistica moleculară ultra-sensibilă. Nat. Med. 13, 95–99 (2007).

Caravan, P., Ellison, J.J., McMurry, T.J. & Lauffer, R.B. Gadoliniu (III) chelați ca agenți de contrast RMN: structură, dinamică și aplicații. Chim. Rev. 99, 2293–2352 (1999).

Walsby, A.E. Vezicule de gaz. Microbiol. Rev. 58, 94–144 (1994).

Pfeifer, F. Distribuția, formarea și reglarea veziculelor de gaz. Nat. Rev. Microbiol. 10, 705–715 (2012).

Shapiro, M.G. et al. Nanostructurile de gaze biogene ca reporteri moleculari ultrasonici. Nat. Nanotehnologia. 9, 311–316 (2014).

Maresca, D. et al. Imagistica neliniară cu ultrasunete a biomoleculelor acustice la scară nanometrică. Aplic. Fiz. Lett. 110, 073704 (2017).

Cherin, E. şi colab. Comportamentul acustic al Halobacterium salinarum vezicule de gaz în domeniul de înaltă frecvență: experimente și modelare. Ultrasunete Med. Biol. 43, 1016–1030 (2017).

Shapiro, M.G. et al. Reporteri codificați genetic pentru imagistica prin rezonanță magnetică xenon hiperpolarizat. Nat. Chim. 6, 629–634 (2014).

Hane, F.T. et al. In vivo detectarea cucurbita[6]urilului, un agent de contrast xenon hiperpolarizat pentru un biosenzor de imagistică prin rezonanță magnetică xenon. Sci. Reprezentant. 7, 41027 (2017).

Barskiy, D.A. et al. Tehnici de hiperpolarizare RMN a gazelor. Chim. Euro. J. 23, 725–751 (2017).

Lakshmanan, A. şi colab. Ingineria moleculară a nanostructurilor proteice acustice. ACS Nano 10, 7314–7322 (2016).

Li, N. & Cannon, M.C. Genele veziculelor de gaz identificate în Bacilul megaterium și expresie funcțională în Escherichia coli. J. Bacteriol. 180, 2450–2458 (1998).

Gilad, A.A. & Shapiro, M.G. Imagistica moleculară în biologia sintetică și biologia sintetică în imagistica moleculară. Mol. Imagistica Biol. 19, 373–378 (2017).

Zakeri, B. şi colab. Eticheta peptidică care formează o legătură covalentă rapidă la o proteină, prin proiectarea unei adezine bacteriene. PNAS 109, E690–E697 (2012).

Schröder, L. Capitolul 8 HyperCEST Imaging. În Imagistica prin transfer prin saturație prin schimb chimic: avansuri și aplicații. pp 121–158 (Pan Stanford Publishing, 2017).

Schröder, L., Capitolul 17 - Xenon Biosenzor HyperCEST RMN A2 - Albert, Mitchell S. In Xenon hiperpolarizat pentru RMN și RMN (ed. Hane, F.T.) pp 263–277 (Academic Press, Boston, 2017).

Witte, C. şi colab. Xenon hiperpolarizat pentru aplicații RMN și RMN. JOVE 67, E4268 (2012).

Witte, C., Kunth, M., Rossella, F. & Schröder, L. Observarea și prevenirea evadarii rubidiului într-un hiperpolarizator de spin xenon cu perfuzie directă optimizat pentru hiper-CEST de înaltă rezoluție (transfer de saturație a schimbului chimic folosind nuclee hiperpolarizate) RMN. J. Chem. Fiz. 140, 084203 (2014).

Nikolaou, P. și colab. Polarizare nucleară aproape de unitate cu un hiperpolarizator open-source 129Xe pentru RMN și RMN. PNAS 110, 14150–14155 (2013).

Kunth, M., Witte, C., Hennig, A. & amp Schröder, L. Capacități de identificare, clasificare și amplificare a semnalului gazdelor de legare a gazelor cu turnover mare în RMN ultra-sensibil. Chim. Sci. 6, 6069–6075 (2015).

Kunth, M., Witte, C. & Schröder, L. Continuous-wave saturation considerations for efficient xenon depolarization. RMN Biomed. 28, 601–606 (2015).

Smith, R. & Peat, A. Creșterea și dezvoltarea gaz-vacuolei în celulele vegetative ale Anabaena flos-aquae. Arc. Microbiol. 58, 117–126 (1967).

Buchholz, B., Hayes, P. & amp Walsby, A. Distribuția proteinei veziculelor gazoase exterioare, GvpC, pe Anabaena veziculă de gaz și raportul său față de GvpA. Microbiologie 139, 2353–2363 (1993).

Simon, R.D. Morfologia și compoziția proteică a veziculelor de gaz din tulpinile de tip sălbatic și vacuole de gaze defecte ale Halobacterium salinarium tulpina 5. Microbiologie 125, 103–111 (1981).

Kunth, M., Witte, C. & Schröder, L. Transfer de saturație a schimbului chimic cantitativ cu nuclee hiperpolarizate (qHyper-CEST): sesizarea dinamicii schimbului xenon-gazdă și afinitățile de legare prin RMN. J. Chem. Fiz. 141, 194202 (2014).

Zaiss, M., Schnurr, M. & amp Bachert, P. Soluție analitică pentru depolarizarea nucleelor ​​hiperpolarizate prin transfer de saturație prin schimb chimic între xenonul liber și cel încapsulat (HyperCEST). J. Chem. Fiz. 136, 144106 (2012).


Multidimensionalitatea de reglementare a biogenezei veziculelor gazoase în Halobacterium salinarum NRC-1

Devine clar că reglarea biogenezei veziculelor gazoase în Halobacterium salinarum NRC-1 are mai multe fațete și pare să integreze indicații de mediu și metabolice atât la nivel transcripțional, cât și posttranscripțional. Cu toate acestea, detaliile mecaniciste care stau la baza acestui proces rămân neclare. În acest manuscris, cuantificăm contribuția împrăștierii luminii realizată atât de veziculele intracelulare, cât și de gaze eliberate izolate din Halobacterium salinarum NRC-1, demonstrând că fiecare formă poate duce la caracteristici distincte în curbele de creștere determinate de densitatea optică măsurată la 600 nm (OD600). Pe parcursul studiului, demonstrăm, de asemenea, sensibilitatea acumulării veziculelor de gaz în Halobacterium salinarum NRC-1 privind diferențele mici în condițiile de creștere și reevaluarea lucrărilor publicate în contextul rezultatelor noastre pentru a prezenta o ipoteză cu privire la rolurile factorului general de transcripție tbpD și a enzimei ciclului TCA aconitazei asupra reglării biogenezei veziculelor gazoase.

1. Introducere

Arheonul halofil Halobacterium salinarum NRC-1 reglementează producția de vezicule de gaz ca răspuns la schimbările diferiților factori de mediu. În timp ce veziculele de gaz (complexe de proteine ​​care sechestrează gazele probabil prin excluderea hidrofobă a apei) conferă flotabilitate, relevanța funcțională, considerată de mult timp a fi un mijloc prin care celulele ar putea scăpa de mediile anoxice subterane pentru ape de suprafață mai bogate în oxigen, a fost recent adusă. în discuție [1]. În Halobacterium salinarum NRC-1, proteinele veziculelor gazoase sunt exprimate din două grupuri de gene, gvp1 și gvp2. O copie a fiecărui grup de gene se găsește pe plasmida pNRC200, în timp ce pNRC100 codifică numai gvp1 cluster [2–4]. Ambii gvp clusterele de gene codifică doi operoni divergenți care codifică gvpACNO și gvpDEFGHIJKLM, respectiv [3]. Din cele 14 gene din grupul de gene gvp, doar 10 (gvpACODEFGJLM) au fost caracterizate și doar o fracțiune este necesară pentru expresia veziculelor de gaz [4–6].

Numărul și relațiile dintre factorii de mediu care influențează biogeneza veziculelor gazoase s-au dovedit a fi mai complexe decât se anticipa inițial. Sursele de carbon și oxigenul pot juca ambele un rol în reglarea biosintezei veziculelor de gaz atât la nivel transcripțional, cât și la nivel posttranscripțional. O serie de studii au sugerat că conținutul scăzut de oxigen dizolvat în mediul de creștere poate declanșa biogeneza veziculelor gazoase [7-10]. O extensie a acestei ipoteze a fost folosită pentru a explica creșterile mari ale abundenței veziculelor de gaz observate în culturile în loturi care intră în faza staționară de creștere comparativ sărăcită de oxigen [11, 12]. Două studii recente, totuși, ofucă această interpretare funcțională simplă, demonstrând că arginina și citratul pot contribui, de asemenea, la reglarea biogenezei veziculelor gazoase în Halobacterium salinarum tulpinile PHH1, PHH4 și NRC-1 [1] și că glucoza poate afecta, de asemenea, biogeneza veziculelor gazoase în Haloferax mediterranei [13]. Hechler și Pfeifer [1] au sugerat, de asemenea, că condițiile anaerobe inhibă biogeneza veziculelor gazoase. Mai recent, Kaur et al. au arătat, de asemenea, o acumulare crescută de vezicule de gaz ca răspuns la stresul oxidativ indus de H2O2 și tratamentul cu paraquat [14] semnalând că poate și alți factori necunoscuți pot contribui la reglarea expresiei GV. Pe lângă setul discutat anterior de factori de mediu care influențează producția de vezicule de gaz, este curios de observat că, în anumite condiții, GV-urile, de obicei cilindrice cu capace conice, pot varia foarte mult în dimensiune și formă în funcție de stimulii mediului [15]. Prin urmare, reglarea expresiei și a asamblarii GV este cu mai multe fațete și poate servi ca un sistem model interesant pentru studierea integrării complexe a datelor de mediu în diferite fenotipuri fiziologice și morfologice.

Două observații legate de producția de GV în timpul creșterii Halobacterium salinarum ne-a atras inițial atenția asupra biogenezei GV. Prima este observarea de către Shand și Betlach [11] a unei creșteri a densității optice măsurată la 600 nm (OD600) care apare în culturi în fază staționară a Halobacterium salinarum NRC817 crescut în medii complexe în baloane de cultură tisulară puternic iluminate. OD600 crescut de la OD600

10.0 de la începutul fazei staționare până la platoul final. Numărările de unități formatoare de colonii (CFU), totuși, arată că numărul de celule viabile rămâne constant pe parcursul acestei faze. Autorii au atribuit creșterea OD600 la acumularea de GV-uri intracelulare, citând date nepublicate [11]. Mai recent, Facciotti și colegii [12] au observat o creștere similară a DO600 în timpul fazei staționare a celulelor crescute în culturi de balon agitate, iluminate ambiental, medii complexe de Halobacterium salinarum NRC-1 (Figura 1). În acest raport, OD600 crescut de la

2,5 de la începutul fazei staționare până la platoul final, o creștere mai mică a DO600 decât cea raportată de Betlach și Shand [11]. Spre deosebire de Betlach și Shand [11], numărul de CFU a scăzut în culturile crescute în balon în timpul fazei staționare sugerând moartea celulelor și poate liza. În timp ce crește în faza staționară târzie OD600 au fost atribuite în mod tradițional acumulării de GV intracelular [16], observarea unei creșteri a DO600 într-o fază staționară în care viabilitatea a scăzut a fost mai misterioasă.


Creșterea de Halobacterium salinarum NRC-1. The Halobacterium salinarum Curba de creștere NRC-1 derivată din datele prezentate inițial în Facciotti și colab. [12]. OD600, afișat în stânga

-axa la scara logaritmica, se noteaza prin cercuri deschise. CFU, afișat în dreapta

Au fost sugerate mai multe posibilități pentru a explica creșterea DO600 în ultimele culturi crescute în balon, inclusiv împrăștierea luminii din veziculele de gaz, aglomerarea celulară și o creștere a producției de bacteriorhodopsină, care se știe că are loc în faza staționară [12]. Două dintre aceste ipoteze au fost eliminate deoarece nu s-a observat aglomerarea celulară, iar citirile de densitate optică măsurate la 700 nm (în afara vârfului principal de absorbție bR) nu au arătat nicio diferență pronunțată față de cele luate la 600 nm [12]. Prin urmare, autorii au concluzionat că cea mai rezonabilă explicație a datelor disponibile a fost eliberarea de vezicule de gaz din celulele de lizare [12].Imaginile cu contrast de fază luate ale culturii de-a lungul traiectoriei sale de creștere au arătat, de asemenea, acumularea abundentă de corpuri mici care împrăștie lumina care se acumulează în fazele târzii de creștere, întărind această ipoteză.

Această ipoteză a fost, totuși, contestată pe baza unor dovezi fizice insuficiente, în ciuda dovezilor istorice ale împrăștierii puternice a luminii de către suspensii de vezicule de gaz purificat din Anabaena flos-aquae [16, 17]. Întrebarea de bază a fost dacă vezicule de gaz libere, în cantități de așteptat să fie eliberate prin liză Halobacterium salinarum Celulele NRC-1, ar putea împrăștia suficientă lumină pentru a explica creșterea OD totală600, în ciuda scăderii împrăștierii din celulele de lizare. Având în vedere interesul recent din jurul GV-urilor în arheile halofile, ne-am gândit că ar fi util să abordăm în mod oficial ipoteza că GV-urile s-au eliberat din liză. Halobacterium salinarum Celulele NRC-1 pot împrăștia lumina suficient pentru a afecta OD600 măsurători.

În acest studiu, demonstrăm că veziculele de gaz liber, în număr proporțional cu ceea ce ar putea fi de așteptat să fie eliberat prin liza celulară în fazele târzii de creștere, împrăștie lumina suficient pentru a explica creșterea densității optice observată anterior de Facciotti și colegii [12]. ]. De asemenea, demonstrăm influența veziculelor interne de gaz asupra densității optice în Halobacterium salinarum NRC-1, confirmând observațiile anterioare ale lui Walsby [17]. În acest proces, am observat, de asemenea, că creșterea și producția de GV în Halobacterium salinarum este foarte sensibil la mici modificări ale condițiilor de cultură. Împreună, observațiile noastre ne-au determinat, de asemenea, să reexaminăm rezultatele publicate anterior și să propunem o ipoteză privind rolurile factorului general de transcripție TbpD și a enzimei aconitazei ciclului TCA în reglarea biogenezei veziculelor gazoase.

2. Materiale și metode

2.1. Creșterea culturii

Halobacterium salinarum NRC-1 și toți mutanții au fost cultivați în medii complexe (CM) constând din 25% NaCl, 2% MgSO4·7H2O, 0,2% KCl, 0,3% Na-citrat și 1% peptonă neutralizată Oxoid TM (Fisher Scientific: New Hampshire, SUA) [18]. Cincizeci de culturi de mililitri, crescute în baloane neconfundate de 125 ml (Corning, New York, SUA) la 37°C, au fost inoculate cu precultură midlog până la o DO inițială.600

0,001 și agitat fie la 100, 150 sau 225 rpm, în funcție de experiment. Unitățile formatoare de colonii (CFU) au fost determinate folosind tehnica plăcii de răspândire. Două diluții diferite (

) au fost placate în trei exemplare pentru fiecare punct de timp. Densitatea optică a fost măsurată folosind un biofotometru Eppendorf (Hamburg, Germania). Programul DataThief [19] a fost folosit pentru a extrage date din Shand și Betlach [11] pentru comparare și analiză.

2.2. Microscopia electronică cu transmisie (TEM)

H. salinarum NRC-1 a fost crescut la faza staționară,

. Baloanele au fost lăsate să se echilibreze pe banca de laborator timp de 24 de ore și celulele plutitoare au fost recoltate (a se vedea Figura S1 din Materialul suplimentar disponibil online la http://dx.doi.org/10.1155/2011/716456). Grilele de cupru acoperite cu Formvar au fost scufundate în celulele recoltate timp de 1 minut și excesul de lichid a fost îndepărtat cu hârtie de filtru. Două procente de acetat de uranil, pH 4,0, a fost folosit pentru a colora celulele. Celulele au fost examinate cu un microscop electronic Philips CM120 (Amsterdam, Olanda) care rulează la o tensiune de 80 kV și o mărire de 11.000 X. Imaginile au fost realizate folosind o cameră Gatan MegaScan atașată la microscop. Dimensiunile veziculelor de gaz au fost calculate cu software-ul ImageJ [20].

2.3. Izolarea veziculelor de gaz

Veziculele de gaz au fost recoltate folosind o versiune modificată a metodei descrise de Cohen-Bazier și colab. [21] așa cum este descris în [22]. Pe scurt, gazonul NRC-1 a fost crescut pe plăci de agar 2% CM la 37°C. 15 mL 1,0 mM MgSO4 cu 10 μL Benzoase (Novagen: Darmstadt, Germania) a fost turnat pe gazon și incubat la 37°C timp de 3 ore. Lizatul a fost filtrat prin trei foi de Kimwipes și concentrația de NaCI a filtratului a fost ajustată la 10% (g/v). Veziculele de gaz au fost spălate prin suprapunerea unei soluții de NaCI 5% și centrifugate într-o centrifugă JOUAN CR3 cu un rotor cu găleată oscilantă T40 (Thermo Scientific, Mass, SUA) la 60 xg peste noapte. Veziculele de gaz plutitoare au fost recoltate și spălate din nou de trei ori cu NaCI 5%.

2.4. Calculul factorului de dispersie a veziculelor gazoase (GVSF)

Imaginile TEM ale celulelor NRC-1 vacuolate au fost luate așa cum este descris mai sus. GV-urile crescute în condițiile specificate mai sus s-au dovedit a avea o lungime medie de 350 nm și o lățime medie de 200 nm (vezi Figura S2A), dimensiuni compatibile cu observațiile anterioare [5, 23]. Pentru a determina GVSF, o veziculă de gaz tipică a fost modelată ca un solid dreptunghiular (350 nm lungime, 200 nm lățime și 200 nm înălțime) a cărui suprafață este compusă din proteine ​​cubice. Dimensiunile subunității cubice au fost aproximate folosind greutatea moleculară a GvpA, principala componentă structurală a GV-urilor și volumul specific parțial al adenilat kinazei porcine [24], o proteină a cărei înveliș extern poate fi aproximat printr-un cub mic. Deoarece adenilat kinaza porcină este mai mare decât GvpA, 21 kDa față de 8 kDa, respectiv, dimensiunile marginilor modelului cubic pentru GvpA au fost scalate corespunzător. Un total de 43.810 de proteine ​​sunt necesare pentru a acoperi suprafața unei vezicule de gaz teoretice, ceea ce sugerează că masa fiecărei vezicule de gaz este egală cu

Densitatea optică la 600 nm a fost măsurată pentru diluții în serie ale veziculelor de gaz purificat, dizolvate în NaCI 5%. Probele diluate în serie au fost apoi solubilizate cu SDS (concentrație finală 1,0%) și fierte timp de 10 minute la 95°C. Concentrația de proteine ​​​​veziculelor gazoase solubilizate a fost găsită utilizând un kit de testare BCA (Thermo Scientific, Mass, SUA). Standardele au fost preparate folosind albumină serică bovină diluată într-un interval de lucru de 5-250 μg/mL. Reactivul de lucru a fost preparat conform protocolului furnizat cu trusa. 25 μL de standardul pregătit și diluțiile probelor au fost pipetate fiecare în godeuri individuale ale unei plăci cu 96 de godeuri cu fund plat transparent (Corning: NY, SUA). Două sute de microlitri de reactiv de lucru au fost adăugați în fiecare godeu și amestecat. Placa a fost plasată la 37°C timp de 30 de minute apoi răcită la temperatura camerei. Absorbanța pentru fiecare godeu a fost măsurată la 562 nm într-un cititor de plăci Infinite M200 (Tecan: Männedorf, Elveția). Concentrația de proteine ​​​​per DO600 unitatea a fost determinată prin împărțirea concentrației de proteine ​​la OD600 pentru proba respectivă dând o valoare de 44,1 μg/mL/OD. Folosind masa de vezicule de gaz individuale calculată mai sus, s-a determinat apoi că este un GVSF

GV/mL per . Remarcăm că acest GVSF specific este foarte dependent de morfologia GV (sferic v. fus și dimensiune) și compoziție [16, 25] și se aplică GV-urilor izolate din Halobacterium salinarum NRC-1 crescut în mediu CM în celule de fază staționară. Un calcul similar ar trebui repetat pentru GV-urile crescute în alte condiții care prezintă diferențe morfologice față de cele studiate aici.

Pentru a verifica dacă proteinele analizate au fost predominant proteine ​​din vezicule gazoase, acest lucru poate duce la faptul că 2,23 mg de vezicule de gaz purificat au fost dizolvate în SDS 2% și fierte timp de 10 minute înainte de încărcare pe un gel Tris-glicină 4-12% (Invitrogen, California, SUA). Gelurile au fost spălate de 3 ori timp de 5 minute cu 200 ml de apă MiliQ și apoi colorate cu 20 ml de Imperial Protein Stain (Thermo Scientific, Ill, SUA) timp de 1 oră. Gelurile au fost colorate peste noapte cu NaCI 0,5 M. În conformitate cu rezultatele anterioare [26, 27], gelurile colorate au arătat mult mai puțin material proteic decât era de așteptat, ceea ce indică faptul că veziculele de gaz erau relativ pure.

2.5. Măsurarea influenței oligoelementelor asupra profilului de creștere

Un agitator de plăci Infinite M200 (Männedorf, Elveția) a fost folosit pentru a testa modul în care diferitele concentrații de oligoelemente din CM afectează creșterea Halobacterium salinarum NRC-1. Celulele au fost diluate la o DO inițială600 de

0,01 în CM suplimentat cu cantități echivalente de 0,25X, 0,5X, 0,75X, 1,0X sau 2,0X de concentrații standard de Fe 2+ și Mn 2+ de 18 μM și 1,9 μM, respectiv. Două sute de microlitri de inocul diluat au fost încărcați în replici a câte 6 în cele 60 de godeuri cele mai interioare ale unei plăci de fund optic transparent Nunc cu 96 de godeuri (Thermo Scientific, SUA). Pentru a preveni evaporarea din cele 60 de godeuri experimentale, inelul cel mai exterior al celor 36 de godeuri a fost umplut cu 200 de godeuri. μL de CM gol. Capacul plăcii cu 96 de godeuri a fost sigilat cu TempPlate Sealing Film (USA Scientific) și Scotch Tape (3M, Minn, SUA). Placa a fost încărcată în Infinite M200 Plate Shaker setat să se agite orbital cu o amplitudine de 2,5 mm la 37°C. Densitatea optică pentru fiecare godeu a fost măsurată la o lungime de undă de 600 nm la fiecare 30 de minute timp de 120 de ore. OD600 valorile au fost convertite la o lungime a traseului de 1 cm pentru a standardiza citirile efectuate cu biofotometrul Eppendorf (Hamburg, Germania).

2.6. Izolarea și creșterea mutanților minus vezicilor gazoase (GV−).

Izolarea mutanților GV minus a fost realizată conform metodelor prezentate în Stoeckenius și colab. [28] și DasSarma [29]. Scurt, Halobacterium salinarum Celulele NRC-1 au fost placate pe plăci de agar CM 2%. Odată crescute, coloniile purpurie translucide (vezi Figura S2B) au fost selectate și recultivate în CM. GV tulpina a fost confirmată prin inspecție prin microscopie cu contrast de fază și prin replacare pe plăci de agar 2% (vezi figurile S2B și S2C).

3. Rezultate

3.1. Eliberarea veziculelor gazoase din celulele lizate poate explica creșterea OD culturii600

Am testat mai întâi ipoteza propusă de Facciotti et al. [12] că împrăștierea luminii din veziculele de gaz eliberate din celulele de fază staționară lizate ar putea explica creșterea DO600 raportate în manuscrisul lor (Figura 1). Am făcut asta în două moduri. În primul rând, folosind GVSF determinat mai sus, am calculat creșterea teoretică a DO600 care ar putea fi de așteptat din numărul de celule Facciotti și colab. [12] a raportat că și-a pierdut viabilitatea în faza staționară. Reducerea celulelor viabile, care se presupune că derivă complet din liza celulară, a fost determinată prin luarea diferenței de UFC între punctul x în timpul fazei staționare timpurii (UFC maxim, Figura 1, Punctul x) la punctul a în timpul fazei staționare târzii (UFC minim). (Figura 1, punctul a). Folosind un număr publicat anterior de GV per celulă în Halobacterium salinarum NRC-1 (

80 GV/celulă în timpul fazei staționare) [1], am calculat numărul așteptat de vezicule de gaz eliberate în mediu din celulele lizate (celule lizate). Utilizarea acestei valori publicate anterior a fost adecvată, deoarece atât ocupația intracelulară (vizată ca zone de refracție strălucitoare folosind microscopia cu contrast de fază) cât și dimensiunea medie a GV (determinată prin microscopie electronică) a celulelor noastre sunt foarte asemănătoare cu ceea ce raportează Hechler și Pfeifer în studiul lor. 1]. GVSF a fost apoi folosit pentru a determina că veziculele de gaz ar fi trebuit să fie eliberate și că acestea singure ar explica o DO600 de 2,87. Adăugarea împrăștierii așteptate (celule/mL) pentru celulele nelizate (OD600

0,6) rezultă într-un OD final așteptat600 de 3,47. Aceasta este aproape 1,0 OD600 unitate mai mare decât cea raportată de Facciotti și colab. [12] sugerând că veziculele de gaz eliberate, singure, ar putea explica într-adevăr creșterea observată a DO600.

Discrepanța în OD final600 derivat din calculul de mai sus și din datele raportate de Facciotti și colab. [12] poate fi explicat cu ușurință prin doi factori. În primul rând, este posibil ca numărul total de celule lizate să fie mai mic decât ceea ce sa presupus mai sus. O scădere a CFU nu necesită ca toate celulele să se lizeze și, prin urmare, împrăștierea din GV-urile eliberate poate fi ușor mai mică decât ceea ce am calculat mai sus. În al doilea rând, este probabil ca numărul de GV exprimat pe celulă să fie mai mic de 80. În timp ce Hechler și Pfeifer [1] au raportat o medie de

80 GV per celulă, este de imaginat că culturile crescute de Facciotti și colab. [12] a conținut mai puține GV per celulă, deoarece celulele încep să se lizeze la începutul fazei staționare, când s-au acumulat relativ mai puține GV. De fapt, reducerea numărului mediu de GV per celulă la 54 poate aduce OD teoretic600 în acord cu datele măsurate.

Apoi, am determinat empiric dacă adăugarea unor cantități specifice de GV purificate la cultura celulară ar putea explica, într-un mod previzibil, creșterile OD.600 remarcat de Facciotti et al. [12]. În acest experiment, purificat Halobacterium salinarum Veziculele de gaz NRC-1 au fost adăugate în număr definit la tipul sălbatic Halobacterium salinarum celulele NRC-1 și creșterile respective ale OD600 au fost determinati. Am imitat două puncte în faza staționară târzie a lui Facciotti și colab. [12] experiment în care CFU au scăzut prin realizarea unui eșantion de celule viabile mid-log ( ) la o OD600 care a fost echivalent cu punctele din curbă (Figura 1, Punctele A și B). La aceste probe, s-au adăugat vezicule de gaz purificat (resalate la 25% NaCI) în cantități fixe corespunzătoare la 40, 80 și 120 GV eliberați per celulă. Numărul total de GV adăugate a fost determinat prin înmulțirea numărului de GV eliberați per celulă cu numărul de celule care au lizat în faza staționară a lui Facciotti și colab. [12] culturi. OD600 dintre aceste amestecuri purificate-GV/celulă au fost apoi măsurate. Pentru punctele A și B, adăugarea unui echivalent de 40 GV pe celulă (2,45 și, respectiv, 2,70) a replicat cel mai îndeaproape OD600 (2,51 și 2,48) observate în Facciotti și colab. Cultură în lot [12] (Figura 2) și sunt în mod rezonabil similare cu valoarea de 54 GV per celulă eliberată calculată mai devreme. Din nou, valoarea de 40 GV per celulă este mai mică decât ceea ce a fost prezis de Hechler și Pfeifer [1], cel mai probabil datorită faptului că celulele par să înceapă să se lizeze în faza staționară timpurie când acumularea completă de GV nu a avut loc încă.


Contribuția veziculelor de gaz liber la împrăștierea luminii la 600 nm. Veziculele de gaz au fost purificate așa cum este descris în Materiale și Metode. Pentru a reproduce concentrația de celule viabile la punctele a și b (Figura 1) celulele crescute

Împreună, aceste date susțin două ipoteze propuse în Facciotti et al. [12]. Primul este că GV-urile gratuite sunt eliberate din Halobacterium salinarum NRC-1 sunt capabili să împrăștie lumină semnificativă la 600 nm. Al doilea este că numai GV liber, în cantități de așteptat a fi eliberat din celulele de lizare în Facciotti și colab. [12], poate explica creșterea DO600 descrise în manuscrisul lor [12].

3.2. GV-urile intracelulare cresc, de asemenea, împrăștierea luminii la 600 nm

Pe lângă întrebarea dacă veziculele de gaz liber ar putea contribui la creșterea DO600, am căutat, de asemenea, să confirmăm dacă veziculele de gaz intracelulare în Halobacterium salinarum tulpinile, așa cum au explicat Shand și Betlach [11] cu date nepublicate (o referință citată de alții în acest context), au fost într-adevăr capabile să explice creșterea OD asociată fazei staționare.600. Remarcăm că Walsby și colegii [7, 17] au arătat, de asemenea, împrăștierea luminii de către GV intracelular în Halobacterium salinarum tulpini. Pentru a cuantifica influența GV intracelular asupra împrăștierii în Halobacterium salinarum NRC-1, am izolat mai întâi și am crescut un minus gaz-veziculă spontan și stabil (GV) mutant al Halobacterium salinarum NRC-1. Genul mai sălbatic Halobacterium salinarum NRC-1 și o veziculă de gaz mutantă minus (GV) au fost crescute așa cum este descris în Materiale și Metode. Genul mai sălbatic Halobacterium salinarum NRC-1 a arătat creșterea OD legată de faza staționară600 descrise anterior atât în ​​Facciotti și colab. și Shand și Betlach [11, 12] (Figura 3, Panoul A). În schimb, GV tulpinii nu a avut creșterea OD asociată fazei staționare600 notat pentru probele de tip sălbatic (Figura 3, panoul B). Numărul maxim de CFU obținut atât de la tipul sălbatic, cât și de la GV culturile au fost

fiecare. Aceste date sunt în concordanță cu ipoteza conform căreia expresia veziculelor gazoase reprezintă creșterea OD600 observată în faza staţionară a Halobacterium salinarum NRC-1.


(A)
(b)
(A)
(b) Creșterea de Halobacterium salinarum Tulpini de tip sălbatic și deficit de GV NRC-1. Halobacterium salinarum Tulpinile NRC-1 de tip sălbatic și cu deficit de GV au fost crescute în trei exemplare așa cum este descris în Materiale și Metode. Creșterea a fost măsurată prin împrăștierea luminii la 600 nm (forme umplute) și prin numărarea unităților formatoare de colonii folosind tehnica plăcii de răspândire (forme deschise). OD600 este raportat împotriva stângii

-axa in scara logaritmica si CFU este raportata in dreapta

În al doilea rând, am luat celule vacuolate și am „explodat” veziculele de gaz prin centrifugare. În acest caz, celulele care au avut o inițială medie au fost centrifugate într-o microcentrifugă Eppendorf 5424 (Eppendorf, Hamburg, Germania) la 5000 xg, timp de 5 minute. Celulele au fost apoi resuspendate prin pipetare ușoară și OD600 a fost măsurat la o medie de 3,48. Nu s-a observat nicio scădere a UFC determinate înainte și după centrifugare, asigurându-se că viabilitatea nu sa schimbat. Aceasta sugerează că scăderea DO600 poate fi atribuită unei epuizări a veziculelor de gaz și nu lizei celulare. Figura 4 rezumă datele. Imaginile cu contrast de interferență diferențială ale celulelor luate înainte și după centrifugare arată că, înainte de centrifugare, aproape 95% dintre celule sunt puternic vacuolate. Imaginile postcentrifugării sugerează că pierderea totală a GV este de 50%. Dat

80 GV per celulă, așa cum este raportat de [1] pentru celulele cu fază staționară târzie, 50% pierdere din cauza centrifugării și nicio pierdere de celule viabile din cauza centrifugării, am calculat că

GV-urile au fost „explodate” în timpul centrifugării. Cuplând această pierdere cu scăderea DO600 de 1,87 sugerează că GVSF pentru GV intracelular este , o valoare mai mică decât GVSF pentru GV-uri libere. Alternativ, calculele noastre sugerează că în Halobacterium salinarum Veziculele de gaz liber NRC-1 se împrăștie de 3,1X mai mult când sunt libere decât atunci când formează vacuole gazoase intracelulare. O diferență analogă în mărimea împrăștierii dintre veziculele de gaz libere și intracelulare în Anabaena flos-aquae a fost raportat a fi 2,44X, respectiv [25].


Difuzarea luminii prin vezicule gazoase intracelulare. Celulele vacuolate au fost centrifugate la 5000 xg timp de 5 minute pentru a dezumfla veziculele de gaz. OD600 și numărătoarea CFU au fost luate înainte și după centrifugare. Nu a fost observată nicio scădere a CFU sau modificare a morfologiei înainte și după centrifugare, ceea ce înseamnă că diferența de DO600 poate fi atribuită direct pierderii veziculelor de gaz. Barele de eroare reprezintă
3.3. Sensibilitatea profilurilor curbei de creștere la agitația și geometria culturii

Pe parcursul testării ipotezelor de mai sus, am făcut două observații care păreau incompatibile cu datele publicate anterior. Primul, Halobacterium salinarum Celulele NRC-1 crescute în condiții care au fost destinate să imite condițiile de cultură ale lui Facciotti și colab. [12] nu a reușit să ducă la aceeași scădere a CFU, în ciuda faptului că a reprodus o creștere la scară similară a OD600 în timpul fazei staționare. În al doilea rând, sa remarcat faptul că creșterea OD asociată fazei staționare600 raportat de Shand şi Betlach [11] pentru Halobacterium salinarum NRC817 a fost mult mai mare decât oricare dintre experimentele efectuate aici sau cele raportate de Facciotti și colab. [12]. Am căutat să investigăm aceste două probleme.

Am emis ipoteza că diferențele majore (ambele în OD600 și CFU) între studiul nostru și studiile publicate menționate mai sus ar putea fi explicate cel puțin parțial prin diferențe specifice în condițiile de creștere. Acest lucru este deosebit de relevant atunci când comparăm rezultatele noastre cu cele ale lui Facciotti și colab. [12]. Compararea datelor noastre cu cele ale lui Shand și Betlach [11] implică complicația suplimentară că cele două studii cresc tulpini similare, dar diferite de Halobacterium salinarum. În ciuda acestei diferențe cheie, este totuși interesant de explorat cât de multe dintre diferențele în OD final600 raportate în fiecare studiu ar putea fi luate în considerare în schimbarea condițiilor de creștere a crescut în balon Halobacterium salinarum NRC-1. De exemplu, Shand și Betlach [11] au raportat că celulele lor au fost mai întâi crescute în baloane Erlenmeyer la 350 rpm și ulterior mutate la intrarea în faza staționară în baloane Monogro etanșe (Wheaton, NJ, SUA), care au fost apoi agitate la 100 rpm în fie în condiții foarte iluminate, fie în întuneric. Facciotti şi colab. [12] și-au crescut culturile în baloane Erlenmeyer în lumină ambientală la 225 rpm pe un agitator incubator Innova 4900 (New Brunswick, NJ, SUA). Ar putea, de exemplu, ceva la fel de simplu ca reducerea vitezei de agitare să influențeze OD final600 în balon crescut Halobacterium salinarum NRC-1, duc la OD final semnificativ mai mare600?

Pentru a testa ipoteza că o viteză mai lentă de agitare poate duce la un profil de creștere divergent găsit de Shand și Betlach [11], unde OD600 în timpul fazei staţionare a crescut cu

9.0 unități, am crescut de tip sălbatic Halobacterium salinarum Celulele NRC-1 la 100 rpm simulând viteza de agitare, deși nu vasul de cultură, a condițiilor de creștere în fază staționară raportate de Shand și Betlach [11] (Figura 5). În aceste condiții de creștere, am văzut și noi un OD maxim600 de

8,5 în fază staționară care s-a apropiat de OD600 găsit de Shand și Betlach [11]. Cu toate acestea, deoarece ne-am crescut cultura la turații mici pe tot parcursul experimentului (față de viteza mare până la staționare), această curbă de creștere a fost încă diferită în două moduri față de ceea ce au raportat Shand și Betlach [11]. Prima diferență este că o scurtă pauză sau un platou tranzitoriu în creștere durează

0,4 în cultura balonului agitat la 100 rpm pe Barnstead/LabLine Max Q Mini 4450 (Thermo Scientific, Mass, SUA). Nicio dovadă a unui DO scăzut similar600 platoul este notat în orice alt experiment de creștere discutat în acest manuscris până acum. În timpul acestei tranziții, cultura își schimbă aspectul, devenind lăptos/roz la sfârșitul tranziției, o modificare fenotipică care este de obicei asociată cu acumularea GV [16]. Într-adevăr, în timp ce în timpul acestei tranziții apar modificări în aspectul vizibil al culturii, analiza microscopică a celulelor înainte și după arată acumularea de vezicule de gaz are loc numai după tranziție (Figura 6).


Răspunsul culturii mijlocii a Halobacterium salinarum NRC-1 la modificările vitezei de agitare. Halobacterium salinarum NRC-1 a fost crescut la 100 rpm așa cum este descris în Materiale și Metode. Creșterea a fost urmărită folosind atât împrăștierea luminii la 600 nm (linii continue), cât și prin numărarea unităților formatoare de colonii folosind tehnica plăcii de răspândire (linii întrerupte). OD600 este raportat împotriva stângii

-axa in scara logaritmica si CFU este raportata in dreapta

-axa în scară liniară. Jumătate din setul de probe au fost transferate la 150 rpm la

150 h. Culturile agitate de 100 rpm sunt prezentate ca cercuri deschise, iar culturile agitate de 150 rpm sunt prezentate ca cercuri închise. Punctele A, B, C și D se referă la panourile din Figura 6 în care sunt prezentate fenotipul culturilor pentru punctele selectate. Barele de eroare pentru numărarea CFU sunt incluse ca


(A)
(b)
(c)
(d)
(A)
(b)
(c)
(d) Fenotipuri de celule și culturi în condiții de agitare lentă. Halobacterium salinarum Celulele NRC-1 au fost crescute la 100 rpm așa cum este descris în Materiale și Metode. Fenotipurile au fost urmărite în condiții de creștere lentă cu agitare de către vasul de cultură și prin microscopia cu lumină vizibilă a celulelor individuale. Imaginile celulare sunt reprezentative pentru >95% din morfologia celulară a culturilor la un anumit moment de timp. Punctele de timp au fost luate din Figura 5. (a) Cultură și imagini celulare dinainte de platoul de creștere,

. (b) Cultură și imagini celulare de după platoul de creștere,

. (c) Cultură și imagini celulare din faza staționară mijlocie,

. (d) Cultură și imagini celulare din faza staționară târzie,

Acumularea de GV în acest caz, totuși, pare să preceadă o a doua fază de creștere, mai degrabă decât doar creșterea împrăștierii datorită producției și/sau eliberării GV. Pe lângă apariţia platoului tranzitoriu în curba de creştere a Halobacterium salinarum Numărul NRC-1, CFU a crescut dincolo de platou, ceea ce duce la sugestia că tranziția de creștere care are loc la poate fi probabil atribuită schimbărilor fiziologice în utilizarea substratului, o schimbare diauxică clasică, mai degrabă decât nu doar începuturile acumulării GV. Deoarece singura diferență între culturile de 100 și 225 rpm (Figura 3, Panoul A și Figura 5) a fost viteza de agitare, bănuim că tranziția diauxică poate fi influențată de epuizarea oxigenului din medii. Remarcăm că solubilitatea oxigenului este extrem de scăzută în mediile hipersaline. Beard și colab. au raportat concentrația de oxigen solubil dependentă de adâncime în medii static NaCl 4 M, care are doar o concentrație de NaCl puțin mai mică decât cea a CM (4,27 M NaCl). La această concentrație mare de NaCl, oxigenul dizolvat la suprafață este de 66% față de aerul ambiant (

45 μmol/L), dar scade brusc la doar 7,3% (

5 μmol/L) în primul milimetru și în cele din urmă la 3,1% (

2 μmol/L) pe următorii 34 mm de adâncime [7]. În astfel de circumstanțe, este rezonabil să presupunem că rata consumului de oxigen de către cultură ar putea depăși rapid adăugarea de gaz nou la viteze mici de agitare.

Pentru a testa ipoteza că epuizarea oxigenului la viteză mică de agitare a indus schimbarea diauxică în Halobacterium salinarum NRC-1, am recultivat de tip sălbatic Halobacterium salinarum Celule NRC-1 la 100 rpm. Cu toate acestea, în timpul acestei culturi, am transferat jumătate din culturi într-un agitator New Brunswick Scientific G-53 (New Brunswick Scientific, NJ, SUA) la 150 rpm la 75 de ore după schimbarea diauxică presupusă (Figura 5, Punctul T), presupunând că aceasta ar crește oxigenul dizolvat. Impactul major al acestui transfer de instrument este creșterea aerării. Până la separarea culturii la 150 h, OD600 și CFU au fost complet identice pentru culturile agitate lente (100 rpm) și rapide (150 rpm). La șapte ore după ce trei baloane au fost plasate la 150 rpm, CFU a culturilor rapide a fost (celule viabile/mL), în timp ce cea a culturilor lente a fost CFU (celule viabile/mL), o diferență de CFU (celule viabile/mL) (Figura 5). Tranziția rapidă la creșterea crescută observată în culturile agitate rapid este în concordanță cu observațiile lui Schmid și colab. care a observat reluarea rapidă a creșterii ca răspuns la o creștere bruscă a oxigenului dizolvat [10]. Interesant, în timp ce CFU-urile au crescut după punctul de tranziție în culturile cu agitare rapidă în raport cu omologii lor lenți, nu am observat o schimbare semnificativă a DO.600 între culturi rapid şi încet agitate.

Aceste date sugerează că culturile agitate de 100 rpm pot deveni lipsite de oxigen la OD600 apropiindu-se de 0,4 și că adăugarea de oxigen dizolvat introdus prin tranziția la agitarea RPM mai mare permite o reluare a metabolismului dependent de oxigen din substraturi care sunt încă prezente, dar care altfel ar fi fost consumate dacă cultura ar fi fost la RPM ridicat tot timpul. În plus, valorile indistinguibile ale OD600 între culturile agitate rapid și lent sugerează că reluarea creșterii poate să fi redus acumularea de GV per celulă în probele agitate rapid.

Al doilea a raportat o discrepanță între rezultatele lui Facciotti și colab. [12] și experimentele noastre inițiale de creștere în care celulele păreau să se lizeze și, respectiv, să rămână intacte în timpul fazei staționare au fost mai dificil de testat direct. Aici emitem ipoteza că mici diferențe de mediu sau de cultură pot juca un rol. În experimentele noastre inițiale, deși au fost concepute pentru a imita Facciotti și colab. [12] culturile au fost agitate pe un Barnstead/LabLine

Mini 4450 (Thermo Scientific, Mass, SUA) la 225 rpm în loc de Innova 4900. Este posibil ca diferitele platforme de agitare să fi introdus unele variații din cauza diferențelor în orbitele de agitare care au fost de 2 in, respectiv 0,75 in, pentru Innova 4900 și Barnstead /LabLine Max Q Mini 4450. Este posibil ca agitația suplimentară de pe Innova 4900 să fi indus liza celulară, în timp ce creșterea pe LabLine Max Q Mini 4450 nu a agitat violent alicote de 20 ml din celulele noastre în tuburi conice de 50 ml nu a dus la viabilitate celulară redusă. Compoziția mediilor, inclusiv elementele prezente în sursele locale de apă DI pot contribui, de asemenea, la diferențele dintre experimentele noastre și cele ale lui Facciotti și colab. [12]. In cele din urma, Halobacterium Se știe că speciile sunt sensibile la detergentul rezidual de spălat vase lăsat pe sticlă. În timp ce protocoalele de spălare pentru probele colectate de Facciotti și colab. [12] și datele noastre actuale implică ambele cantități semnificative de clătire cu apă DI înainte de utilizare, este posibil ca diferențele de tip de detergent sau cantitatea precisă de clătire să contribuie, de asemenea, la discrepanța pe care o remarcăm. Din păcate, acest mister specific rămâne nerezolvat.

3.4. Sensibilitatea profilurilor curbei de creștere la concentrația de oligoelement

Având în vedere datele prezentate până în acest punct, este tentant să se asocieze funcțional un platou de creștere aparent, fie la începutul fie la sfârșitul curbei de creștere a Halobacterium salinarum NRC-1, direct cu producția de vezicule de gaz și într-o oarecare măsură cu disponibilitatea oxigenului. Cu toate acestea, de ceva timp, bănuim că unele dintre micile diferențe interexperimentale pe care le observăm în aspectul calitativ al platoului de creștere în Halobacterium salinarum NRC-1 ar putea fi legat de concentrația oligoelementelor Fe 2+ și Mn 2+ (date nepublicate) mai degrabă decât de un efect direct al acumulării de oxigen sau vezicule gazoase. Prin urmare, am decis să testăm în mod oficial influența oligoelementelor tipice Fe 2+ și Mn 2+ asupra formei curbei de creștere.

Deoarece cea mai comună formulare de mediu de creștere utilizată pentru Halobacterium salinarum NRC-1 solicită adăugarea Fe 2+ și Mn 2+ la 18 μM și 1,9 μM, respectiv, am decis să testăm influența diferitelor diluții ale soluțiilor stoc de Fe 2+ și Mn2+. La CM s-au adăugat cantităţi echivalente de 0,25X, 0,5X, 0,75X, 1,0X şi 2,0X de Fe2+ şi Mn2+. Halobacterium salinarum NRC-1 a fost inoculat în fiecare variantă de mediu și încărcat într-o placă cu 96 de godeuri așa cum este descris în Materiale și Metode. Observăm că nivelurile de oxigen din plăcile cu 96 de godeuri tind să fie mai mici decât cele ale culturilor în baloane bine agitate. Prin urmare, curbele de creștere crescute în plăci cu 96 de godeuri sunt mai legate de mediu cu cele ale culturii crescute în balon cu agitare lent (de exemplu, experimentul de 100 RPM notat mai devreme) decât cultura tipică cu agitare rapidă. Halobacterium salinarum NRC-1 crescut în CM fără oligoelemente adăugate a prezentat un platou scurt în creștere la un OD600 de

0,5 care poate fi analog cu platoul raportat în figurile 1 și 4. Creșterea concentrației de oligoelement a redus durata platoului până când acesta a fost complet inexistent în curba de creștere a oligoelementelor de concentrație de 2,0X. Datele sunt rezumate în Figura 7. În ciuda acestei modificări a profilului de creștere, concentrațiile de Fe 2+ și Mn 2+ par să nu aibă niciun efect asupra DO maximă.600 valorile care modifică efectul direct al Fe 2+ și Mn 2+ ar fi putut fi asupra producției de GV. După îndepărtarea din cititorul de plăci, celulele crescute în fiecare dintre concentrațiile de oligoelement au afișat fenotipul GV+ plutitor și nicio diferență aparentă în abundența GV nu poate fi percepută prin microscopia cu contrast de fază. Aceste rezultate, împreună cu datele anterioare, par să sugereze că platoul pe care îl vedem în creștere Halobacterium salinarum NRC-1 se datorează probabil unei combinații de factori care includ (Fe 2+ ), (Mn 2+ ) și/sau (O2).


Influența concentrației oligoelementelor asupra curbei de creștere a Halobacterium salinarum NRC-1. Halobacterium salinarum NRC-1 a fost crescut în CM cu concentrații standard de Fe 2+ și Mn 2+ 0X, 0.25X, 0.5X, 0.75X, 1.0X și 2.0X (18 μM și 1,9 μM) într-o placă cu 96 de godeuri, așa cum este descris în Materiale și metode. Creșterea a fost urmărită de OD600 și raportate pe axa y la scară liniară pentru a evidenția diferențele fenotipice. OD600 valorile au fost convertite la o lungime de cale de 1 cm pentru a fi echivalentă cu alte măsurători ale densității optice din acest manuscris. Fiecare curbă este o medie de șase replici.

Aceste date complică vederea simplă a unei legături funcționale simple între concentrația de oxigen, platoul de creștere și producția de GV. Mai degrabă se pare că oxigenul, oligoelementele și starea metabolică (așa cum se simte probabil prin prezența sau absența metaboliților cheie) toate se integrează într-un fel pentru a regla producția de vezicule de gaz. Pentru a rezuma, (a) experimentul nostru cu agitare lentă demonstrează că oxigenul este probabil un factor limitator implicat în formarea unui platou de creștere în Halobacterium salinarum NRC-1 (b) oxigenul crescut (agitare rapidă) poate minimiza platoul sau îl poate deplasa mai târziu în creștere (c) fierul și/sau manganul pot elimina, de asemenea, platoul în condiții de oxigen scăzut (d) când are loc platoul, este de obicei asociat cu producția crescută de GV, dar absența acesteia nu exclude producția de GV (e) arginina și citratul pot influența ambele producția de GV [1]. Ceea ce rămâne de înțeles este dacă toți acești factori (oxigen, oligoelemente și metaboliți cheie) care par a fi legați fie direct, fie indirect de reglarea biogenezei veziculelor gazoase coordonează cumva expresia GV. O sinteză mai completă a unor posibile scheme de reglementare care sunt în concordanță cu aceste observații este prezentată în discuție.

4. Discutie

În acest manuscris, am început prin a aborda întrebări relativ simple cu privire la capacitatea veziculelor de gaz în Halobacterium salinarum NRC-1 pentru a influența împrăștierea luminii atât intracelular, cât și liber în soluție. Am demonstrat că GV-urile libere, în număr care ar putea fi de așteptat în mod rezonabil de la lizarea celulelor în culturi crescute în loturi, pot împrăștia lumina suficient la 600 nm pentru a explica creșterea OD.600 care sa observat anterior a avea loc în faza staționară a Halobacterium salinarum NRC-1 de Facciotti et al. [12]. Această concluzie oferă acum un sprijin experimental ferm pentru interpretarea datelor raportate în Facciotti și colab. [12]. În plus, oferim dovezi directe că veziculele de gaz intracelular contribuie, de asemenea, în mod semnificativ la creșterea împrăștierii luminii la 600 nm, fapt adesea propus, dar pentru care există puține dovezi publicate pentru Halobacterium salinarum NRC-1 [17, 25]. De asemenea, reafirmăm ideea că caracterizarea și raportarea atentă a condițiilor de cultură (inclusiv geometria culturii și fenotipul) este esențială dacă dorim să comparăm datele experimentale generate în diferite laboratoare pentru producția de vezicule de gaz în Halobacterium salinarum NRC-1. Acest lucru este evidențiat de faptul că, în ciuda eforturilor de a imita condițiile de creștere în Facciotti și colab., culturile crescute în cadrul actual de laborator nu au arătat scăderea CFU observată de Facciotti și colab. [12] în fază staționară. În plus, diferențe imperceptibile în DO600 între culturile agitate lentă și rapidă (în ciuda diferențelor clare de creștere) împreună sugerează că numărul de CFU este deosebit de important de măsurat în experimentele efectuate cu celule vacuolate.

Mai interesant, aceste experimente ne-au determinat să ne gândim mai mult la modul în care factorii de mediu specifici (unii dintre care pot fi modulați prin mici modificări ale stării culturii) influențează fenotipul de creștere și producția de GV. Datele prezentate aici conduc la concluzia că, în timp ce oxigenul joacă un rol crucial în biogeneza veziculelor gazoase în Halobacterium salinarum NRC-1 că alți factori în mod specific urmăresc oligoelemente și metaboliți citrat și arginina (acesta din urmă rezultate de la Hechler și Pfeifer [1]) joacă, de asemenea, roluri nedefinite, dar cruciale.

4.1. Rolul TbpD în reglarea expresiei veziculelor de gaz în Halobacterium salinarum NRC-1

Ideea că alți factori decât oxigenul joacă probabil un rol în reglarea biosintezei GV ne-a motivat să revizuim datele publicate anterior pentru a determina dacă am putea sau nu începe să sintetizăm un scenariu de reglementare în concordanță cu rolul oxigenului în biosinteza GV, observațiile făcute de Hechler. și Pfeifer [1] în ceea ce privește influența citratului, izocitratului și argininei în producția anaerobă de GV și implicarea potențială a Fe 2+ și/sau Mn 2+ . Cel puțin, am putea identifica un set limitat de potențiali „vinovați” care ar putea fi asociate cu reglarea biosintezei GV?

Am fost inițial atrași de o asociere interesantă între biogeneza unei vezicule gazoase și un platou de creștere tranzitoriu observat raportat de Facciotti și colab. [12] într-o tulpină de Halobacterium salinarum NRC-1 în care factorul general de transcripție TbpD a fost exprimat constitutiv la niveluri nenative, tbpD-cmyc încordare. The tbpD-cmyc tulpina, chiar și atunci când este agitată la 225 rpm, crește mai lent decât tipul sălbatic și prezintă un platou tranzitoriu similar, dar mai scurt, în creștere la OD600

0,4, așa cum se vede la tipul sălbatic agitat la 100 rpm (date prezentate în acest manuscris). Mai mult, acumularea GV este sever atenuată în tbpD-cmyc tulpină în raport cu tipul sălbatic. Datele de micromatrice arată, de asemenea, că abundența transcripției, în special a genelor transcrise de la promotorul pF [23, 30], gvpF,G,H,I,J,K,L, și M (vng5019g-vng5027g) de gvp1 este, de asemenea, sever redus în tbpD-cmyc tulpină în raport cu tipul sălbatic. Facciotti şi colab. [12] raportează, de asemenea, modificări ale abundenței transcriptelor GV în a tbpD făcut praf. Aici, transcrierile reglementate de promotorii pA și pD, gvpD,E,A,C,N, și O (vng5028g-vng5034g) arată o abundență scăzută în raport cu nivelurile de tulpină de control, în timp ce transcrie abundența pentru genele reglate de promotorul pF, gvpF,G,H,I,J,K,L, și M (vng5019g-vng5027g), a crescut. Coker şi colab. [31] raportează, de asemenea, o scădere a expresiei gvpD,E,A,C,N, și O (vng5028g-vng5034g) în tbpD-tulpini knockout. Remarcăm că lucrările anterioare arată, de asemenea, reglarea diferențială a promotorilor pF și pD. Analizele Northern blot ale gvp1 gruparea de gene în Halobacterium salinarum sp. PHH1 au arătat că genele transcrise de la promotorul pF (gvpFGHIJKLM) sunt transcrise de preferință în timpul fazei exponențiale, în timp ce transcrie de la promotorul pD (gvpDE) sunt transcrise preferenţial în faza staţionară [32]. Împreună, aceste date sugerează o legătură puternică de reglementare între factorul de transcripție general TbpD și expresia GV a gvp1 cluster de gene.

Datele de la Facciotti et al. [12] pentru tbpD tulpinile perturbatoare prezintă o mică schimbare perceptibilă în gvp2 (vng6229g-vng6246g) abundența transcrierii față de tulpinile martor, în timp ce datele de la Coker și colab. sugerează o oarecare perturbare a gvp2 genele în tbpD-tensiune knockout [31]. Teufel și colab. [33] au arătat, de asemenea, că expresia c-vac (gvp2) grupul de gene este neperturbat în Halobacterium salinarum tulpina PHH4 (o tulpină lipsită tbps A, B C, D și F).

Creșterea lentă și schimbarea diauxică timpurie observate în tbpD-cmyc tulpina, care a imitat schimbarea diauxică observată în celulele de tip sălbatic, probabil lipsite de oxigen, crescute la 100 rpm în acest studiu, a sugerat în continuare că tbpD expresia poate fi legată și de nivelurile de oxigen. Prin urmare, am căutat dovezi ale unei legături între perturbarea nivelurilor de oxigen și tbpD expresie, în special pentru dovezi că tbpD expresia ar putea fi legată de condițiile „scăzute” de oxigen. Datele de microarray colectate de Schmid et al. arată că tbpD abundența transcriptului crește în condițiile în care oxigenul devine limitativ și în care abundența sa poate fi scăzută în mod corespunzător prin mutarea celulelor de la concentrații de oxigen „scăzute” la „ridicate” [10]. Datele microarray arată, de asemenea, că tbpD abundența transcripției crește începând din faza staționară [12] când se consideră că disponibilitatea oxigenului este limitată. Datele de la Kaur et al. [14] arată în continuare că stresul de peroxid de hidrogen induce și o creștere a ambelor tbpD și abundența transcriptului veziculelor gazoase în raport cu probele martor nestimulate. Kaur şi colab. propun în manuscrisul lor că nivelurile dăunătoare ale speciilor reactive de oxigen (ROS) determină celulele să adopte o stare metabolică similară cu cea adoptată în mediile sărace în oxigen pentru a minimiza orice daune suplimentare induse de ROS generate metabolic. Având în vedere această interpretare, o creștere a tbpD abundența transcripției ar fi în acord cu expresia dependentă de oxigen observată anterior în Facciotti și colab. [12] și în datele prezentate de Schmid et al. [10]. Împreună, fiecare dintre aceste observații sugerează o legătură funcțională între TbpD, concentrația de oxigen și reglarea biosintezei GV.

4.2. Rolul aconitazei în reglarea expresiei veziculelor gazoase în Halobacterium salinarum NRC-1

În continuare, integrăm observațiile făcute în mai multe manuscrise pentru a arăta cum enzima aconitaza ciclului acidului citric, care catalizează izomerizarea reversibilă între citrat și izocitrat și, în unele organisme, acționează ca o proteină de legare a acidului nucleic [34-38], poate juca, de asemenea, un rol important. rol în acumularea veziculelor de gaz. În primul rând, Facciotti și colab. [12] a remarcat că abundența transcripției atât a genelor aconitazei, cât și a veziculelor gazoase este scăzută în tbpD-cmyc tulpină comparativ cu nivelurile lor în tulpinile martor. Ei au remarcat, de asemenea, că în tulpinile de control, aconitaza și tbpD Abundența transcripției este anticorelată pe măsură ce celulele tranzitează prin regiuni din curba de creștere (adică, întârziere, creștere exponențială și faza staționară). Celulele care intră în faza staționară sărăcită de oxigen reglează în jos expresia aconitază si concomitent creste expresia lui tbpD. În plus, datele de la Schmid și colab. [10] susțin în continuare observația că fluctuațiile concentrației de oxigen pot duce la expresia transcripțională anti-corelată a aconitazei și tbpD. Luate împreună, datele se leagă între tbpD expresie și producția GV, notate în paragraful anterior, anti-corelația consistentă între tbpD și aconitaza în culturile de control și perturbarea aconitază și expresia GV în tbpD-cmyc toate tulpinile par să lege și aconitaza de producția de GV în Halobacterium salinarum NRC-1.

Interesant este că legăturile dintre perturbarea fenotipului GV, TbpD, și acum a aconitazei ne readuc la observațiile făcute de Hechler și Pfeifer [1] care au observat că acumularea de GV în timpul creșterii anaerobe este, de asemenea, dependentă de prezența fie citratului, fie izocitratului, substratul și produsul respectiv al aconitazei. Această inferență funcțională preliminară pentru aconitază poate fi interpretată și în contextul altor date. De exemplu, Kaur et al. [14] au observat o pierdere de vezicule de gaz în H2O2-stresul indus într-un mutant knockout peroxidază, fără modificare concomitentă a abundenței transcriptului GV. Creșterea speciilor de ROS în mutantul knockout peroxidază acționează astfel probabil pentru a modula abundența GV posttranscripțional. Această observație suplimentară și sensibilitatea binecunoscută a aconitazei la ROS, sensibilitatea sa cunoscută la statutul redox în celulă [39] și rolul său cunoscut ca proteină reglatoare de legare a ARNm la alte specii [35-37] oferă, de asemenea, o credință suplimentară. la ipoteza că aconitaza poate fi implicată în reglarea biogenezei GV, poate în capacitatea sa de proteină de legare a ARN.

De asemenea, propunem ipoteza că legăturile dintre oligoelemente (Fe 2+ și Mn 2+ ) și producția de vezicule de gaz notate în rezultate pot reprezenta, de asemenea, o legătură cu funcția aconitazei. Se știe că funcțiile ciclului TCA ale aconitazei necesită coordonarea fierului în locul activ al enzimei. Cu toate acestea, în alte organisme, s-a arătat că aconitaza comută între funcția sa de catalizator al ciclului TCA și o proteină de legare a acidului nucleic sensibilă la fier și la oxigen [35-37, 40]. Condițiile bogate în fier și oxigen favorizează funcția ciclului TCA, în timp ce o conversie într-o formă de legare a acidului nucleic este favorizată în condițiile sărace de fier și oxigen. Folosind programul SIRE [41], am descoperit un element care răspunde la fier (IRE) – o structură în ac de păr legată de aconitază în rolul său de însoțitor ARN – chiar în aval de gvpK2.

Multe probe individuale indică aconitaza ca un potențial un jucător suplimentar important în reglarea biogenezei GV, servind probabil ca un integrator al semnalelor metabolice și de mediu care participă activ la reglare prin legarea de oxigen, metabolit și ARN dependent de fier. Deși această ipoteză este plauzibilă având în vedere toate dovezile circumstanțiale crescânde ale rolului aconitazei în biogeneza GV, confirmarea așteaptă în mod clar experimente și analize suplimentare.

4.3. Integrarea atât a activității Aconitase, cât și a TbpD într-un model de reglementare a GV

Integrarea rolurilor aconitazei și TbpD în modelul de reglare a biogenezei GV este încă o provocare, având în vedere datele disponibile. Cu toate acestea, propunem o ipoteză, în concordanță cu datele discutate mai sus, care poate stimula proiectarea experimentelor viitoare și, în cele din urmă, ne poate rafina înțelegerea biogenezei GV. În primul rând, ca și în cazul aconitazei în alte organisme, postulăm că aconitaza în Halobacterium salinarum NRC-1 poate funcționa ca un chaperon ARN pentru a regla posttranscripțional biogeneza GV prin legarea unui element asemănător IRE sau IRE. În timp ce ținta specifică a aconitazei este necunoscută, se presupune că legarea de ARN facilitează traducerea țintei, poate chiar transcrierile GV. Ca și în alte sisteme, comutarea activității aconitazei în Halobacterium salinarum NRC-1 între enzima ciclului TCA și proteina de legare a ARN este probabil mediată și de factori de mediu cum ar fi fierul și oxigenul, în care funcția de legare a ARN este favorizată în condiții de concentrație scăzută de oxigen, concentrație mare de specii ROS și/sau limitare a fierului. Dacă Halobacterium salinarum Aconitaza NRC-1 are o sensibilitate similară la factorii de mediu, apoi ar fi condusă la legarea ARN în condiții de oxigen scăzut. În astfel de condiții, ar putea servi drept însoțitor pentru traducerea transcriptului GV, în concordanță cu ipoteza că condițiile microaerobe sau anaerobe par să conducă biosinteza GV și că o parte a acestui proces este modulată posttranscripțional. Dacă aconitaza îndeplinește un astfel de rol și expresia, stabilitatea sau activitatea aconitazei pot fi, de asemenea, modulate în continuare de prezența citratului sau izocitratului, acest lucru ar putea ajuta și la explicarea observațiilor lui Hechler și Pfeifer [1].

O ipoteză simplă pentru rolul TbpD, în concordanță cu datele actuale, este de a propune că TbpD acționează prin interacțiuni proteină-proteină pentru a modula activitatea unui regulator transcripțional încă nespecificat. Teufel și Pfeifer au prezentat recent in vitro date care arată că TbpD poate interacționa fizic cu activatorul GvpE [42]. În timp ce aceasta a fost prezentată ca dovadă că TbpD ar putea fi capabil să interacționeze cu GvpE la promotori pentru a iniția transcripția, o interpretare alternativă ar fi propunerea că TbpD concurează cu un alternativ, activând Tbp pentru legarea GvpE, modulând astfel activitatea eficientă a GvpE. O altă țintă potențială pentru TbpD ar putea fi, de asemenea, unul sau mai multe dintre potențialele Tbps de activare Halobacterium salinarum NRC-1. Facciotti şi colab. au prezentat date co-IP care arată că TbpD poate fi foarte promiscuu în interacțiunile sale cu Tbps alternativi în Halobacterium salinarum NRC-1, interacționând cu factorii generali de transcripție TbpA, TbpB, TbpE, TbpF și TfbC [43]. Formarea dimerului Tbp a fost deja demonstrată cu Tbps eucariote [44–46] și se crede că este un mecanism pentru reglarea fondului de Tbp disponibil. O combinație a celor două scheme anterioare ar putea, de asemenea, modula activitatea GvpE printr-un mecanism în care TbpD interacționează cu hetero sau homodimeri ai Tbps care activează alternativ. Desigur, alți autorități de reglementare pot fi, de asemenea, ținte ale activității TbpD.

Acest tip de activitate funcțională ar putea explica cu ușurință observațiile despre expresia non-nativă TbpD și experimentele de perturbare knockout notate mai devreme. Supraexprimarea TbpD are ca rezultat o reglare severă a aconitazei și a transcriptelor GV. Acest lucru ar putea fi realizat prin atenuarea funcțională a unui regulator transcripțional prin interacțiune fizică. De asemenea, supraexpresia aparentă a genelor în aval de promotorul pF, gvpF,G,H,I,J,K,L și M (vng5019g-vng5027g), ar putea fi explicată prin lipsa activității modulate a țintei de reglementare în tulpina TbpD-knockout. Verificarea acestui tip de activitate pentru TbpD ar ajuta, de asemenea, să arunce mai multă lumină asupra rolurilor funcționale ale multiplicității proteinelor Tbp în unele dintre arhee.

5. Concluzie

În ciuda faptului că inputurile de mediu și de reglementare care controlează biogeneza GV nu sunt încă complet elucidate, ceea ce apare în mod clar este ideea că procesul este foarte sensibil la mici perturbații de mediu care pot fi introduse atât de către experimentator, cât și în mediul natural, de mediu. Reglarea biosintezei GV este în mod clar multidimensională, implicând factori de mediu cum ar fi concentrația de oxigen dizolvat, disponibilitatea nutrienților specifici (adică, citrat, izocitrat, arginină), regulatori transcripționali specifici (GvpE)., GvpD, TbpD și, probabil, mai mulți omologi tfIIB) și poate chiar activitatea enzimei ciclului TCA cu funcție dublă/proteina de legare a ARN aconitazei. În timp ce rolurile specifice ale tuturor influențelor de reglementare, atât directe, cât și indirecte, nu sunt încă cunoscute, grupul de posibili candidați devine din ce în ce mai bine definit. Acest lucru sugerează că raportarea descrierilor detaliate ale configurației experimentale este esențială pentru interpretarea datelor legate de biogeneza GV și că unele măsurători ale disponibilității nutrienților și ale concentrației de oxigen ar trebui fie măsurate în mod explicit, fie controlate strict în experimentele viitoare. Propunem ca, datorită naturii multidimensionale a biogenezei GV și a reglării acesteia, acest sistem poate oferi de fapt un sistem experimental bun în care să se studieze principiile biologice ale integrării semnalelor de mediu și genetice care apar atât transcripțional, cât și posttranscripțional pentru asamblarea de complexe intracelulare. structurilor.

Confirmare

Această lucrare a fost finanțată prin fonduri de pornire pentru MTF.

Referințe

  1. T. Hechler și F. Pfeifer, „Anaerobioza inhibă formarea veziculelor de gaz în Archaea halofilă”, Microbiologie moleculară, vol. 71, nr. 1, pp. 132–145, 2009. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  2. C. Englert, K. Kruger, S. Offner și F. Pfeifer, „Trei grupuri de gene diferite, dar înrudite, care codifică vezicule de gaz în archaea halofilă,” Jurnalul de Biologie Moleculară, vol. 227, nr. 2, pp. 586–592, 1992. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  3. W. V. Ng, S. P. Kennedy, G. G. Mahairas et al., „Genome sequence of Halobacterium specia NRC-1,” Proceedings of the National Academy of Sciences din Statele Unite ale Americii, vol. 97, nr. 22, p. 12176–12181, 2000. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  4. L. J. Chu, M. C. Chen, J. Setter et al., „New structural proteins of Halobacterium salinarum veziculă de gaz dezvăluită prin analiza proteomică comparativă”, Journal of Proteome Research, vol. 10, nr. 3, pp. 1170–1178, 2011. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  5. S. DasSarma, P. Arora, F. Lin, E. Molinari și L. R. S. Yin, „Formarea veziculelor de gaz de tip sălbatic necesită cel puțin zece gene în grupul de gene gvp al Halobacterium halobium plasmida pNRC100,” Jurnalul de bacteriologie, vol. 176, nr. 24, pp. 7646–7652, 1994. Vizualizare la: Google Scholar
  6. S. Offner, A. Hofacker, G. Wanner și F. Pfeifer, „Opt din paisprezece gene gyp sunt suficiente pentru formarea veziculelor de gaz în arheile halofile,” Jurnalul de bacteriologie, vol. 182, nr. 15, pp. 4328–4336, 2000. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  7. S. J. Beard, P. K. Hayes și A. E. Walsby, „Concurența de creștere între Halobacterium salinarium tulpina PHH1 și mutanții afectați în sinteza veziculelor gazoase”, Microbiologie, vol. 143, nr. 2, pp. 467–473, 1997. Vizualizare la: Google Scholar
  8. C. F. Yang și S. DasSarma, „Inducerea transcripțională a membranei violete și a sintezei veziculelor de gaz în archaebacterium Halobacterium halobium este blocat de un inhibitor de ADN-girază”, Jurnalul de bacteriologie, vol. 172, nr. 7, pp. 4118–4121, 1990. Vizualizare la: Google Scholar
  9. J. A. Müller și S. DasSarma, „Genomic analysis of anaerobic respiration in the archaeon Halobacterium sp. tulpina NRC-1: dimetil sulfoxid și N-oxid de trimetilamină ca acceptori terminali de electroni. Jurnalul de bacteriologie, vol. 187, nr. 5, pp. 1659–1667, 2005. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  10. A. K. Schmid, D. J. Reiss, A. Kaur et al., „Anatomia tranzițiilor stării celulelor microbiene ca răspuns la oxigen”, Cercetarea genomului, vol. 17, nr. 10, pp. 1399–1413, 2007. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  11. R. F. Shand și M. C. Betlach, „Exprimarea grupului de gene bop a Halobacterium halobium este indusă de tensiunea scăzută a oxigenului și de lumină.” Jurnalul de bacteriologie, vol. 173, nr. 15, pp. 4692–4699, 1991. Vizualizare la: Google Scholar
  12. M. T. Facciotti, W. L. Pang, F. Y. Lo et al., „Reajustarea fiziologică la scară largă în timpul creșterii permite o analiză rapidă, cuprinzătoare și ieftină a sistemelor” Biologia sistemelor BMC, vol. 4, articolul 64, 2010. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  13. T. Hechler, M. Frech și F. Pfeifer, „Glucoza inhibă formarea veziculelor de gaz în Haloferax volcanii transformanți,” Microbiologia mediului, vol. 10, nr. 1, pp. 20–30, 2008. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  14. A. Kaur, P. T. Van, C. R. Busch et al., „Coordonarea mecanismelor de apărare în primă linie în condiții de stres oxidativ sever”, Biologia sistemelor moleculare, vol. 6, articolul 393, 2010. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  15. S. Offner, U. Ziese, G. Wanner, D. Typke și F. Pfeifer, „Caracteristicile structurale ale veziculelor de gaz halobacterian”, Microbiologie, vol. 144, partea 5, pp. 1331–1342, 1998. Vizualizare la: Google Scholar
  16. A. E. Walsby, „Vezicule de gaz”, Recenzii microbiologice, vol. 58, nr. 1, pp. 94–144, 1994. Vizualizare la: Google Scholar
  17. A. E. Walsby, „Relațiile de presiune ale vacuolelor de gaz”, Proceedings of the Royal Society of London. Seria B, Științe Biologice, vol. 178, pp. 301–326, 1971. Vizualizare la: Google Scholar
  18. D. Oesterhelt și W. Stoeckenius, „Izolarea membranei celulare a Halobacterium halobium și fracționarea sa în membrană roșie și violetă,” Metode în Enzimologie, vol. 31, nr. C, pp. 667–678, 1974. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  19. B. Tummers III, „DataThief III. Software-ul shareware DataThief III”, 2009, http://datathief.org/. Vizualizați la: Google Scholar
  20. M. D. Abràmoff, P. J. Magalh฾s și S. J. Ram, „Procesarea imaginii cu imageJ”, Biofotonica Internationala, vol. 11, nr. 7, pp. 36–43, 2004. Vizualizare la: Google Scholar
  21. G. Cohen-Bazire, R. Kunisawa și N. Pfennig, „Studiu comparat al structurii vacuolelor de gaz”, Jurnalul de bacteriologie, vol. 100, nr. 2, pp. 1049–1061, 1969. Vizualizare la: Google Scholar
  22. F.T. Robb, Halofili, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY, SUA, 1995.
  23. F. Pfeifer, D. Gregor, A. Hofacker, P. Plö෾r și P. Zimmermann, „Regulation of gas vesicle formation in halophilic archaea,” Jurnal de Microbiologie Moleculară și Biotehnologie, vol. 4, nr. 3, pp. 175–181, 2002. Vizualizare la: Google Scholar
  24. T. E. Creighton, Proteine: Structuri și proprietăți moleculare, W. H. Freeman, New York, NY, SUA, 1993.
  25. A. E. Walsby și R. E. Armstrong, „Grosimea medie a peretelui veziculelor de gaz în Anabaena flos-aquae,” Jurnalul de Biologie Moleculară, vol. 129, nr. 2, pp. 279–285, 1979. Vizualizare la: Google Scholar
  26. R. D. Simon, „Electroforeza pe gel de acrilamidă a proteinelor hidrofobe: proteina vacuolei gazoase”, Electroforeză, vol. 1, pp. 172–176, 1980. Vizualizare la: Google Scholar
  27. B. Surek, B. Pillay, U. Rdest, K. Beyreuther și W. Goebel, „Evidence for two different gas vesicle proteins and genes in Halobacterium halobium,” Jurnalul de bacteriologie, vol. 170, nr. 4, pp. 1746–1751, 1988. Vizualizare la: Google Scholar
  28. W. Stoeckenius și W. H. Kunau, „Caracterizarea ulterioară a fracțiilor de particule din plicurile de celule lizate ale Halobacterium halobium și izolarea membranelor vacuole de gaz,” Jurnalul de biologie celulară, vol. 38, nr. 2, pp. 337–357, 1968. Vizualizare la: Google Scholar
  29. S. Dassarma, J. T. Halladay, J. G. Jones, J. W. Donovan, P. J. Giannasca și N. T. de Marsac, „High-frequency mutations in a plasmid-encoded gas vesicle gene in Halobacterium halobium,” Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, vol. 85, pp. 6861–6865, 1988. Vizualizare la: Google Scholar
  30. A. Hofacker, K. M. Schmitz, A. Cichonczyk, S. Sartorious-Neef și F. Pfeifer, „Reglarea transcripției mediată de GvpE și GvpD a genelor p-gvp care codifică veziculele de gaz în Halobacterium salinarum,” Microbiologie, vol. 150, nr. 6, pp. 1829–1838, 2004. Vizualizare la: Google Scholar
  31. J. A. Coker și S. DasSarma, „Analiza genetică și transcriptomică a genelor factorului de transcripție în modelul Archaeon halofil: acțiunea coordonată a TbpD și TfbA,” BMC Genetica, vol. 8, articolul 61, 2007. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  32. S. Offner și F. Pfeifer, „Studii de completare cu regiunea p-vac care codifică vezicule de gaz a Halobacterium salinarium PHH1 dezvăluie un rol de reglementare pentru genele p-gvpDE. Microbiologie moleculară, vol. 16, nr. 1, pp. 9–19, 1995. Vizualizare la: Google Scholar
  33. K. Teufel, A. Bleiholder, T. Griesbach și F. Pfeifer, „Variations in the multiple tbp genes in different Halobacterium salinarum tulpini și expresia lor în timpul creșterii,” Arhivele de microbiologie, vol. 190, nr. 3, pp. 309–318, 2008. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  34. P. H. Viollier, K. T. Nguyen, W. Minas, M. Folcher, G. E. Dale și C. J. Thompson, „Rolul aconitazei în creștere, metabolism și diferențiere morfologică a Streptomyces coelicolor,” Jurnalul de bacteriologie, vol. 183, nr. 10, pp. 3193–3203, 2001. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  35. S. Banerjee, A. K. Nandyala, P. Raviprasad, N. Ahmed și S. E. Hasnain, „Activitatea de legare a ARN dependentă de fier a Mycobacterium tuberculosis aconitase,” Jurnalul de bacteriologie, vol. 189, nr. 11, pp. 4046–4052, 2007. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  36. Y. Tang și J. R. Guest, „Dovezi directe pentru legarea mRNA și reglarea post-transcripțională de către Escherichia coli aconitase,” Microbiologie, vol. 145, partea 11, pp. 3069–3079, 1999. Vizualizare la: Google Scholar
  37. C. Alén și A. L. Sonenshein, „Bacillus subtilis aconitase is an ARN-binding protein”, Proceedings of the National Academy of Sciences din Statele Unite ale Americii, vol. 96, nr. 18, pp. 10412–10417, 1999. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  38. G. S. Shadel, „ADN mitocondrial, aconitaza ‘învelește’,” Tendințe în științe biochimice, vol. 30, nr. 6, pp. 294–296, 2005. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  39. A. L. Bulteau, M. Ikeda-Saito și L. I. Szweda, „Modularea dependentă de redox a activității aconitazei în mitocondriile intacte”, Biochimie, vol. 42, nr. 50, pp. 14846–14855, 2003. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  40. DJ Haile, TA Rouault, CK Tang, J. Chin, JB Harford și RD Klausner, „Controlul reciproc al legăturii ARN și al activității aconitazei în reglarea proteinei de legare a elementelor sensibile la fier: rolul grupului fier-sulf, ” Proceedings of the National Academy of Sciences din Statele Unite ale Americii, vol. 89, nr. 16, pp. 7536–7540, 1992. Vizualizare la: Google Scholar
  41. M. Campillos, I. Cases, M. W. Hentze și M. Sanchez, „SIREs: searching for iron-responsive elements,” Cercetarea acizilor nucleici, vol. 38, nr. 2, pp. W360–W367, 2010. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  42. K. Teufel și F. Pfeifer, „Interacțiunea activatorului de transcripție GvpE cu proteinele de legare a casetei TATA ale Halobacterium salinarum,” Arhivele de microbiologie, vol. 192, nr. 2, pp. 143–149, 2010. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  43. M. T. Facciotti, D. J. Reiss, M. Pan și colab., „Factor de transcripție generală a specificat reglarea globală a genelor în archaea”, Proceedings of the National Academy of Sciences din Statele Unite ale Americii, vol. 104, nr. 11, pp. 4630–4635, 2007. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  44. K. M. Campbell, R. T. Ranallo, L. A. Stargell și K. J. Lumb, „Reevaluarea reglementării transcripționale prin oligomerizarea proteinei care leagă TATA: predominanța monomerilor”, Biochimie, vol. 39, nr. 10, pp. 2633–2638, 2000. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  45. C. Chitikila, K. L. Huisinga, J. D. Irvin, A. D. Basehoar și B. F. Pugh, „Interacțiunea inhibitorilor TBP în controlul transcripțional global”, Celula Moleculară, vol. 10, nr. 4, pp. 871–882, 2002. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic
  46. H. Kou și B. F. Pugh, „Inginerie mutații stabilizatoare de dimeri în proteina de legare a TATA”, Jurnalul de chimie biologică, vol. 279, nr. 20, pp. 20966–20973, 2004. Vizualizare la: Site-ul editorului | Google Academic

Drepturi de autor

Copyright © 2011 Andrew I. Yao și Marc T. Facciotti. Acesta este un articol cu ​​acces deschis distribuit sub Licența de atribuire Creative Commons, care permite utilizarea, distribuirea și reproducerea nerestricții pe orice mediu, cu condiția ca lucrarea originală să fie citată corespunzător.


Clusterul de gene a veziculelor de gaz de la Microcystis aeruginosa și rearanjamentele ADN care duc la pierderea flotabilității celulare

FIG. 1 . The gvp regiunea clusterului de gene în M. aeruginosa și IS găsit la mutanții cu deficit de GV. (A) Tulpina PCC 7806 (B) Tulpina PCC 9354. De sus în jos, nume și dimensiuni ale IS, localizări ale inserțiilor, numele genelor presupuse, hărți ale ORF-urilor și orientările lor și regiunile intergenice (ig) în perechi de baze (bp). Săgeți, ORF-uri săgeți și linii negre, regiuni secvențiate săgeți și linii cu umbrire gri, regiuni nesecvențiate. Locațiile precise (în raport cu secvența transmisă la DDBJ/EMBL/GenBank sub nr. AJ577136) ale elementelor de inserție sunt următoarele: între nucleotidele 115 și 2206 pentru ISMae1, între nucleotidele 4033 și 4034 pentru ISMae2, între nucleotidele 7633 și 7634 pentru ISMae3şi între nucleotidele 8301 şi 8302 pentru ISMae4. FIG. 2 . Analiza transcripției gvp cluster. (A) Analiza ARN blot a gvpA, gvpC, și rnpB transcrieri din M. aeruginosa PCC 7806 a crescut sub un ciclu zi-noapte (16 h-8 h). Celulele au fost recoltate pentru extracția ARN după 1 oră de lumină când cultura a atins OD750 = 0,4. Aceeași pată (15 μg de ARN total pe bandă) a fost hibridizat succesiv cu diferite sonde: un 180 bp gvpA fragment (obținut prin amplificare PCR cu primerii 635 și 636), un 400 bp gvpC fragment (amplificat cu primerii 870 și 871) și (ca control pentru încărcarea și transferul ARN) un 0,6 kb rnpB fragment (obținut prin PCR cu primerii menționați în Materiale și Metode). Dimensiunile diferitelor transcrieri sunt indicate în kilobaze (kb). (B) Analiza RT-PCR care arată cotranscripția între genele gvp cluster. The gvpC-N fragmentul a fost amplificat cu primerii 893 și 973, the gvpN-J fragmentul a fost amplificat cu primerii 975 și 1108, the gvpJ-X fragmentul a fost amplificat cu primerii 974 și 1110, the gvpX-K fragmentul a fost amplificat cu primerii 978 și 1109, the gvpK-F fragmentul a fost amplificat cu primerii 1111 și 1113, the gvpF-G fragmentul a fost amplificat cu primerii 965 și 1018 și gvpK-G fragmentul a fost amplificat cu primerii 965 și 1111. s, probă analizată (cu ADNc ca șablon) −, control negativ (cu ARN ca șablon) +, control pozitiv (cu ADN genomic ca șablon). O scară ADN (100 bp [Amersham Biosciences] sau 1 kb [Invitrogen Life Technologies]) a fost folosită ca marcator de dimensiune (bande M). FIG. 3 . Detectarea IS prin analiza PCR a gvp regiunea de tip sălbatic (WT) și tulpinile mutante cu deficit de GV (M1, M2, M3 și M4) ale M. aeruginosa. Primerii utilizați pentru amplificare (vezi Tabelul 1) au fost următorii: primerii 1006 și 1017 pentru 5′ gvpAeu-5′ gvpC regiune, primerii 1081 și 1082 pentru gvpV, primerii 949 si 972 pentru gvpNşi primerii 983 şi 1077 pentru gvpW. O scară ADN de 1 kb (Invitrogen Life Technologies) a fost folosită ca marcator de dimensiune (bande M). FIG. 4 . Analiza transcripției gvp genele de tip sălbatic și tulpinile mutante cu deficit de GV ale M. aeruginosa. (A) RT-PCR cu gvpA-primerii specifici 994 si 995 (vezi Tabelul 1). Sunt prezentate rezultatele pentru tulpinile PCC 7806 de tip sălbatic (WT) și mutante (M2 și M3) și tulpinile PCC 9354 de tip sălbatic și mutante (M4). (B) Rezultatele RT-PCR pentru cele trei gene care poartă un IS (gvpN, gvpV, și gvpW) si pentru gvpJ și gvpX. Sunt prezentate rezultatele pentru tulpinile PCC 7806 de tip sălbatic (WT) și mutante (M3 și M2) și tulpinile PCC 9354 de tip sălbatic și mutante (M4). The gvpV gena a fost amplificată cu primerii 1081 și 1082, gvpN a fost amplificat cu primerii 949 și 972, gvpJ a fost amplificat cu primerii 974 și 975, gvpX a fost amplificată cu primerii 1109 și 1110 și gvpW a fost amplificată cu primerii 983 și 1077. O scară de ADN (100 pb [Amersham Biosciences] sau 1 kb [Invitrogen Life Technologies]) a fost folosită ca marker de dimensiune (bande). M). FIG. 5 . Imunodetecția GvpA pe GV izolate și extracte celulare din tulpinile mutante de tip sălbatic și cu deficit de GV ale M. aeruginosa. GV, fracțiune GV îmbogățită (20 μg) din tulpina de tip sălbatic PCC 7806. Alte benzi arată rezultatele pentru extractele brute (200 μg) din tulpinile PCC 7806 de tip sălbatic (WT) și mutante (M1, M2 și M3) și din tulpinile PCC 9354 de tip sălbatic și mutante (M4). FIG. 6 . Micrografii electronice ale tulpinilor de tip sălbatic (A și E) și ale tulpinilor mutante cu deficit de GV (B, C, D și F) ale M. aeruginosa. (A) PCC 7806 tip sălbatic (B) PCC 7806 M1 (C) PCC 7806 M2 (D) PCC 7806 M3 (E) PCC 9354 tip sălbatic (F) PCC 9354 M4. gv-l, GV în secțiune longitudinală gv-c, GV în secțiune transversală. Bare, 500 nm.

4.6E: Vezicule de gaz - Biologie

1. O compoziţie cuprinzând vezicule de gaz recombinat substanţial pure cuprinzând o peptidă selectată inserată în cadru într-o proteină structurală a respectivei vezicule de gaz recombinant, respectiva compoziţie, atunci când este injectată într-un mamifer, determină anticorpi care leagă în mod specific respectiva peptidă selectată.

2. Compoziţie conform revendicării 1, în care respectiva peptidă este derivată dintr-un agent patogen.

3. Compoziţie conform revendicării 5, caracterizată prin aceea că respectiva proteină de înveliş viral este gp120.

4. Compoziţie conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că respectiva veziculă de gaz este o veziculă de gaz Halobacterium halobium.

5. Compoziţie conform revendicării 2, în care peptida menţionată este derivată dintr-o proteină de înveliş viral.

6. Compoziţie conform revendicării 4, în care peptida menţionată este inserată în proteina gvpC.

7. Compoziţie conform revendicării 4, în care peptida menţionată este inserată în proteina gvpA.

8. O metodă pentru a produce, la un mamifer non-uman, anticorpi care leagă în mod specific o peptidă selectată, metoda menţionată cuprinzând:

injectarea în respectivul mamifer a unor vezicule de gaz recombinant substanţial pur cuprinzând o peptidă selectată inserată în cadru într-o proteină de suprafaţă a respectivei vezicule de gaz recombinat, în care mamiferul menţionat produce anticorpi care leagă în mod specific respectiva peptidă selectată.

9. Metodă conform revendicării 8, în care veziculele de gaz recombinat menţionate cuprind vezicule de gaz recombinat distincte, fiecare cuprinzând o peptidă selectată diferită.

10. Metodă conform revendicării 8, în care veziculele gazoase menţionate cuprind cel puţin două peptide selectate.

REFERINȚĂ ÎN CRUCE LA APLICAREA AFERĂ

Această cerere revendică beneficiul cererii provizorii Ser. nr. 60/008.200, depus la 5 decembrie 1995.

FUNDAMENTALUL INVENŢIEI

Invenţia se referă la vezicule de gaz recombinat şi la utilizările acestora.

Vaccinurile tradiționale constau din agenți patogeni uciși sau atenuați sau din toxinele izolate ale acestora și includ în mod normal o varietate de epitopi. Cu toate acestea, se știe de mult timp că porțiuni de molecule pot fi recunoscute de sistemul imunitar și că anticorpii dezvoltați împotriva epitopului(i) corespunzător(i) pot avea ca rezultat imunitate protectoare. Ca rezultat, a existat un interes considerabil pentru dezvoltarea de vaccinuri compuse din mai puțin de întregul agent patogen. Vaccinurile subunităților, care includ toată sau o parte a unei subunități proteice a organismului infecțios, și vaccinurile peptidice sunt exemple de astfel de vaccinuri. Imunogenii vaccinurilor cu subunități și peptide nu sunt în mod obișnuit suficient de imunogeni decât dacă sunt administrați împreună cu un adjuvant sau sunt legați încrucișați la o proteină cu greutate moleculară mare, cum ar fi hemocianina de lapa la cheie (KLH).

Dorința de a utiliza vaccinuri care nu implică administrarea de agenți patogeni uciși sau atenuați a condus la dezvoltarea unor sisteme de vaccinare specializate. Printre aceste sisteme mai noi se numără sistemele conjugate/purtător care sunt concepute pentru a îmbunătăți imunogenitatea și livrarea antigenelor mai mici prin asocierea fizică, adesea prin mijloace chimice, a componentelor epitop și purtător/adjuvant produse separat. Sistemele recombinante în care imunogenul este produs ca parte a unei molecule himerice mai mari reprezintă o a doua abordare pentru îmbunătățirea imunogenității și livrarea imunogenilor. Livrarea directă a ADN-ului reprezintă un alt sistem de vaccinare netradițional.

Lipozomii și microbilele au fost sugerate ca sisteme conjugate/purtător. Deoarece lipozomii au capacitatea de a fuziona cu membranele biologice, ei au fost testați în administrarea orală a unei varietăți de alți imunogeni (Rouse, J. Am. Vet. Med. Assoc. 181:988-991, 1982 Childers și colab., Regional Immunol. 3:289-296, 1991). Ca alternativă, antigenele au fost încorporate în microbile sintetice, degradabile, despre care se crede că stimulează sistemul imunitar și eliberează molecule ca entități sub formă de particule. Acest sistem de livrare poate fi adaptat să conţină adjuvant şi/sau citokine încorporate. Mai mult, microbilele pot fi proiectate pentru a asigura o eliberare secvenţială de antigen prin biodegradarea temporizată a particulei. (O'Hagan şi colab., Vaccine 9:768, 1991 O'Hagan şi colab., Immunology 73:239, 1991). În plus, straturile S bacteriene au fost, de asemenea, studiate ca vehicule conjugate/purtători. Deoarece spațierea lor naturală de repetare oferă o matrice geometrică definită, reticulare chimică a imunogenului(i) la acest purtător are ca rezultat afișarea epitopilor la intervale cunoscute și densități definite (Herzenberg și colab., J. Exp. Med. 155:1730, 1982 Schneersson şi colab., Infect. & Immun. 52:519, 1986 Schultze şi colab., J. Immunol., 135:2319, 1987 Schultze şi colab., J. Immunol., 135:2319, 1987 Russell şi colab. , Infect. & Immun. 59:4061, 1991).

Vaccinurile recombinante reprezintă un al doilea tip de sistem de vaccinare netradițional. Vaccinurile recombinante implică modificarea genetică a imunogenului și a purtătorului său asociat, care poate fi un agent patogen atenuat, ca o singură unitate himerică. Folosind această abordare largă, capsida virală și bacteriofagul recombinant au fost concepute pentru a afișa peptide pe suprafața lor (Notkins și colab., Science 228:737, 1985 Smith, Science 228:1315, 1985 Clarke și colab., Nature 330:381, 1987). Dedieu şi colab., J. Virol. 66:3161, 1992). Unele vaccinuri recombinate utilizează bacterii vii, atenuate pentru a elibera un antigen exogen (Schodel şi colab., Infect. Immun. 62:1669, 1994 Fairweather şi colab., Infect. & Immunol. 58:1323, 1990 Sutter şi colab., Proc. Nat'l Acad. Sci.89:10847, 1992 Scheiflinger şi colab., J. Bacteriol. 174:595, 1992 Andino şi colab., Science 265:1448, 1995).

Vaccinurile recombinante pot fi capabile să servească drept vehicule de eliberare a antigenului multivalent capabile de utilizare repetată. Cu toate acestea, pot exista dezavantaje semnificative asociate cu utilizarea acestor vaccinuri recombinate. În primul rând, este posibil ca expunerea ulterioară a gazdelor vaccinate la astfel de purtători să poată duce la reacții imunologice severe din cauza sensibilizării la purtător. În al doilea rând, atunci când sunt utilizați agenți patogeni atenuați, recombinarea genetică poate reprezenta o amenințare pe termen lung de reactivare a tulpinii atenuate. În cele din urmă, cheltuiala culturii celulare și nevoia de recombinanți viabile în cantități mari, pot face ca programele de vaccinare la scară largă să fie prohibitiv de costisitoare.

Imunizarea mediată de ADN reprezintă o a treia abordare netradițională a vaccinării. În această abordare, ADN-ul care codifică antigenul relevant este introdus direct sau indirect în individul care este imunizat. De exemplu, secvențele de ADN relevante pot fi inserate într-o plasmidă care este purtată de bacterii. ADN-ul plasmidic este preluat de celulele eucariote, iar mașina biosintetică a acestei gazde este apoi cooptată pentru a produce proteina(ele) codificate (vezi, de exemplu, Ulmer și colab., Science 259:1745, 1993 Sizemore și colab., Science). 270:299-302, 1995). Barry şi colab. (Nature 377:632-635, 1995) dezvăluie o abordare diferită a imunizării genetice la care se face referire ca „imunizare în bibliotecă de expresie”. În imunizarea cu bibliotecă de expresie, o bibliotecă de expresie de secvențe ADN multiple care definesc un anumit patogen este preparată și utilizată prin imunizare genetică pentru a stimula un răspuns imun protector. Această abordare, în teorie, permite expunerea unei gazde la o serie de antigeni patogeni fără riscurile concomitente asociate în mod normal cu utilizarea agentului patogen în sine. Ca și în cazul oricărei utilizări a ADN-ului în sine, trebuie luată în considerare integrarea sa potențială în genomul gazdă și perturbarea funcției normale a genei.

Invenţia prezintă o compoziţie care include vezicule de gaz recombinant substanţial pure care au cel puţin o peptidă heterologă inserată în cel puţin o proteină structurală a veziculelor de gaz. Veziculele de gaz recombinat, atunci când sunt administrate unui mamifer, sunt capabile să declanșeze anticorpi care se leagă în mod specific la peptida heterologă. Peptida heterologă poate fi orice peptidă împotriva căreia se dorește să crească anticorpi, de exemplu, o peptidă găsită în proteina gp120 a virusului imunodeficienței umane (HIV). De preferinţă, proteina structurală a veziculei gazoase este o proteină înrudită cu gvpA sau înrudită cu gvpc.

Prin "peptidă derivată de la" un anumit organism sau proteină se înţelege o peptidă având o secvenţă care este aceeaşi cu toată sau o parte a unei proteine ​​găsite în acel organism sau proteină.

Prin „proteină înrudită cu gvpA” se înţelege o proteină care este atât omoloagă, cât şi echivalentă funcţional cu proteina gvpA a Halobacterium halobium. Prin „proteină înrudită cu gvpC” se înţelege o proteină care este atât omoloagă, cât şi echivalentă funcţional cu proteina gvpc a Halobacterium halobium. Proteinele preferate pentru inserarea peptidelor sunt proteina gvpA sau gvpc a Halobacterium halobium. Veziculele de gaz preferate sunt veziculele de gaz de Halobacterium halobium.

Peptida heterologă este inserată, în cadru, în proteina structurală a veziculei gazoase prin prepararea unei gene himerice. Specialiştii în domeniu pot prepara o moleculă de acid nucleic care codifică peptida de interes. Această moleculă de acid nucleic poate fi inserată într-o genă care codifică o proteină structurală a veziculelor de gaz pentru a prepara o genă recombinantă a veziculelor de gaz care codifică proteina veziculelor de gaz cu peptida inserată în cadru.Secvenţa peptidei poate fi bazată pe secvenţa întregii sau a unei părţi a oricărei proteine ​​dorite prezente în molecula sau agentul patogen sau organism la care urmează să fie generaţi anticorpii.

Prin "peptidă" se înţelege orice lanţ de aminoacizi, indiferent de lungime sau modificare post-translaţională, de exemplu, glicozilare sau fosforilare, şi include polipeptide şi proteine. Peptidele preferate pentru inserarea în proteinele veziculelor gazoase au o lungime de cel puţin 50 de aminoacizi, mai preferabil de cel puţin 20 de aminoacizi, chiar mai preferabil de cel puţin 10 aminoacizi. Ele pot avea, de asemenea, cel puțin 7, 6 sau 5 aminoacizi lungi sau chiar cel puțin. Peptidele pot fi, de asemenea, 5 kD sau chiar mai mari.

Prin "substanţial pur" se înţelege un preparat, de exemplu, de vezicule de gaz recombinat, care reprezintă cel puţin 60% în greutate (greutate uscată) materialul de interes, de exemplu, veziculă de gaz recombinat. De preferinţă, preparatul este cel puţin 75%, mai preferabil cel puţin 90%, şi cel mai preferabil cel puţin 99%, în greutate, compusul de interes. Puritatea poate fi măsurată prin orice metodă adecvată, de exemplu, cromatografie pe coloană, electroforeză pe gel de poliacrilamidă sau analiză HPLC. Analiza aminoacizilor este metoda preferată pentru evaluarea purității veziculelor de gaz.

Un anticorp care „se leagă în mod specific” ca peptidă este un anticorp care recunoaşte şi leagă peptida selectată, dar care nu recunoaşte şi nu leagă în mod substanţial alte molecule dintr-o probă, de exemplu, o probă biologică, care include în mod natural peptida selectată. Legarea e specifică poate fi măsurată utilizând un test ELISA în care peptida selectată este utilizată ca antigen.

Prin „proteină structurală” se înțelege o proteină prezentă în veziculele de gaze complete mature. Prin „proteină de suprafață” se înțelege o proteină prezentă pe suprafața externă a veziculelor de gaze complete mature.

Dacă nu se definesc altfel, toți termenii tehnici și științifici utilizați aici au aceeași semnificație pe care o înțelege în mod obișnuit de către o persoană cu calificare obișnuită în domeniul căruia îi aparține această invenție. Deși metode și materiale similare sau echivalente cu cele descrise aici pot fi utilizate în practica sau testarea prezentei invenții, metodele și materialele preferate sunt descrise mai jos. Toate publicațiile, cererile de brevet, brevetele și alte referințe menționate aici sunt încorporate prin referință în întregime. În caz de conflict, prezenta specificație, inclusiv definițiile, va controla. În plus, materialele, metodele și exemplele sunt doar ilustrative și nu sunt destinate să fie limitative.

Alte caracteristici şi avantaje ale invenţiei vor fi evidente din următoarea descriere detaliată şi din revendicări.

SCURTĂ DESCRIERE A DESENELOR

FIG. 1, panoul A este un grafic care ilustrează rezultatele ELISA utilizate pentru a măsura nivelul de anticorpi particulari prezenți în serul șoarecilor la 2 săptămâni după o primă imunizare cu WT-TNP GV. În acest set de experimente, BSA-TNP a fost utilizat ca antigen pentru ELISA.

FIG. 1, panoul B este un grafic care ilustrează rezultatele ELISA utilizate pentru a măsura nivelul anumitor anticorpi prezenți în serul șoarecilor la 2 săptămâni după o primă imunizare cu WT-TNP GV. În acest set de experimente, BSA-TNP a fost utilizat ca antigen pentru ELISA.

FIG. 1, panoul C este un grafic care ilustrează rezultatele ELISA utilizate pentru a măsura nivelul anumitor anticorpi prezenți în serul șoarecilor după o a doua imunizare cu WT-TNP GV. În acest set de experimente, BSA-TNP a fost utilizat ca antigen pentru ELISA.

FIG. 1, panoul D este un grafic care ilustrează rezultatele ELISA utilizate pentru a măsura nivelul de anticorpi particulari prezenți în serul șoarecilor după o a doua imunizare cu WT-TNP GV. În acest set de experimente, BSA-TNP a fost utilizat ca antigen pentru ELISA.

în fig. 1, panouri AD au fost utilizate următoarele simboluri: cercuri umplute: 1 mg WT-TNP GV triunghiuri cu IgM: 0,1 mg WT-TNP GV diamante cu IgM: 1 mg WT GV IgM cercuri deschise: 1 mg WT-TNP GV IgG triunghiuri deschise : 0,1 mg WT-TNP GV IgG triunghiuri deschise: 0,1 mg WT-TNP GV IgG diamante deschise: 1 mg WT GV IgG și pătrate deschise: tampon IgG.

FIG. 2, panoul A este un grafic care ilustrează rezultatele ELISA utilizate pentru a măsura nivelul anumitor anticorpi prezenți în serul șoarecilor la 4 săptămâni după imunizare cu mutant-TNP GV. În acest set de experimente, BSA-TNP a fost utilizat ca antigen pentru ELISA.

FIG. 2, panoul B este un grafic care ilustrează rezultatele ELISA utilizate pentru a măsura nivelul anumitor anticorpi prezenți în serul șoarecilor la 4 săptămâni după imunizare cu mutant-TNP GV. În acest set de experimente, BSA-TNP a fost utilizat ca antigen pentru ELISA.

FIG. 2, panoul C este un grafic care ilustrează rezultatele ELISA utilizate pentru a măsura nivelul anumitor anticorpi prezenți în serul șoarecilor după o a doua imunizare cu mutant-TNP GV. În acest set de experimente, BSA-TNP a fost utilizat ca antigen pentru ELISA.

FIG. 2, panoul D este un grafic care ilustrează rezultatele ELISA utilizate pentru a măsura nivelul anumitor anticorpi prezenți în serul șoarecilor după o a doua imunizare cu mutant-TNP GV. În acest set de experimente, BSA-TNP a fost utilizat ca antigen pentru ELISA.

în fig. 2, panourile A-D, au fost utilizate următoarele simboluri: cercuri umplute: mutant-TNP GV pătrate umplute cu IgM: tampon IgM cercuri deschise: mutant-TNP GV și pătrate deschise: tampon.

FIG. 3, panoul A este un grafic care ilustrează rezultatele ELISA utilizate pentru a măsura nivelul anumitor anticorpi prezenți în serul șoarecilor după o a doua imunizare cu mutant-TNP GV. În acest set de experimente, peptida cu 7 aminoacizi (ESSGTFE) (SEQ ID NO:1) prezentă în GV mutantă a fost utilizată ca antigen pentru ELISA.

FIG. 3, panoul B este un grafic care ilustrează rezultatele ELISA utilizate pentru a măsura nivelul anumitor anticorpi prezenţi în serul şoarecilor după o a doua imunizare cu mutant-TNP GV. În acest set de experimente, peptida cu 7 aminoacizi (ESSGTFE) (SEQ ID NO:1) prezentă în GV mutantă a fost utilizată ca antigen pentru ELISA.

în fig. 3, panourile A și B, au fost utilizate următoarele simboluri: cercuri umplute: mutant-TNP GV pătrate umplute cu IgM: tampon IgM cercuri deschise: mutant-TNP GV și pătrate deschise: tampon.

FIG. 4, panoul A este un grafic care ilustrează rezultatele ELISA utilizate pentru a măsura nivelul de anticorpi particulari prezenți în serul șoarecilor 10d după o reinoculare la 8 luni după imunizarea inițială.

FIG. 4, panoul B este un grafic care ilustrează rezultatele ELISA utilizate pentru a măsura nivelul de anticorpi particulari prezenți în serul șoarecilor 7d după o reinoculare la 8 luni după imunizarea inițială.

FIG. 5, panoul A este un grafic care ilustrează rezultatele ELISA utilizate pentru a măsura nivelul de anticorpi particulari prezenți în serul șoarecilor 17d după o reinoculare la 8 luni după imunizarea inițială.

FIG. 5, panoul B este un grafic care ilustrează rezultatele ELISA utilizate pentru a măsura nivelul de anticorpi particulari prezenți în serul șoarecilor 17d și 39d după o reinoculare la 8 luni după imunizarea inițială.

FIG. 6 este secvența de nucleotide a grupului de gene gvp a Halobacterium halobium (SECV ID NR:2).

Mai jos sunt descrise metode care pot fi utilizate pentru a prepara vezicule de gaz recombinat având o peptidă heterologă inserată în componenta proteică a veziculei.

Pregătirea veziculelor recombinate pentru utilizare în elicitarea anticorpilor include patru etape de bază: (1) inserarea ADN-ului care codifică peptida de interes într-o secvență de codificare a unei proteine ​​​​veziculoase de gaz de halobacterium pentru a crea o proteină de veziculă de gaz himeric (2) transformarea halobacteriumului sau a unora. alte bacterii adecvate capabile să producă vezicule gazoase cu ADN-ul care codifică proteina himerică (3) crescând bacteriile în condiții care permit exprimarea proteinei himerice și formarea veziculelor gazoase și (4) și recoltarea și purificarea veziculelor gazoase.

Cererea de brevet S.U.A. Ser. Nr. 08/271.270 (Vector recombinant și proces pentru flotarea celulelor), acum abandonat, include metode utile legate de veziculele de gaz și este încorporat ca referință.

Introducerea peptidelor heterologe

Orice peptidă selectată, de exemplu, o peptidă a unui agent patogen, poate fi introdusă într-o proteină veziculoasă gazoasă pentru a produce vezicule gazoase recombinate capabile să provoace un răspuns imun la peptida selectată atunci când vezicula este introdusă într-un mamifer. Veziculele de gaz recombinante pot purta o peptidă care se găsește în mod normal în HIV, Plasmodium falciparum, Salmonella typhi, micoplasmă sau orice alt organism patogen. în unele cazuri, poate fi de dorit să se introducă două sau mai multe peptide heterologe într-o singură veziculă gazoasă recombinată. Cele mai multe peptide pot fi derivate din organisme patogene identice sau diferite și pot fi inserate în aceeași proteină veziculoasă gazoasă sau în proteine ​​veziculelor gazoase diferite.

Veziculele de gaz recombinant ale invenţiei pot fi utilizate pentru a prezenta o mare varietate de antigene. Printre peptidele adecvate se numără peptidele derivate din proteina învelișului HIV, în special domeniul principal de neutralizare al HIV (Dedieu și colab., J. Virol. 66:3161, 1992) peptide derivate din glicoproteina D tip 1 a virusului herpes simplex (Notkins și colab. al., Science 228:737, 1985) şi peptide derivate din proteina core-pre-s a virusului hepatitei B (Schodel şi colab., Infect. Immun. 62:1669, 1994). Alte peptide utile pot fi derivate din toxine peptidice produse de agenți patogeni. În general, multe dintre peptidele prezentate de vaccinurile modificate genetic pot fi utilizate. O descriere detaliată a peptidelor utilizate în vaccinurile modificate genetic poate fi găsită în Ciardi şi colab., „Genetic Engineered Vaccines” (Plenum Press, New York, 1992).

Peptida heterologă selectată poate fi inserată într-o proteină structurală a veziculei gazoase în orice locaţie adecvată. Peptida poate fi, de asemenea, plasată la capătul carboxi terminal al proteinei, de exemplu, la capătul carboxi terminal al gvpc sau gvpA. Locaţiile preferate pentru inserare sunt în repetele proteinei gvpc sau ale unei proteine ​​înrudite cu gvpC.

În anumite circumstanţe, poate fi de dorit să se insereze două sau mai multe peptide într-o anumită proteină structurală. Prezența antigenelor multiple poate provoca adesea un răspuns imun mai puternic sau mai protector. Când două sau mai multe peptide sunt inserate într-o singură proteină structurală a veziculei gazoase, ele pot fi derivate din același organism patogen sau dintr-un organism diferit. Când sunt inserate mai multe peptide, ele pot fi inserate în locații diferite în interiorul proteinei structurale a veziculei gazoase sau adiacente una cu cealaltă în aceeași locație. Nu este necesar ca peptidele să fie diferite. Astfel, se pot introduce mai multe copii ale aceleiași peptide într-o proteină structurală a veziculei gazoase.

Veziculele de gaz recombinat pot fi utilizate pentru a crea compoziţii adecvate pentru imunizarea bibliotecii de expresie. În această tehnică, o bibliotecă de fragmente aleatoare de ADN care codifică peptide este preparată și inserată într-una sau mai multe locații selectate într-o moleculă de ADN care codifică o proteină structurală a veziculei gazoase, de exemplu, o plasmidă care poartă grupul de gene gvpMLKJIHGFEDACN de Halobacterium halobium. Acest proces are ca rezultat crearea unei populații de molecule de ADN care pot fi folosite pentru a transforma bacteriile. Clonele rezultate pot fi utilizate pentru producerea de vezicule de gaz recombinat. Prin purificarea veziculelor de gaz dintr-un amestec de clone producătoare de vezicule de gaz, este posibil să se creeze un „cocktail” de vezicule de gaz recombinat care poate fi injectat într-un pacient pentru a provoca un răspuns imun.

Un loc preferat pentru inserarea peptidelor este între V şi E din următoarea secvenţă gvpC a Halobacterium halobium: EADADV INSERTION SITE!EAEAE (SECV ID NR:3).

Prepararea și izolarea veziculelor de gaz recombinante

Simon și colab. (Archaea--A Laboratory Manual--Halophiles, DasSarma et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995) descrie tehnici utile pentru lucrul cu bacterii halofile.

Mijlocul preferat de a induce o celulă bacteriană să producă vezicule de gaz este transformarea celulei cu o plasmidă care poartă grupul de gene gvpMLKJIHGFEDACN de Halobacterium halobium. Plasmidele pNRC100, pJHGV3 şi pFL2 (DasSarma şi colab., J. Bact. 176:7646, 1994) este o plasmidă adecvată care poartă gene necesare pentru exprimarea veziculelor de gaz. Plasmidele pJHGV3 și pFL2 sunt plasmide navetă de H. halobium-Eschericia coli care sunt utile în special pentru prepararea veziculelor de gaz recombinant.

Este de preferat ca plasmida heterologă să fie inserată în gena GvpA sau în gena GvpC care au fost identificate în Haloferax mediterranei (Englert și colab., J. Biol. Chem. 268:9329, 1993), Halobacterium halobium (Halladay și colab. , J. Bateriol. 175:684, 1993) şi alte bacterii (Walsby şi colab., J.Gen. Microbiol., 134:2647, 1990). Walsby (Microbiol. Rev. 58:94, 1994) descrie bacterii care exprimă vezicule gazoase. În unele împrejurări, este de dorit să se creeze situsuri de restricţie adecvate în GvpA, GvpC sau alte proteine ​​veziculoase gazoase. Situri de inserare adecvate, de exemplu, situsuri de restricţie, pot fi generate prin mutageneză direcţionată pe situs. Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, New York, 1994) descrie utilizarea mutagenezei direcționate, precum și o mare varietate de alte tehnici care pot fi utilizate pentru a construi vezicule de gaz recombinant utile în invenție.

H. halobium poate fi cultivat într-un mediu care conține NaCI 4,3M așa cum este descris de DasSarma și colab. (Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:6861, 1988). Secvenţa de nucleotide a grupului de gene gvp de H. halobium este dezvăluită în Halladay (J. Bact. 175:684, 1993). O secvenţă parţială este dezvăluită în Jones şi colab. (Gene 102:117, 1991). FIG. 6 include o secvență a grupului de gene gvp de H. halobium.

H. halobium poate fi transformat utilizând procedura EDTA-polietilen glicol a lui Cline et al. (J. Bateriol. 169:1341, 1987).

Veziculele de gaz recombinante pot provoca un răspuns imun de lungă durată

Veziculele de gaz de tip sălbatic (WT) și peptide-inserate (GV) au fost preparate după cum urmează. Halobacterium halobium SD109(pFL2) (WT GV) și SD109(pFL2C::K1Δ) (GV modificat include inserția de peptidă ESSGTF în gvpc de Halobacterium halobium între V și E ale secvenței EADADVEAE) (SECV ID NR:3) crescut la confluență pe plăci peptonă-sare suplimentate cu 10 μM B mevinoloin. Veziculele de gaz au fost izolate prin plutire accelerată centrifug (Simon şi colab., supra). Randamentul în vezicule de gaz a fost de aproximativ 10 mg/l de plăci (aria suprafeţei plăcii/litru a fost de aproximativ 1134 cm2).

O parte din WT și GV inserat cu peptidă au fost utilizate pentru a prepara WT modificat cu trinitrofenol (TNP) și GV inserat cu peptidă, după cum urmează. Modificarea utilizată a fost efectuată conform procedurii de modificare descrisă de Little și colab. (Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol. 1, pp. 128-133, 1967). Pe scurt, aproximativ 10 mg din fiecare tip de GV au fost incubate cu acid 2,4,6 trinitrobenzen sulfonic peste noapte la temperatura camerei în întuneric. GV-urile au fost apoi purificate prin dializă împotriva PBS (150 mM NaCI 10 mM fosfat, pH 7,5).

Grupuri de șoareci în vârstă de 8 săptămâni (4 per grup) au fost injectați intraperitoneal (aproximativ 0,5 mg/GV per animal) cu vezicule de gaz WT, mutant, WT-TNP sau mutant-TNP. Un grup de șoareci a fost injectat cu PBS ca martor. Serul a fost colectat la 2 săptămâni și la 4 săptămâni după imunizarea primară. Șoarecii au fost apoi stimulați cu 0,5 mg suplimentar de GV. Serul a fost colectat din nou la 10 zile după imunizarea secundară. Injecțiile nu au avut un efect semnificativ asupra creșterii în greutate. Nu au fost observate leziuni la locul injectării.

Răspunsul imun a fost măsurat prin ELISA utilizând fie albumină serică bovină conjugată la TNP (BSA-TNP), fie peptida cu șapte aminoacizi prezentă în GV mutant ca antigen. Peroxidază de hrean IgG anti-șoarece sau peroxidază de hrean IgM anti-șoarece. Rezultatele acestei analize sunt prezentate în fig. 1-3.

FIG. 1 prezintă rezultatele experimentelor în care WT-TNP GV a fost utilizat pentru a imuniza șoarecii și BSA-TNP a fost utilizat ca antigen pentru ELISA. FIG. 1, panourile A și B prezintă rezultatele pentru răspunsul IgM primar de 2 săptămâni și, respectiv, răspunsul IgG primar de 2 săptămâni, în timp ce panourile C și D prezintă răspunsul IgM și IgG secundar (cercuri umplute: 1 mg WT-TNP GV triunghiuri umplute cu IgM: 0,1 mg WT-TNP GV IgM diamante: 1 mg WT GV IgM cercuri deschise: 1 mg WT-TNP GV IgG triunghiuri deschise: 0,1 mg WT-TNP GV IgG triunghiuri deschise: 0,1 mg WT-TNP GV IgG diamante deschise: 1 mg WT GV IgG pătrate deschise: tampon IgG).

FIG. 2 prezintă rezultatele experimentelor în care mutantul-TNP GV a fost utilizat pentru a imuniza șoarecii și BSA-TNP a fost utilizat ca antigen pentru ELISA. FIG. 2, panourile A și B prezintă rezultatele pentru răspunsul IgM primar de 4 săptămâni și, respectiv, răspunsul IgG primar de 4 săptămâni, în timp ce panourile C și D prezintă răspunsul IgM și IgG secundar (cercuri umplute: pătrate umplute cu IgM mutant-TNP GV: tampon IgM cercuri deschise: mutant-TNP GV pătrate deschise: tampon).

FIG. 3 ilustrează rezultatele experimentelor în mutantul-TNP GV au fost utilizate pentru a imuniza șoarecii și peptida cu 7 aminoacizi (ESSGTFE) (SEQ ID NR:1) prezentă în mutantul GV a fost utilizată ca antigen pentru ELISA. FIG. 3, panourile A și B prezintă rezultatele pentru răspunsul IgM secundar și IgG secundar (cercuri umplute: pătrate umplute cu IgM mutant-TNP GV: cercuri deschise IgM tampon: pătrate deschise IgG mutant-TNP GV: IgG tampon).

Aceste rezultate demonstrează că GV poate prezenta în mod eficient TNP și haptene peptidice în absența adjuvantului adăugat. Aceste experimente demonstrează, de asemenea, că atât răspunsurile IgG cât și IgM pot fi provocate. Răspunsul IgG a crescut după imunizarea secundară, în timp ce răspunsul IgM a atins vârful înainte de rapel.

FIG. 5, panoul A, FIG. 5, panoul B, FIG. 6, panoul A, şi FIG. 6, panoul B prezintă rezultatele ELISA utilizate pentru a demonstra răspunsul imun provocat de veziculele de gaz durează luni de zile.

Aceste rezultate demonstrează că veziculele de gaz având o peptidă inserată într-o proteină structurală a veziculelor de gaz pot provoca un răspuns imun de lungă durată. Prin urmare, astfel de vezicule de gaz pot fi utilizate ca vaccin.

Veziculele de gaz recombinat ale invenţiei pot fi utilizate pentru a imuniza pacienţii utilizând metode standard. În general, acestea sunt amestecate cu un purtător acceptabil farmaceutic și administrate prin injecție.


O strategie solidă pentru exprimarea genelor

Imagistica expresiei genelor în celule sau țesuturi vii s-a bazat în mare parte pe strategii bazate pe lumină care detectează fluorescența sau luminescența, dar transmisia slabă a luminii prin țesuturi limitează adâncimea care poate fi imaginea. Un nou studiu raportează o abordare de biologie sintetică pentru a codifica un reporter de expresie genetică bazat pe ultrasunete care este aplicabil celulelor de mamifere in vitro și in vivo.

Pentru a adopta ultrasunetele ca citire biomoleculară robustă, sunt necesare strategii care să transforme expresia genelor într-o schimbare a contrastului sonic. O abordare promițătoare este de a profita de nanostructurile de proteine ​​umplute cu aer codificate de unele specii bacteriene care se bazează pe aceste vezicule de gaz pentru flotabilitate în apă. Un sistem multigen pentru producerea acestor vezicule de gaz, denumit gene reporter acustice (ARG), a fost transferat anterior în bacterii comensale pentru imagistica bazată pe ultrasunete în tractul gastrointestinal al șoarecelui. Acum, Farhadi et al. a căutat să codifice un sistem echivalent în celulele de mamifere.

O mare parte a studiului s-a concentrat pe optimizarea acestui sistem bacterian pentru expresia încrucișată, cum ar fi recodificarea utilizând optimizarea codonilor de mamifere, determinarea care dintre gene este cheia pentru generarea veziculelor de gaz și testarea diferitelor aranjamente ale genelor în mai multe plasmide. Pentru a testa generarea reușită de vezicule de gaz, autorii au transfectat plasmidele în celule 293 de rinichi embrionar uman (HEK), îmbogățind veziculele de gaz rezultate prin luarea celei mai mari fracțiuni a lizatului celular și imagistica lizatelor prin microscopie electronică de transmisie. Un sistem cu nouă gene recodificat din Bacilul megaterium și exprimat din trei plasmide la 1-2 copii per genă a dus la generarea robustă de vezicule de gaz. Rezultate similare au fost obținute în celulele ovarelor de hamster chinezesc. Pentru studii ulterioare de urmărire, autorii au selectat și extins o subclonă HEK293 care conținea o formă inductibilă a constructelor ARG și vezicule de gaz formate robust după tratamentul cu doxiciclină.

Anchetatorii au testat modul în care veziculele de gaz ar putea fi detectate folosind ultrasunete, în loc să fie vizualizate direct prin microscopie electronică. Datorită proprietăților de împrăștiere a sunetului de fundal ale celulelor, ultrasunetele standard au fost suboptime pentru a distinge celulele cu vezicule de gaz de cele fără. Cu toate acestea, o secvență de impulsuri de modulare dinamică a ultrasunetelor a dus la ruperea („colaps”) a veziculelor de gaz, ceea ce a facilitat detectarea acestora pe baza modificărilor de contrast înainte și după colaps. Deși veziculele de gaz sunt distruse de acest model de ultrasunete, ele ar putea fi redetectate după ce ARG-urile au fost re-exprimate în următoarele 3 zile.

Foarte important, metoda a arătat aplicabilitate in vivo: atunci când celulele HEK293 au format xenogrefe la șoareci, administrarea sistemică de doxiciclină a dus la un semnal cu ultrasunete la periferia tumorilor. Având în vedere vascularizarea crescută (și, prin urmare, livrarea doxiciclinei) la periferie, această distribuție era de așteptat și putea fi recapitulată prin analiză histologică. Cu toate acestea, acest model nu a fost perceptibil prin imagistica in vivo a unui reporter fluorescent exprimat, de asemenea, de construcții, din cauza pătrunderii slabe a luminii.

O problemă potențială a acestui sistem reporter este că generarea de vezicule de gaz ar putea fi toxică pentru celule in vitro sau in vivo. Deși sunt necesare lucrări suplimentare pentru a aborda pe deplin această problemă, autorii au găsit doar efecte minore ale expresiei ARG asupra viabilității celulelor și observă că veziculele de gaz reprezintă doar 0,0027% din volumul celulei.

În general, cea mai notabilă realizare a acestui studiu - care exprimă un set complex de gene bacteriene interdependente în celulele de mamifere - este, de asemenea, probabil să fie cea mai mare provocare pentru o adoptare mai largă. Autorii sugerează mai multe abordări viitoare de reproiectare pentru eficientizarea sistemului actual cu trei plasmide în mai puține plasmide și reducerea dimensiunii totale a sarcinii utile. Ei fac paralele cu constructele de expresie a proteinelor fluorescente, care au suferit câțiva ani de dezvoltare pentru a optimiza expresia și proprietățile optice. Scopul este ca sistemele reporter bazate pe ultrasunete să poată fi livrate pe scară largă la o varietate de sisteme experimentale de mamifere in vitro și in vivo, pentru a oferi o expresie reporter robustă, fără a fi nevoie de a selecta subclone individuale cu exprimare ridicată.

„exprimând un set complex de gene bacteriene interdependente în celulele de mamifere”

Alte căi de explorare includ recablarea sistemului pentru a raporta genele endogene de interes și adaptarea proprietăților dinamice pentru a permite o detecție mai frecventă, fie prin conceperea unei proceduri de detectare care nu se prăbușește, fie prin creșterea ratei de reexpresie a veziculelor de gaz după colaps.


Tipuri de vezicule

În interiorul celulei se găsesc diferite tipuri de vezicule care au o mare varietate de funcții.

  • Vacuole: Acestea sunt structuri minuscule, închise cu lipide, care de obicei conțin apă și sunt observate mai ales în plantelor si sigur bacterii. Sunt utilizate pentru reglarea presiunii osmotice în celulă.
  • Lizozomi: Lizozomii sunt un tip de veziculă care este implicată în celular digestie. Un lizozom conține enzime proteolitice care pot descompune moleculele alimentare.
  • Peroxizomii: Similar cu lizozomii, peroxizomii sunt vezicule specializate care conțin peroxid de hidrogen. Aceste vezicule sunt implicate în principal în reacțiile de oxidare celulară.
  • Vezicule de transport: Așa cum sugerează și numele, aceștia sunt niște pungi minuscule închise de un strat dublu lipidic care este puternic implicat în transportul materialelor de la și către celulă și între organele.
  • Vezicule secretoare: Un tip de veziculă specializată care transportă substanțe din celulă. Ele generează de obicei din aparatul Golgi.
  • Vezicule sinaptice: Un tip de veziculă specializată găsită în tipuri de neuroni care stochează și transportă molecule de neurotransmițători.
  • Vezicule extracelulare: veziculele extracelulare se găsesc în afara celulei și sunt folosite pentru transportul în celulă. Acest tip de vezicule se văd în ambele celule eucariote și procariote.
  • Vezicule de gaz: Acestea se găsesc în bacterii și oferă flotabilitate celulei.


Mecanisme de toleranță la salinitate

Rana Munns și Mark Tester
Vol. 59, 2008

Abstract

Mecanismele fiziologice și moleculare de toleranță la componentele osmotice și ionice ale stresului de salinitate sunt revizuite la nivel celular, de organ și de întreaga plantă. Creșterea plantelor răspunde la salinitate în două faze: o fază rapidă, osmotică, care inhibă . Citeste mai mult

Figura 1: Diversitatea toleranței la sare a diferitelor specii, prezentată ca creșteri ale materiei uscate a lăstarilor după creșterea în soluție sau cultură de nisip care conține NaCl timp de cel puțin 3 săptămâni, raportat la gr. de plantă.

Figura 2: Răspunsul de creștere la stresul de salinitate are loc în două faze: un răspuns rapid la creșterea presiunii osmotice externe (faza osmotică) și un răspuns mai lent datorită acumulării.

Figura 3: Termodinamica și mecanismele transportului Na+ și Cl− la interfețele sol-rădăcină și celula stelară-vasul xilem în rădăcini. pH-ul citosolic indicativ, concentrațiile ionilor și tensiunile sunt de.

Figura 4: Diferențele în concentrațiile vacuolare de Na+ în rădăcinile plantelor de grâu transpirante care cresc în NaCl 150 mM. Concentrațiile au fost măsurate prin microanaliză cu raze X cantitative și calibrate.

Figura 5: Relații ipotetice dintre toleranța la salinitate și concentrația de Na+ în frunze pentru trei specii diferite, notate cu a, b și c pentru orez, grâu dur și orz. În cadrul majorității speciilor, t.

Figura 6: Relații măsurate între toleranța la salinitate (biomasă în sare ca % din biomasă în condiții de control) și concentrația de Na+ în frunze la diferite specii de grâu. (a) Relație negativă f.