Informație

Test colorimetric pentru un produs fenol?

Test colorimetric pentru un produs fenol?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Lucrez la un test pentru produsele fenolice create de o colonie de bacterii. Am căutat o lucrare care implică reactivul Gibbs, dar protocolul este cam neclar.

Știe careva dintre voi unde pot căuta un protocol detaliat pentru un test colormetric cu reactiv Gibbs (de preferință unul care utilizează mediu celular)

Mulțumiri


Eu nu am folosit testul, ci Bhuiya și Liu „Un test colorimetric rentabil pentru O-metiltransferazele fenolice și caracterizarea 3-O-metiltransferazelor de cafeat din Populus trichocarpa”. Biochimie anală. 2009 384(1):151-8 [link] pare să aibă un protocol relativ simplu.

Aproximativ, faceți o soluție de 0,4% (g/v) de reactiv Gibbs în etanol și apoi adăugați o cincime din aceasta la amestecul de reacție enzimatică. Apoi observați soluția spectrofotometric.

Cea mai mare problemă pe care o văd este că se pare că fiecare compus fenolic are propriul maxim de absorbție și coeficienți de extincție foarte variați. În protocolul lor, se pare că se uită la scanări de gamă completă, mai degrabă decât la măsurători cu o singură lungime de undă. Cu siguranță veți avea nevoie de o curbă standard pentru anumite substanțe fenolice pentru a obține rezultate cantitative. (De asemenea, orice substanțe fenolice de fundal sau absorbția medie în intervalul 400-600 nm pot afecta măsurătorile - utilizați spații libere adecvate.)


Test colorimetric pentru un produs fenol? - Biologie

7. Analiza carbohidraților

Carbohidrații sunt una dintre cele mai importante componente din multe alimente. Carbohidrații pot fi prezenți ca molecule izolate sau pot fi asociați fizic sau legați chimic de alte molecule. Moleculele individuale pot fi clasificate în funcție de numărul de monomeri pe care îi conțin ca monozaharide, oligozaharide sau polizaharide. Moleculele în care carbohidrații sunt atașați covalent de proteine ​​sunt cunoscute ca glicoproteine , în timp ce cele în care carbohidrații sunt atașați covalent de lipide sunt cunoscute ca glicolipidele . Unii carbohidrați sunt digerabili de oameni și, prin urmare, oferă o sursă importantă de energie, în timp ce alții sunt indigestibili și, prin urmare, nu oferă energie. Carbohidrații nedigerabili fac parte dintr-un grup de substanțe cunoscut sub numele de fibre dietetice, care include și lignina. S-a dovedit că consumul de cantități semnificative de fibre alimentare este benefic pentru alimentația umană, contribuind la reducerea riscului de anumite tipuri de cancer, boli coronariene, diabet și constipație. Pe lângă faptul că sunt o sursă importantă de energie și fibre alimentare, carbohidrații contribuie și la dulceața, aspectul și caracteristicile texturale ale multor alimente. Este important să se determine tipul și concentrația de carbohidrați din alimente din mai multe motive.

  • Standarde de identitate - alimentele trebuie să aibă compoziții conform reglementărilor guvernamentale
  • Etichetare nutrițională - pentru a informa consumatorii cu privire la conținutul nutrițional al alimentelor
  • Detectarea adulterarii - fiecare tip de aliment are o „amprentă” de carbohidrați
  • Calitatea alimentelor - proprietățile fizico-chimice ale alimentelor precum dulceața, aspectul, stabilitatea și textura depind de tipul și concentrația de carbohidrați prezenți.
  • economic - industria nu vrea să ofere ingrediente scumpe
  • Prelucrare alimentară - eficienta multor operatii de prelucrare a alimentelor depinde de tipul si concentratia de carbohidrati prezenti

7.2. Clasificarea carbohidraților

Monozaharidele sunt compuși cristalini solubili în apă. Sunt aldehide alifatice sau cetone care conțin o grupare carbonil și una sau mai multe grupări hidroxil. Cele mai multe monozaharide naturale au fie cinci (pentoze) fie șase (hexoze) atomi de carbon. Hexozele care apar frecvent în alimente sunt glucoza, fructoza și galactoza, în timp ce pentozele frecvente sunt arabinoza și xiloza. Centrii reactivi ai monozaharidelor sunt grupările carbonil și hidroxil.

Aceștia sunt polimeri cu greutate moleculară relativ mică ai monozaharidelor (< 20) care sunt legați covalent prin legături glicozidice. Dizaharidele constau din doi monomeri, în timp ce trizaharidele constau din trei. Oligozaharidele care conțin monomeri de glucoză, fructoză și galactoză sunt cele mai frecvente în alimente.

Majoritatea carbohidraților găsiți în natură sunt prezenți sub formă de polizaharide. Polizaharidele sunt polimeri cu greutate moleculară mare ai monozaharidelor (> 20). Polizaharidele care conțin toate aceleași monozaharide se numesc homopolizaharide (de exemplu., amidonul, celuloza și glicogenul sunt formate numai din glucoză), în timp ce cele care conțin mai mult de un tip de monomer sunt cunoscute ca heteropolizaharide (de exemplu., pectină, hemiceluloză și gingii).

7.3. Metode de analiză

Un număr mare de tehnici analitice au fost dezvoltate pentru a măsura concentrația totală și tipul de carbohidrați prezenți în alimente (vezi Analiza Alimentelor de Nielssen sau Analiza Alimentelor de Pomeranz și Meloan pentru mai multe detalii). Conținutul de carbohidrați al unui aliment poate fi determinat prin calcularea procentului rămas după ce au fost măsurate toate celelalte componente: %carbohidrați = 100 - %umiditate - %proteine ​​- %lipid - %mineral. Cu toate acestea, această metodă poate duce la rezultate eronate din cauza erorilor experimentale în oricare dintre celelalte metode și, prin urmare, este de obicei mai bine să se măsoare direct conținutul de carbohidrați pentru măsurători precise.

7.4. Monozaharide și oligozaharide

7.4.1. Pregătirea unei mostre

Cantitatea de preparat necesară pentru a pregăti o probă pentru analiza carbohidraților depinde de natura alimentelor analizate. Soluțiile apoase, cum ar fi sucurile de fructe, siropurile și mierea, necesită de obicei foarte puțină pregătire înainte de analiză. Pe de altă parte, multe alimente conțin carbohidrați care sunt asociați fizic sau legați chimic de alte componente, de exemplu., nuci, cereale, fructe, pâine și legume. În aceste alimente este de obicei necesar să se izoleze carbohidrații de restul alimentelor înainte de a putea fi analizate. Metoda precisă de izolare a carbohidraților depinde de tipul de carbohidrați, de tipul matricei alimentare și de scopul analizei, cu toate acestea, există unele proceduri care sunt comune multor tehnici de izolare. De exemplu, alimentele sunt de obicei uscate sub vid (pentru a preveni degradarea termică), măcinate până la o pulbere fină (pentru a îmbunătăți extracția cu solvent) și apoi degresate prin extracția cu solvent.

Una dintre cele mai frecvent utilizate metode de extragere a carbohidraților cu greutate moleculară mică din alimente este fierberea unei probe degresate cu o soluție de alcool de 80%. Monozaharidele și oligozaharidele sunt solubile în soluții alcoolice, în timp ce proteinele, polizaharidele și fibrele alimentare sunt insolubile. Componentele solubile pot fi separate de componentele insolubile prin filtrarea soluției fiarte și colectarea filtratului (partea care trece prin filtru) și a retenantului (partea reținută de filtru). Aceste două fracții pot fi apoi uscate și cântărite pentru a determina concentrațiile lor. În plus, la monozaharide și oligozaharide diferite alte molecule mici pot fi, de asemenea, prezente în extractul alcoolic, care ar putea interfera cu analiza ulterioară. de exemplu., aminoacizi, acizi organici, pigmenți, vitamine, minerale etc. De obicei, este necesar să îndepărtați aceste componente înainte de a efectua o analiză a carbohidraților. Acest lucru se realizează în mod obișnuit prin tratarea soluției cu agenți de clarificare sau prin trecerea acesteia printr-una sau mai multe rășini schimbătoare de ioni.

  • Agenți de clarificare. Extractele apoase din multe alimente conțin substanțe care sunt colorate sau produc turbiditate și astfel interferează cu analiza spectroscopică sau cu determinările punctului final. Din acest motiv soluțiile sunt de obicei lămurit înainte de analiză. Cei mai des utilizați agenți de limpezire sunt sărurile de metale grele (cum ar fi acetatul de plumb) care formează complexe insolubile cu substanțe interferente care pot fi îndepărtate prin filtrare sau centrifugare. Cu toate acestea, este important ca agentul de limpezire să nu precipite niciunul dintre carbohidrații din soluție, deoarece acest lucru ar determina o subestimare a conținutului de carbohidrați.
  • Schimb de ioni. Multe monozaharide și oligozaharide sunt molecule polare neîncărcate și, prin urmare, pot fi separate de moleculele încărcate prin trecerea probelor prin coloane schimbătoare de ioni. Prin utilizarea unei combinații de coloană încărcată pozitiv și negativ, este posibilă îndepărtarea celor mai mulți contaminanți încărcați. Moleculele nepolare pot fi îndepărtate prin trecerea unei soluții printr-o coloană cu o fază staționară nepolară. Astfel proteinele, aminoacizii, acizii organici, mineralele și compușii hidrofobi pot fi separați de carbohidrați înainte de analiză.

Înainte de analiză, alcoolul poate fi îndepărtat din soluții prin evaporare sub vid, astfel încât să rămână o soluție apoasă de zaharuri.

7.4.2. Metode cromatografice și electroforetice

Metodele cromatografice sunt cele mai puternice tehnici analitice pentru analiza tip și concentraţie a monozaharidelor și oligozaharidelor din alimente. Cromatografia în strat subțire (TLC), cromatografia gazoasă (GC) și cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) sunt utilizate în mod obișnuit pentru a separa și identifica carbohidrații. Carbohidrații sunt separați pe baza caracteristicilor lor diferențiale de adsorbție prin trecerea soluției de analizat printr-o coloană. Carbohidrații pot fi separați pe baza coeficienților lor de partiție, a polarităților sau a dimensiunilor, în funcție de tipul de coloană utilizat. HPLC este în prezent cea mai importantă metodă cromatografică pentru analiza carbohidraților deoarece este capabilă de măsurători rapide, specifice, sensibile și precise. În plus, GC necesită ca probele să fie volatile, ceea ce de obicei necesită ca acestea să fie derivatizate, în timp ce în HPLC probele pot fi adesea analizate direct. HPLC și GC sunt utilizate în mod obișnuit împreună cu RMN sau spectrometria de masă, astfel încât structura chimică a moleculelor care alcătuiesc vârfurile să poată fi, de asemenea, identificată.

Carbohidrații pot fi, de asemenea, separați prin electroforeză după ce au fost derivatizați pentru a le face încărcați electric, de exemplu., prin reacţie cu borati. O soluție de carbohidrați derivatizați este aplicată pe un gel și apoi este aplicată o tensiune pe el. Carbohidrații sunt apoi separați în funcție de dimensiunea lor: cu cât dimensiunea unei molecule de carbohidrați este mai mică, cu atât se mișcă mai repede într-un câmp electric.

Un număr de metode chimice utilizate pentru determinarea monozaharidelor și oligozaharidelor se bazează pe faptul că multe dintre aceste substanțe sunt agenţi reducători care pot reacționa cu alte componente pentru a produce precipitate sau complecși colorați care pot fi cuantificați. Concentrația de carbohidrați poate fi determinată gravimetric, spectrofotometric sau prin titrare. Carbohidrații nereductori pot fi determinați folosind aceleași metode dacă sunt mai întâi hidrolizați pentru a-i face reducători. Este posibil să se determine concentrația atât a zaharurilor nereducătoare, cât și a celor reducătoare prin efectuarea unei analize pentru zaharuri reducătoare înainte și după hidrolizare. Sunt disponibile multe metode chimice diferite pentru cuantificarea carbohidraților. Cele mai multe dintre acestea pot fi împărțite în trei categorii: titrare, gravimetrică și colorimetrică. Un exemplu pentru fiecare dintre aceste tipuri diferite este dat mai jos.

Metoda Lane-Eynon este un exemplu de metodă de tritrare pentru determinarea concentrației de zaharuri reducătoare dintr-o probă. Se folosește o biuretă pentru a adăuga soluția de carbohidrați analizată într-un balon care conține o cantitate cunoscută de soluție de sulfat de cupru clocotită și un indicator de albastru de metilen. Zaharurile reducătoare din soluția de carbohidrați reacţionează cu sulfatul de cupru prezent în balon. Odată ce tot sulfatul de cupru din soluție a reacționat, orice adăugare suplimentară de zaharuri reducătoare face ca indicatorul să se schimbe de la albastru la alb. Se înregistrează volumul de soluție de zahăr necesar pentru a ajunge la punctul final. Reacția nu este stoichemetrică, ceea ce înseamnă că este necesară pregătirea unei curbe de calibrare prin efectuarea experimentului cu o serie de soluții standard de concentrație cunoscută de carbohidrați.

Dezavantajele acestei metode sunt (i) rezultatele depind de timpii precisi de reacție, temperaturile și concentrațiile de reactiv utilizate și, prin urmare, acești parametri trebuie controlați cu atenție (ii) nu poate face distincția între diferitele tipuri de zahăr reducător și (iii) nu poate determină direct concentrația de zaharuri nereducătoare, (iv) este susceptibilă la interferența altor tipuri de molecule care acționează ca agenți reducători.

Metoda Munson și Walker este un exemplu de metodă gravimetrică de determinare a concentrației de zaharuri reducătoare dintr-o probă. Carbohidrații sunt oxidați în prezența căldurii și a unui exces de sulfat de cupru și tartrat alcalin în condiții atent controlate, ceea ce duce la formarea unui precipitat de oxid de cupru:

zahăr reducător + Cu 2+ + bază zahăr oxidat + CuO2 (precipitat)

Cantitatea de precipitat format este direct legată de concentrația de zaharuri reducătoare din proba inițială. Concentrația precipitatului prezent poate fi determinată gravimetric (prin filtrare, uscare și cântărire) sau titrimetric (prin redizolvarea precipitatului și titrarea cu un indicator adecvat). Această metodă suferă de aceleași dezavantaje ca și metoda Lane-Eynon, cu toate acestea, este mai reproductibilă și mai precisă.

Metoda Anthrone este un exemplu de metodă colorimetrică de determinare a concentrației zaharurilor totale dintr-o probă. Zaharurile reacționează cu reactivul antron în condiții acide pentru a da o culoare albastru-verde. Proba se amestecă cu acid sulfuric și reactivul antron și apoi se fierbe până la finalizarea reacției. Soluția este apoi lăsată să se răcească și absorbanța sa este măsurată la 620 nm. Există o relație liniară între absorbanță și cantitatea de zahăr care a fost prezentă în proba originală. Această metodă determină atât zaharuri reducătoare, cât și nereducătoare datorită prezenței acidului sulfuric puternic oxidant. Ca și celelalte metode, este non-stoichemetrică și, prin urmare, este necesar să se pregătească o curbă de calibrare folosind o serie de standarde de concentrație cunoscută de carbohidrați.

Metoda fenol - acid sulfuric este un exemplu de metodă colorimetrică care este utilizată pe scară largă pentru a determina concentrația totală de carbohidrați prezenți în alimente. O soluție apoasă limpede a carbohidraților de analizat este plasată într-o eprubetă, apoi se adaugă fenol și acid sulfuric. Soluția capătă o culoare galben-portocalie ca urmare a interacțiunii dintre carbohidrați și fenol. Absorbanța la 420 nm este proporțională cu concentrația de carbohidrați inițial din probă. Acidul sulfuric face ca toate zaharurile nereducătoare să fie convertite în zaharuri reducătoare, astfel încât această metodă determină totalul zaharurilor prezente. Această metodă este nestoichemetrică și de aceea este necesară pregătirea unei curbe de calibrare folosind o serie de standarde cu concentrația cunoscută de carbohidrați.

7.4.4. Metode enzimatice

Metodele analitice bazate pe enzime se bazează pe capacitatea lor de a cataliza reacții specifice. Aceste metode sunt rapide, foarte specifice și sensibile la concentrații scăzute și, prin urmare, sunt ideale pentru determinarea carbohidraților din alimente. În plus, de obicei este necesară o mică pregătire a probei. Alimentele lichide pot fi testate direct, în timp ce alimentele solide trebuie mai întâi dizolvate în apă. Există multe kituri de analiză enzimatică care pot fi achiziționate comercial pentru a efectua analize pentru carbohidrați specifici. Producătorii acestor truse oferă instrucțiuni detaliate despre cum se efectuează analiza. Cele două metode cel mai frecvent utilizate pentru determinarea concentrației de carbohidrați sunt: ​​(i) permiterea reacției să se finalizeze și măsurarea concentrației produsului, care este proporțională cu concentrația substratului inițial (ii). măsurarea vitezei inițiale a reacției catalizate de enzime deoarece viteza este proporțională cu concentrația substratului. Câteva exemple de utilizare a metodelor enzimatice pentru a determina concentrațiile de zahăr din alimente sunt prezentate mai jos:

Această metodă utilizează o serie de pași pentru a determina atât concentrația de glucoză, cât și de fructoză dintr-o probă. În primul rând, glucoza este transformată în glucoză-6-fosfat (G6P) de către enzima hexakinaza și ATP. Apoi, G6P este oxidat de NADP+ în prezența G6P-dehidrogenazei (G6P-DH)

G6P + NADP + gluconat-6-fosfat + NADPH + H +

Cantitatea de NADPH formată este proporțională cu concentrația de G6P din probă și poate fi măsurată spectrofotometric la 340 nm. Concentrația de fructoză este apoi determinată prin conversia fructozei în glucoză, folosind o altă enzimă specifică și repetând procedura de mai sus.

Concentrația de maltoză și zaharoză (dizaharide) dintr-o probă poate fi determinată după ce concentrația de glucoză și fructoză a fost determinată prin metoda anterioară. Maltoza și zaharoza sunt descompuse în monozaharidele lor constitutive de către enzima a-glucozidază:

zaharoză +H2O glucoză + fructoză

Concentrațiile de glucoză și fructoză pot fi apoi determinate prin metoda anterioară. Problema majoră cu această metodă este că multe alte oligozaharide sunt, de asemenea, convertite în monozaharide de către a-glucozidază și este dificil să se determine cu precizie care oligozaharide sunt prezente. Prin urmare, această metodă este utilă numai atunci când se cunoaște tipul de carbohidrați prezenți, dar nu și concentrațiile relative ale acestora. Sunt disponibile diverse alte metode enzimatice pentru determinarea concentrației altor monozaharide și oligozaharide, de exemplu., lactoză, galactoză și rafinoză (vezi Analiza Alimentelor Nielssen).

Au fost folosite multe metode fizice diferite pentru a determina concentrația de carbohidrați a alimentelor. Aceste metode se bazează pe faptul că sunt o schimbare a unor caracteristici fizico-chimice ale unui aliment, deoarece concentrația de carbohidrați variază. Metodele utilizate în mod obișnuit includ polarimetria, indicele de refracție, IR și densitatea.

Moleculele care conțin un atom de carbon asimetric au capacitatea de a roti lumina polarizată plană. Un polarimetru este un dispozitiv care măsoară unghiul în care lumina polarizată plană este rotită la trecerea printr-o soluție. Un polarimetru constă dintr-o sursă de lumină monocromatică, un polarizator, o celulă de probă de lungime cunoscută și un analizor pentru măsurarea unghiului de rotație.Gradul de polarizare este legat de concentrația moleculelor optic active în soluție prin ecuația a = [a ] lc , unde a este unghiul de rotație măsurat, [ a ] ​​este activitatea optică (care este o constantă pentru fiecare tip de moleculă), l este lungimea traseului și c este concentrarea. Unghiul general de rotație depinde de temperatura și lungimea de undă a luminii utilizate și astfel acești parametri sunt de obicei standardizați la 20 o C și 589,3 nm (linia D pentru sodiu). O curbă de calibrare a concentrației a versus este pregătită folosind o serie de soluții cu concentrație cunoscută, sau valoarea lui [a] este luată din literatură dacă tipul de carbohidrați prezenți este cunoscut. Concentrația de carbohidrați dintr-o probă necunoscută este apoi determinată prin măsurarea unghiului său de rotație și comparându-l cu curba de calibrare.

Indicele de refracție (n) a unui material este viteza luminii în vid împărțită la viteza luminii în material (n = c/cm). Indicele de refracție al unui material poate fi determinat prin măsurarea unghiului de refracție (r) și unghiul de incidență ( i ) la o graniță între acesta și un alt material cu indice de refracție cunoscut (Legea lui Snell: sin( i )/păcat(r) = n2/ n1). În practică, indicele de refracție al soluțiilor de carbohidrați este de obicei măsurat la o limită cu cuarț. Indicele de refracție al unei soluții de carbohidrați crește odată cu creșterea concentrației și astfel poate fi utilizat pentru a măsura cantitatea de carbohidrați prezentă. RI este, de asemenea, dependent de temperatură și lungime de undă, astfel încât măsurătorile se fac de obicei la o anumită temperatură (20 o C) și lungime de undă (589,3 nm). Această metodă este rapidă și simplă de realizat și poate fi efectuată cu instrumente simple de mână. Este folosit în mod obișnuit în industrie pentru a determina concentrațiile de zahăr din siropuri, miere, melasă, produse din tomate și gemuri.

Densitatea unui material este masa lui împărțită la volumul său. Densitatea soluțiilor apoase crește pe măsură ce crește concentrația de carbohidrați. Astfel, concentrația de carbohidrați poate fi determinată prin măsurarea densității, de exemplu., folosind sticle de densitate sau hidrometre. Această tehnică este utilizată în mod obișnuit în industrie pentru determinarea concentrațiilor de carbohidrați din sucuri și băuturi.

Un material absoarbe infraroșu datorită vibrației sau rotației grupelor moleculare. Carbohidrații conțin grupe moleculare care absorb radiația infraroșu la lungimi de undă unde niciunul dintre ceilalți constituenți majori ai alimentelor nu absoarbe, în consecință, concentrația lor poate fi determinată prin măsurarea absorbanței infraroșii la aceste lungimi de undă. Efectuând măsurători la un număr de lungimi de undă specifice diferite, este posibil să se determine simultan concentrația de carbohidrați, proteine, umiditate și lipide. Măsurătorile sunt efectuate în mod normal prin măsurarea intensității unei unde infraroșii reflectată de suprafața unei probe: cu cât absorbanța este mai mare, cu atât reflectanța este mai mică. Instrumentele analitice bazate pe absorbanța în infraroșu sunt nedistructive și capabile de măsurători rapide și, prin urmare, sunt potrivite în special pentru analize on-line sau pentru utilizare într-un laborator de control al calității în care multe probe sunt analizate de rutină.

Metode instrumentale mai sofisticate sunt capabile să ofere informații despre structura moleculară a carbohidraților, precum și concentrația acestora, de exemplu., RMN sau spectrometrie de masă.

Testele imunologice găsesc o utilizare din ce în ce mai mare în industria alimentară pentru analiza calitativă și cantitativă a produselor alimentare. Testele imunologice specifice pentru carbohidrații cu greutate moleculară mică sunt dezvoltate prin atașarea carbohidratului de interes la o proteină și apoi injectarea acestuia într-un animal. Cu timpul animalul dezvoltă anticorpi specifici pentru molecula de carbohidrați. Acești anticorpi pot fi apoi extrași de la animal și utilizați ca parte a unui kit de testare pentru determinarea concentrației carbohidratului specific din alimente. Testele imunologice sunt extrem de sensibile, specifice, ușor de utilizat și rapide.

7.5 Analiza polizaharidelor și fibrelor

O mare varietate de polizaharide apar în alimente. Polizaharidele pot fi clasificate în funcție de caracteristicile lor moleculare (de exemplu., tipul, numărul, legătura și secvența monozaharidelor), caracteristici fizico-chimice (de exemplu., solubilitatea în apă, vâscozitatea, activitatea de suprafață) și funcția nutrițională (de exemplu., digerabile sau nedigerabile). Majoritatea polizaharidelor conțin undeva între 100 și câteva mii de monozaharide. Unele polizaharide conțin toate același tip de monozaharide (homopolizaharide), în timp ce altele conțin un amestec de diferite tipuri de monozaharide (heteropolizaharide). Unele polizaharide există ca lanțuri liniare, în timp ce altele există ca lanțuri ramificate. Unele polizaharide pot fi digerate de ființele umane și, prin urmare, formează o sursă importantă de energie (de exemplu., amidon), în timp ce altele sunt indigerabile (de exemplu., celuloză, hemiceluloză și pectine). Aceste polizaharide nedigerabile fac parte dintr-un grup de substanțe cunoscut sub numele de fibre dietetice, care include și lignina (care este un polimer al moleculelor aromatice). S-a demonstrat că consumul multor tipuri de fibre alimentare are proprietăți funcționale fiziologic benefice pentru oameni, de exemplu., prevenirea cancerului, bolilor de inimă și diabetului.

7.5.1. Analiza amidonului

Amidonul este cea mai comună polizaharidă digerabilă găsită în alimente și, prin urmare, este o sursă majoră de energie în dietele noastre. În forma sa naturală, amidonul există sub formă de granule insolubile în apă (3 - 60 m m), dar în multe alimente procesate amidonul nu mai este în această formă din cauza tratamentelor de procesare implicate (de ex., Incalzi). Constă dintr-un amestec de două homopolizaharide de glucoză: amiloza (500-2000 unități de glucoză) care este liniară și amilopectină (>1.000.000 de unități de glucoză) care este ramificat extensiv. Aceste două tipuri de amidon au proprietăți fizico-chimice diferite și, prin urmare, este adesea important să se determine concentrația fiecărui component individual al amidonului, precum și concentrația totală a amidonului.

Pregătirea unei mostre. Conținutul de amidon al majorității alimentelor nu poate fi determinat direct, deoarece amidonul este conținut într-o matrice alimentară complexă din punct de vedere structural și chimic. În special, amidonul este adesea prezent într-o formă semicristalină (amidon granular sau retrogradat) care este inaccesibil pentru reactivii chimici utilizați pentru determinarea concentrației sale. Prin urmare, este necesar să se izoleze amidonul de celelalte componente prezente în matricea alimentară înainte de a efectua o analiză a amidonului.

În alimentele naturale, precum leguminoasele, cerealele sau tuberculii, granulele de amidon sunt de obicei separate de celelalte componente majore prin uscare, măcinare, înmuiere în apă, filtrare și centrifugare. Granulele de amidon sunt insolubile în apă și au o densitate relativ mare (1500 kg/m 3 ), astfel încât vor tinde să se deplaseze pe fundul unui recipient în timpul centrifugării, unde pot fi separate de celelalte solubile în apă și mai puțin. materiale dense. Probele de alimente procesate sunt în mod normal uscate, măcinate și apoi dispersate în soluții fierbinți de etanol 80%. Monozaharidele și oligozaharidele sunt solubile în soluția de etanol, în timp ce amidonul este insolubil. Prin urmare, amidonul poate fi separat de zaharuri prin filtrarea sau centrifugarea soluției. Dacă este prezent orice amidon semicristalin, proba poate fi dispersată în apă și încălzită la o temperatură în care amidonul se gelatinizează (> 65 °C). Adăugarea acidului percloric sau a clorurii de calciu în apă înainte de încălzire facilitează solubilizarea amidonului greu de extras.

Metode de analiză. Odată ce amidonul a fost extras, există mai multe moduri de a determina concentrația acestuia:

  • La soluția de amidon sunt adăugate enzime specifice pentru a descompune amidonul în glucoză. Concentrația de glucoză este apoi analizată folosind metodele descrise anterior (de exemplu., cromatografie sau metode enzimatice). Concentrația de amidon se calculează din concentrația de glucoză.
  • Iodul poate fi adăugat la soluția de amidon pentru a forma un complex amidon-iod insolubil care poate fi determinat gravimetric prin colectarea, uscarea şi cântărirea precipitatului format sau titrimetric prin determinarea cantităţii de iod necesară pentru precipitarea amidonului.
  • Dacă nu există alte componente prezente în soluție care ar interfera cu analiza, atunci concentrația de amidon ar putea fi determinată folosind metode fizice, de exemplu., densitate, indice de refracție sau polarimetrie.

Concentrațiile de amiloză și amilopectină dintr-o probă pot fi determinate folosind aceleași metode ca cele descrise pentru amidon odată ce amiloza a fost separată de amilopectină. Acest lucru se poate realiza prin adăugarea de substanțe chimice care formează un complex insolubil cu unul dintre componente, dar nu și cu celălalt, de exemplu. unii alcooli precipită amiloza dar nu amilopectina. Unele dintre metodele menționate nu vor determina concentrația de amidon rezistent prezent în probă. Dacă este necesară concentrația de amidon rezistent, atunci se poate adăuga o etapă suplimentară la procedura în care se adaugă dimetilsulfoxid (DMSO) pentru a dizolva amidonul rezistent înainte de efectuarea analizei.

7.5.2. Analiza fibrelor

În ultimii douăzeci de ani, nutriționiștii au devenit conștienți de importanța fibrelor în dietă. Consumul liberal de fibre ajută la protejarea împotriva cancerului de colon, a bolilor cardiovasculare și a constipației. Aportul adecvat de fibre alimentare este, prin urmare, benefic pentru sănătatea bună. Fibrele alimentare sunt definite ca polizaharide vegetale care nu sunt digerabile de către oameni, plus lignină. Principalele componente ale fibrelor alimentare sunt celuloza, hemiceluloza, pectina, hidrocoloizii și lignina. Unele tipuri de amidon, cunoscut sub numele de amidon rezistent, sunt, de asemenea, indigerabile de către ființele umane și pot fi analizate ca fibre alimentare. Baza multor tehnici de analiză a fibrelor este, prin urmare, dezvoltarea unei proceduri care imită procesele care au loc în sistemul digestiv uman.

7.5.2.1. Componentele majore ale fibrelor alimentare

Polizaharide peretelui celular

Celuloza apare în toate plantele ca componentă structurală principală a pereților celulari și este de obicei asociată cu diferite hemiceluloze și lignină. Tipul și amploarea acestor asocieri determină proprietățile texturale caracteristice ale multor materiale vegetale comestibile. Celuloza este o homopolisacaridă liniară lungă de glucoză, având de obicei până la 10.000 de subunități de glucoză. Moleculele de celuloză se agregează pentru a forma microfibrile care asigură rezistență și rigiditate pereților celulelor plantelor. Hemicelulozele sunt un grup heterogen de heteropolizaharide ramificate care conțin un număr de zaharuri diferite în coloana vertebrală și lanțurile laterale. Prin definiție hemicelulozele sunt solubile în soluții alcaline diluate, dar insolubile în apă. Pectinele sunt o altă formă de heteropolizaharide găsite în pereții celulari care sunt bogate în acizi uronici, solubile în apă fierbinte și care sunt capabile să formeze geluri.

Polizaharide fără perete celular

Acest grup de substanțe sunt, de asemenea, carbohidrați nedigerabili, dar nu sunt derivate din pereții celulari ai plantelor. Polizaharidele fără peretele celular includ hidrocoloizi, cum ar fi guma de guar și roșcove, guma arabică, agar, alginați și caragenani care sunt utilizați în mod obișnuit în alimente ca agenți de gelifiere, stabilizatori și agenți de îngroșare.

Lignina este un polimer non-carbohidrat care constă din aproximativ 40 de subunități aromatice care sunt legate covalent. Este de obicei asociat cu celuloza și hemiceluloza din pereții celulari ai plantelor.

7.5.2.2. Proceduri comune în pregătirea și analiza probelor

Există o serie de proceduri care sunt utilizate în mod obișnuit în multe dintre metodele de analiză a fibrelor alimentare:

  • Îndepărtarea lipidelor. Proba alimentară care urmează să fie analizată este deci uscată, măcinată până la o pulbere fină și apoi lipidele sunt îndepărtate prin extracție cu solvent.
  • Eliminarea proteinelor. Proteinele sunt de obicei descompuse și solubilizate folosind enzime, soluții de acid puternic sau alcaline puternice. Aminoacizii rezultați sunt apoi separați din fibra insolubilă prin filtrare sau din fibra totală prin precipitarea selectivă a fibrei cu soluții de etanol.
  • Îndepărtarea amidonului. Amidonul semicristalin este gelatinizat prin încălzire în prezența apei, iar apoi amidonul este descompus și solubilizat de enzime specifice, acid puternic sau alcali puternic. Glucoza este apoi separată de fibra insolubilă prin filtrare sau separată de fibra totală prin precipitarea selectivă a fibrei cu soluții de etanol.
  • Precipitarea selectivă a fibrelor. Fibrele alimentare pot fi separate de alte componente în soluții apoase prin adăugarea de concentrații diferite de etanol pentru a provoca precipitarea selectivă. Solubilitatea monozaharidelor, oligozaharidelor și polizaharidelor depinde de concentrația de etanol. Apă: monozaharidele, oligozaharidele, unele polizaharide și aminoacizi sunt solubile, alte polizaharide și fibrele sunt insolubile. Soluții de etanol 80%: monozaharidele, oligozaharidele și aminoacizii sunt polizaharide solubile, iar fibrele sunt insolubile. Din acest motiv, soluții concentrate de etanol sunt adesea folosite pentru a precipita selectiv fibrele din alte componente.
  • Analiza fibrelor. Conținutul de fibre al unui aliment poate fi determinat fie gravimetric prin cântărirea masei unei fracții de fibre insolubile izolate dintr-o probă sau chimic prin descompunerea fibrei în monozaharidele sale constitutive și măsurarea concentrației acestora folosind metodele descrise anterior.

7.5.2.3. Metode gravimetrice

Metoda fibrelor brute oferă o estimare a fibrelor nedigerabile din alimente. Se determină prin extracția secvențială a unei probe degresate cu 1,25% H2ASA DE4 şi 1,25% NaOH. Reziduul insolubil este colectat prin filtrare, uscat, cântărit și calcinat pentru a corecta contaminarea minerală a reziduului de fibre. Fibra brută măsoară celuloza și lignina din probă, dar nu determină hemicelulozele, pectinele și hidrocoloizii, deoarece acestea sunt digerate de alcalii și acid și, prin urmare, nu sunt colectate. Din acest motiv, mulți oameni de știință din alimentație consideră că utilizarea sa ar trebui întreruptă. Cu toate acestea, este o metodă destul de simplă de realizat și este metoda oficială AOAC pentru o serie de alimente diferite.

Metoda fibrelor totale, insolubile și solubile

Principiul de bază al acestei metode este izolarea fracției de interes prin precipitare selectivă și apoi determinarea masei acesteia prin cântărire. O probă gelatinizată de alimente uscate, degresate este digerată enzimatic cu amilază, amiloglucozidază și protează pentru a descompune amidonul și componentele proteice. Conținutul total de fibre al probei este determinat prin adăugarea de etanol 95% la soluție pentru a precipita toată fibrele. Soluția este apoi filtrată și fibra este colectată, uscată și cântărită. Alternativ, componentele fibrelor solubile în apă și insolubile în apă pot fi determinate prin filtrarea probei digerate enzimatic. Aceasta lasă solubil fibre în soluția filtrată și insolubil fibre prinse în filtru. Componenta insolubilă este colectată din filtru, uscată și cântărită. Componenta solubilă este precipitată din soluţie prin adăugarea de alcool 95% la filtrat şi apoi este colectată prin filtrare, uscată şi cântărită. Conținutul de proteine ​​și cenușă al diferitelor fracții sunt determinate astfel încât să se corecteze oricare dintre aceste substanțe care ar putea rămâne în fibră: Fibră = greutate reziduală - greutatea de (proteină + cenușă).

Această metodă a fost sancționată oficial de AOAC și este utilizată pe scară largă în industria alimentară pentru a determina conținutul de fibre dintr-o varietate de alimente. Principalul său dezavantaj este că tinde să supraestimeze conținutul de fibre al alimentelor care conțin concentrații mari de zaharuri simple, de exemplu., fructele uscate, posibil pentru că rămân prinse în precipitatele formate la adăugarea etanolului.

7.5.2.4. Metode chimice

În metodele chimice, conținutul de fibre este egal cu suma tuturor monozaharidelor fără amidon plus lignina rămasă odată ce toți carbohidrații digerabili au fost îndepărtați. Monozaharidele sunt măsurate folosind diferitele metode descrise anterior.


Abstract

Fundal

Febra galbenă, virusurile dengue, chikungunya și Zika sunt responsabile pentru o morbiditate și mortalitate considerabilă la om. Aedes aegypti și Aedes albopictus sunt cei mai importanți vectori țânțari implicați în transmiterea lor. Identificarea corectă a acestor specii este esențială pentru implementarea programelor de control pentru limitarea transmiterii arbovirusurilor, în timpul detecțiilor suspectate în porturile de prima intrare, pentru a delimita incursiunile sau în timpul programelor de supraveghere a prezenței/absenței în regiunile vulnerabile la invazie. Am dezvoltat și evaluat teste izoterme colorimetrice simple și rapide pentru a detecta aceste două specii de țânțari bazate pe amplificarea izotermă mediată de buclă (LAMP) care vizează distanțierul 1 transcris intern ARN ribozomal (ITS1).

Metodologie/Principale constatări

Probele au fost preparate prin omogenizare și încălzire la 99 °C timp de 10 minute înainte de a fi adăugată o alicotă la reacția LAMP. După 40 de minute de incubare la 65 o C, o schimbare de culoare a indicat un rezultat pozitiv. Testele au fost 100% sensibile și specifice speciei și au demonstrat o limită de detecție comparabilă cu detecția bazată pe PCR (chimia TaqMan). Testele LAMP au reușit să detecteze speciile țintă pentru diferite stadii de viață testate (adult, larva primă, larvă și pupă) și componente ale corpului, cum ar fi picioarele, aripile și exuviale pupale. Important, testele LAMP ar putea detecta Ae. aegypti ADN-ul din țânțarii stocați în capcanele Biogents Sentinel desfășurate pe teren timp de 14 zile. Un singur prim stadiu Ae. aegypti larva ar putea fi detectată și într-un grup de 1.000 non-țintă în primul stadiu Aedes notoscriptus, accelerând astfel procesarea colecțiilor de ovitrap obținute în timpul anchetelor de prezență/absență. Un protocol simplu seringă-burete a facilitat concentrarea și colectarea larvelor din apa ovitrap după ecloziune.

Concluzii/semnificație

Descriem dezvoltarea testelor LAMP pentru identificarea speciilor și demonstrăm aplicarea lor directă pentru supraveghere în diferite contexte de teren. Testele LAMP descrise aici sunt adjuvanti utili la testele de diagnostic de laborator sau pot fi folosite ca teste de sine stătătoare. Viteza lor, ușurința de utilizare, costul scăzut și nevoia de echipament și instruire minime fac testele LAMP ideale pentru adoptare în setări cu resurse reduse, fără a fi nevoie să accesați serviciile de laborator de diagnosticare.


Dezvoltarea unui test colorimetric simplu pentru determinarea tulpinii producătoare de alcool izoamilic

Ca și alți alcooli superiori cu lanț ramificat, utilizați ca biocombustibili, alcoolul izoamil a atras o atenție considerabilă datorită avantajelor sale, care includ densitatea ridicată a energiei, higroscopicitatea scăzută și compatibilitatea cu infrastructura actuală. Încercările anterioare de a crește producția microbiană de alcool izoamilic au produs progrese mari, dar metodele existente de detectare a alcoolului izoamilic bazate pe cromatografia în gaze și cromatografia lichidă de înaltă performanță sunt laborioase și consumatoare de timp. În acest studiu, am dezvoltat un test colorimetric simplu pentru a determina tulpinile producătoare de alcool izoamil ridicat. Testul s-a bazat pe izoamil alcool oxidază și peroxidază (testul IAOP) și a putut fi efectuat în microplăci cu un randament ridicat și a avut un interval specific de detecție de 0-20 mM. Analiza de caracterizare a arătat că testul IAOP dezvoltat a fost foarte specific pentru alcoolul izoamil în comparație cu alți alcooli cu lanț ramificat. S-a observat puțină interferență cu testul din mediile de fermentație, microorganismele și produșii secundari de fermentație (de exemplu, acid lactic, acid acetic). Concluzionăm că testul IAOP pe bază de enzime poate fi utilizat pentru monitorizarea cu randament mare a tulpinilor care produc alcool izoamil și ar putea fi ajustat pentru a detecta tulpinile care produc mulți alți metaboliți.

Aceasta este o previzualizare a conținutului abonamentului, accesat prin instituția dumneavoastră.


Teste cu fenol. I. O clasificare a testelor și o revizuire a literaturii.

Vizualizările articolelor reprezintă suma compatibilă cu COUNTER a descărcărilor de articole cu text integral din noiembrie 2008 (atât PDF, cât și HTML) în toate instituțiile și persoanele fizice. Aceste valori sunt actualizate în mod regulat pentru a reflecta utilizarea din ultimele zile.

Citările reprezintă numărul altor articole care citează acest articol, calculate de Crossref și actualizate zilnic. Găsiți mai multe informații despre numărul de citări Crossref.

Scorul Altmetric de Atenție este o măsură cantitativă a atenției pe care un articol de cercetare a primit-o online. Făcând clic pe pictograma gogoși, se va încărca o pagină la altmetric.com cu detalii suplimentare despre scor și prezența pe rețelele sociale pentru articolul dat. Găsiți mai multe informații despre Scorul de atenție Altmetric și despre cum este calculat scorul.

Notă: În loc de rezumat, aceasta este prima pagină a articolului.


Cuprins

MTT, un tetrazol galben, este redus la formazan violet în celulele vii. [4] Se adaugă o soluție de solubilizare (de obicei fie dimetil sulfoxid, o soluție de etanol acidificat, fie o soluție de detergent dodecil sulfat de sodiu în acid clorhidric diluat) pentru a dizolva produsul formazan violet insolubil într-o soluție colorată. Absorbanța acestei soluții colorate poate fi cuantificată prin măsurarea la o anumită lungime de undă (de obicei între 500 și 600 nm) cu un spectrofotometru. Gradul de absorbție a luminii este dependent de gradul de concentrație de formazan acumulat în interiorul celulei și pe suprafața celulei. Cu cât concentrația de formazan este mai mare, cu atât culoarea violet este mai profundă și, prin urmare, absorbanța este mai mare.

XTT (2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazoliu-5-carboxanilida) a fost propusă pentru a înlocui MTT, dând o sensibilitate mai mare și un interval dinamic mai mare. Colorantul formazan format este solubil în apă, evitând o etapă finală de solubilizare. [5]

Sărurile de tetrazoliu solubile în apă sunt alternative mai recente la MTT: au fost dezvoltate prin introducerea de sarcini pozitive sau negative și grupări hidroxi în inelul fenil al sării de tetrazoliu, sau mai bine cu grupări sulfonat adăugate direct sau indirect la ciclul fenil.

MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazoliu), în prezența metosulfatului de fenazină (PMS), produce un produs formazan care are o absorbanță maximă la 490 nm în soluție salină tamponată cu fosfat. Testul MTS este adesea descris ca un test MTT „într-o etapă”, care oferă confortul de a adăuga reactivul direct la cultura celulară, fără etapele intermitente necesare în testul MTT. Cu toate acestea, această comoditate face ca testul MTS să fie susceptibil la interferența colorimetrică, deoarece etapele intermitente din testul MTT îndepărtează urmele de compuși colorați, în timp ce acestea rămân în placa de microtitrare în testul MTS într-o singură etapă. Sunt necesare precauții pentru a asigura acuratețea atunci când se utilizează acest test și există argumente puternice pentru confirmarea rezultatelor MTS folosind observații calitative la microscop. (Acest lucru, totuși, este prudent pentru toate testele colorimetrice.) [6]

WST-uri (sărurile de tetrazoliu solubile în apă) sunt o serie de alți coloranți solubili în apă pentru teste MTT, dezvoltați pentru a oferi diferite spectre de absorbție a formazanilor formați. [7] WST-1 și în special WST-8 (2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazoliu) sunt avantajoase peste MTT prin faptul că acestea sunt reduse în afara celulelor, combinate cu mediatorul de electroni PMS și produc un formazan solubil în apă. În cele din urmă, testele WST (1) pot fi citite direct (spre deosebire de MTT care necesită o etapă de solubilizare), (2) oferă un semnal mai eficient decât MTT și (3) scad toxicitatea pentru celule (spre deosebire de MTT permeabil la celule și insolubilul său). formazan care se acumulează în interiorul celulelor). [7]


Referințe

Fernandez, P. G. & Mikhael, M. Considerații perioperatorii pentru pacientul pediatric alergic alimentar. Pediatr Anesth 27, 461–470 (2017).

Peters, R.L. et al. Prevalența alergiei alimentare și a altor boli alergice în copilăria timpurie într-un studiu bazat pe populație: Urmărirea în vârstă de 4 ani HealthNuts. J Alergie Clin Immun 140, 145-+ (2017).

Burks, A. W. Alergia la arahide. The Lancet 371, 1538–1546, https://doi.org/10.1016/s0140-6736(08)60659-5 (2008).

Adatia, A., Clarke, A. E., Yanishevsky, Y. & Ben-Shoshan, M. Alergia la susan: perspective actuale. Jurnal de astm și alergie 10, 141–151, https://doi.org/10.2147/JAA.S113612 (2017).

Panda, R., Tetteh, A. O., Pramod, S. N. și Goodman, R. E. Hidroliza enzimatică nu reduce reactivitatea biologică a proteinelor din soia pentru toți subiecții alergici. Revista de chimie agricolă și alimentară 63, 9629–9639, https://doi.org/10.1021/acs.jafc.5b02927 (2015).

Polk, B. I. & Dinakar, C. Rezultate centrate pe pacient în alergii alimentare. Curr Alergie Astm R 17 (2017).

Anzengruber, J. et al. Stratul S de Lactobacillus buchneri ca purtător pentru o peptidă derivată Ara h 2 pentru imunoterapia specifică alergenului de arahide. Imunologie moleculară 85, 81–88, https://doi.org/10.1016/j.molimm.2017.02.005 (2017).

Schroder, P. C. et al. Polimorfismele IL-33 sunt asociate cu risc crescut de febră a fânului și celule T reglatoare reduse într-o cohortă de naștere. Pediat Allerg Imm-Uk 27, 687–695 (2016).

Zhang, Y. Z. et al. Purificarea și caracterizarea unui alergen de nuc negru (Juglans nigra), jug n. 4. Revista de chimie agricolă și alimentară 65, 454–462 (2017).

Zhang, W. J., Cai, Q., Guan, X. & Chen, Q. Detectarea alergenului de arahide (Arachis hypogaea) prin metoda PCR în timp real cu control intern de amplificare. Chimia alimentelor 174, 547–552, https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2014.11.091 (2015).

Rodriguez, A., Werning, M. L., Rodriguez, M. & amp Bermudez, E. & amp Cordoba, J. J. Metodă PCR cantitativă în timp real cu control intern de amplificare pentru a cuantifica mucegaiurile producătoare de acid ciclopiazonic în alimente. Microbiologia alimentelor 32, 397–405, https://doi.org/10.1016/j.fm.2012.08.001 (2012).

Zhang, K., Bangma, C. H. și Roobol, M. J. Screeningul cancerului de prostată în Europa și Asia. Jurnalul Asiatic de Urologie 4, 86–95, https://doi.org/10.1016/j.ajur.2016.08.010 (2017).

Luo, J. Biomarkeri acționabili non-invazivi pentru cancerul de prostată metastatic. Jurnalul Asiatic de Urologie 3, 170–176, https://doi.org/10.1016/j.ajur.2016.09.003 (2016).

Berthuy, O. I., Blum, L. J. & Marquette, C. A. Cells on chip for multiplex screening. Biosenzori și bioelectronice 76, 29–37 (2016).

Hanson, B. et al. Caracterizarea microbiomului bacterian și fungic în probele de praf din interior și aer exterior: un studiu pilot. Environ Sci-Proc Imp 18, 713–724 (2016).

Vincent, M., Xu, Y. & amp Kong, H. M. Amplificarea ADN izotermă dependentă de helicaza. Embo Rep 5, 795–800 (2004).

Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L. & Armes, N. A. Detectarea ADN-ului folosind proteine ​​de recombinare. Plos Biol 4, 1115–1121 (2006).

Mugasa, C. M. et al. Comparația dintre amplificarea bazată pe secvența de acid nucleic și amplificarea izotermă mediată de buclă pentru diagnosticarea tripanosomiazei umane africane. Diagn Micr Infec Dis 78, 144–148 (2014).

Liu, D. Y., Daubendiek, S. L., Zillman, M. A., Ryan, K. & amp Kool, E. T. Rolling circle DNA synthesis: Small circular oligonucleotides as efficient templates for DNA polymerases. J Am Chem Soc 118, 1587–1594 (1996).

Notomi, T. et al. Amplificarea izotermă a ADN-ului mediată de buclă. Acizi nucleici Res 28 (2000).

Liu, X.T. et al. Amplificare izotermă mediată de buclă bazată pe regiunea COI mitocondrială pentru a detecta Pratylenchus zeae. Eur J Plant Pathol 148, 435–446 (2017).

Seo, J.H. et al. Dezvoltarea unui microdispozitiv de amplificare izotermă mediată de buclă centrifugă de mare capacitate pentru detectarea multiplex a bacteriilor patogene de origine alimentară. Senzor Actuat B-Chem 246, 146–153 (2017).

Zhao, N., Liu, J. X. & Sun, D. X. Detectarea genotipurilor HCV 1b și 2a printr-un test de amplificare izotermă mediată de bucla de transcripție inversă. J Med Virol 89, 1048–1054 (2016).

Foudeh, A. M., Didar, T. F., Veres, T. & Tabrizian, M. Proiecte și tehnici microfluidice care utilizează dispozitive de laborator-on-a-chip pentru detectarea agenților patogeni pentru diagnosticarea la punctul de îngrijire. Chip de laborator 12, 3249–3266 (2012).

Haeberle, S. & Zengerle, R. Platforme microfluidice pentru aplicații lab-on-a-chip. Chip de laborator 7, 1094–1110 (2007).

Park, B.H. et al. Un sistem microfluidic rotativ integrat cu extracție ADN, amplificare izotermă mediată de buclă și detectare bazată pe bandă de flux lateral pentru diagnosticarea agenților patogeni la punctul de îngrijire. Biosenzori și bioelectronice 91, 334–340 (2017).

Zhang, L. et al. Testarea la punctul de îngrijire a acizilor nucleici prin microfluidic. Trac-Trend Anal Chem 94, 106–116 (2017).

Zhang, L. et al. Platformă microfluidică centrifugă alimentată manual, inspirată de topul de rotire pentru diagnosticarea probă la răspuns a acizilor nucleici. Chip de laborator 18, 610–619, https://doi.org/10.1039/c7lc01234a (2018).

Dou, M. W., Sanjay, S. T., Benhabib, M., Xu, F. & amp Li, X. J. Bioanaliza cu costuri reduse pe platformele sale microfluidice hibride pe hârtie. Talanta 145, 43–54 (2015).

Dou, M., Dominguez, D. C., Li, X., Sanchez, J. & amp Scott, G. O platformă microfluidică hibridă PDMS/hârtie versatilă pentru diagnosticarea bolilor infecțioase sensibile. Chimie analitică 86, 7978–7986, https://doi.org/10.1021/ac5021694 (2014).

Dou, M. W. et al. Diagnosticul de meningită multiplexat fără instrumente pe un biocip microfluidic hibrid polimer/hârtie. Biosenzori și bioelectronice 87, 865–873 (2017).

Poole, C. B. et al. Teste colorimetrice pentru diagnosticul infecției filariale și supravegherea vectorilor folosind amplificarea izotermă mediată de buclă de acid nucleic neinstrumentată (NINA-LAMP). Plus unu 12 (2017).

Dou, M. W., Sanjay, S. T., Dominguez, D. C., Zhan, S. H. & amp Li, X. J. Un SpinChip microfluidic de tip CD hibrid hârtie/polimer integrat cu nanosezori de oxid de grafen funcționalizați cu ADN pentru detectarea qLAMP multiplex. Chem Commun 53, 10886–10889 (2017).

O, S.J. et al. Microdispozitiv de amplificare izotermă mediată prin buclă centrifugă pentru detectarea rapidă, multiplexă și colorimetrică a agenților patogeni din alimente. Biosenzori și bioelectronice 75, 293–300 (2016).

Sayad, A. A. et al. O amplificare izotermă mediată de buclă integrată de laborator microfluidic pe disc pentru detectarea agenților patogeni de origine alimentară. Senzor Actuat B-Chem 227, 600–609 (2016).

Porebski, S., Bailey, L. G. & amp Baum, B. R. Modificarea unui protocol de extracție a ADN-ului CTAB pentru plante care conțin componente de polizaharide și polifenoli mari. Plant Mol Biol Rep 15, 8–15 (1997).

Hirao, T., Watanabe, S., Temmei, Y., Hiramoto, M. & amp Kato, H. Metode de reacție în lanț a polimerazei calitative pentru detectarea alergenilor alimentari majori (arahide, soia și grâu) prin utilizarea regiunii distanțiere transcrise interne. J Aoac Int 92, 1464–1471 (2009).

Mustorp, S., Engdahl-Axelsson, C., Svensson, U. & Holck, A. Detectarea țelinei (Apium graveolens), muștarului (Sinapis alba, Brassica juncea, Brassica nigra) și susanului (Sesamum indicum) în alimente prin real -time PCR. Eur Food Res Technol 226, 771–778 (2008).


REZULTATE

Oligonucleotidele sintetice imobilizate în godeul microplăcilor pot fi utilizate pentru a măsura activitatea enzimelor individuale în calea de reparare a exciziei bazei

Pentru fiecare test, un complex de oligonucleotide sintetice care poartă o singură bază modificată sau leziune reprezentativă pentru un intermediar din calea BER a fost atașat la suprafața unei microplăci (Figura suplimentară S1). Mai întâi, o singură oligonucleotidă a fost atașată covalent, printr-o modificare amino la capătul său 3', la suprafața godeurilor din plăcile cu 96 de godeuri Nunc® Immobiliser™ amino. O a doua oligonucleotidă, complementară cu prima în regiunea capătului său 5′, cu o structură buclă în ac de păr la capătul său 3′ și un fragment de fluoresceină la capătul 5′ a fost apoi hibridizată cu prima. Oligonucleotidele au fost proiectate astfel încât să existe un „distanțier” cu două nucleotide, compus din nucleotide unite prin legături fosforotiate, între NH2 grupul și prima bază a secțiunii dublu catenare a complexului oligonucleotidic. În cazul testelor UDG, a inciziei site-ului AP, AAG și ADN ligazei, oligonucleotidele utilizate formează un complex de bucle de ac de păr dublu catenar imobilizat cu o ustură unică ligabilă între capătul 5′ al primei oligonucleotide legată de placă și 3′ capătul celui de-al doilea hibridizat cu primul. Pentru testul ADN ligazei, acesta a format substratul final al testului. Pentru testele UDG, incizia site-ului AP și AAG, poreca a fost ligată prin incubarea cu ADN ligază T4 în exces pentru a genera structuri intacte de buclă în ac de păr. Rețineți că am constatat că cuplarea complexului pre-hibridat și legat la godeuri a dus la un semnal de fond inacceptabil de ridicat, în timp ce hibridizarea în godeu și ligarea după cuplarea primei oligonucleotide la godeuri au depășit această problemă.

Substratul UDG format conține un singur uracil cu o adenină sau guanină opusă pe catena complementară, în funcție de dacă a fost utilizată oligonucleotida Loop01Aflc sau Loop01Gflc. Substratul de incizie a situsului AP format conține un singur analog de situs AP cu o adenină, citozină, guanină sau timină opusă pe catena complementară, în funcție de utilizarea oligonucleotidelor Loop01Aflc, Loop01Cflc, Loop01Gflc sau Loop01Tflc. Pentru testul AAG, substratul format conține o singură pereche de baze hipoxantină:timină. În cazul testului ADN polimerazei, structura a fost în esență identică cu cea utilizată pentru testul ADN-ligazei, cu excepția faptului că a existat un singur spațiu nucleotidic între capătul 5′ al primei oligonucleotide și capătul 3′ al celui de-al doilea.

Structura buclei ac de păr a fost încorporată în designul substratului de analiză din două motive. În primul rând, în urma legăturii celor două oligonucleotide utilizate pentru a genera UDG, incizia site-ului AP și substraturile AAG, este important să se îndepărteze orice complexe nelegate, care ar putea confunda rezultatele testelor dacă ligazele prezente în extractele nucleare au acționat asupra acestor complexe în timpul reparării. etapa de incubare. Diferența dintre temperatura de topire a complexului neligat și structura ac de păr legată este mai mare decât ar fi pentru o temperatură de topire a complexului dublu catenar liniar echivalent, făcând îndepărtarea oligonucleotidului neligat fără a denatura complexul ligat. În al doilea rând, structura buclei reduce numărul de capete libere ale catenelor accesibile degradării de către exonucleaze nespecifice care ar putea fi prezente în extractele celulare. Ca o protecție suplimentară împotriva exonucleazelor, legăturile fosforotioat au fost încorporate între cele trei nucleotide terminale la capătul 3′ al oligonucleotidelor atașate la suprafața godeului și la capetele 5′ ale oligonucleotidelor hibridizate cu cele atașate direct la godeuri.

Experimentele preliminare au fost efectuate folosind un interval de concentrații de oligonucleotide pentru a determina cantitățile minime care ar furniza semnal adecvat. Detectarea prin fluorescență directă a fluoresceinei reținute în godeuri a necesitat o concentrație inițială de oligonucleotide de ≥5 nM, în timp ce detectarea colorimetrică robustă a fluoresceinei reținute în godeuri pe baza utilizării anticorpului anti-fluoresceină conjugat cu HRP ar putea fi realizată cu oligonucleotide mult mai mici. concentrații (≤0,5 nM) (datele nu sunt prezentate). Pe baza acestei observații, sistemul de detecție colorimetric a fost utilizat în mod obișnuit în experimentele ulterioare.

Activitatea ADN-glicozilazei uracil

Datorită interesului nostru special de cercetare privind efectele încorporării greșite a uracilului care rezultă din metabolismul aberant al unui carbon, am început munca de validare pentru acest test folosind un substrat de oligonucleotide care conține o pereche de baze U:A înainte de a-l valida și pentru substratul care conține un U: Nepotrivire G, reprezentativă pentru leziunea rezultată din dezaminarea citozinei. În experimentele inițiale, efectuate cu un substrat care conține o pereche de baze U:A, activitatea UDG în extractul nuclear HepG2 s-a dovedit dificil de detectat, în timp ce activitatea recombinantului E coli UDG a fost detectat cu ușurință. În unele experimente, dar nu în toate, a apărut o mică scădere a semnalului odată cu creșterea concentrației de extract nuclear la capătul inferior al intervalului testat (de obicei, în intervalul 0–0,5 μg/godeu), dar la concentrații mai mari de extract UDG activitatea părea a fi inhibată progresiv (datele nu sunt prezentate). Acest lucru ne-a determinat să presupunem că alte proteine ​​nucleare prezente în extract se leagă de ADN și blocau accesul UDG la locul leziunii. În sprijinul acestei ipoteze, am găsit adăugarea de exces de recombinant E coli UDG după incubare cu concentrații mai mari de extract nuclear nu a reușit să excizeze uracilul și să creeze locuri AP labile alcaline. Într-o încercare de a contracara inhibarea posibilă prin legarea nespecifică a altor proteine ​​nucleare la substratul testului, ADN-ul de spermă de hering a fost adăugat la incubațiile de reparare pentru a acționa ca concurent pentru proteinele care leagă ADN-ul. Prezența ADN-ului de spermă de hering în amestecul de reacție nu a interferat cu acțiunea UDG recombinant, în timp ce includerea sa a crescut dramatic activitatea UDG aparentă în extractul nuclear (Figura suplimentară S2). Pentru unele dintre celelalte teste descrise mai jos, în care au fost utilizate concentrații mai mici de extract nuclear (<0,5 μg/godeu), adăugarea de spermă de hering nu a fost strict necesară. Cu toate acestea, pentru consistență, ADN-ul spermei de hering a fost inclus în toate testele.

Când este incubat fie cu perechea de baze U:A, fie cu nepotrivire U:G care conține substraturi de oligonucleotide, recombinant E coli UDG a generat situsuri AP în substratul oligonucleotidului într-o manieră dependentă de concentrație, așa cum este evidențiat de producerea de situsuri alcaline labile convertite în rupturi de catenă în timpul etapei ulterioare de denaturare alcalină și, astfel, a scăzut reținerea oligonucleotidei conjugate cu fluoresceină detectabilă în godeuri (Figura 1A). Enzima a acționat de aproximativ 5 ori mai eficient asupra substratului care conține U:G, în concordanță cu preferințele de substrat cunoscute ale UDG-urilor familiei-1 ( 7). Parametrul KPisică/KM, denumită în mod diferit constanta de specificitate, constanta de performanță sau competența enzimatică ( 26), a fost determinată prin analiza de regresie neliniară a datelor de curs de timp generate pentru E coli UDG care acționează asupra ambelor substraturi (Figura 1B). KPisică/KM a fost estimat la 0,01 nM -1 s -1 pentru substratul care conține o nepotrivire U:G și la 0,002 nM -1 s -1 pentru substratul care conține o pereche de baze U:A. Valorile de KPisică/KM pentru E coli UDG-ul pe care l-am identificat sau derivat din lucrările publicate anterior a variat de 500 de ori de la 0,0002 la 0,1 nM -1 s -1 (27-31), deși 4 din cele 6 valori se încadrează în intervalul 0,01-0,06. Astfel, valorile determinate cu noul nostru format de analiză se încadrează în, sau aproape de, intervalul central al estimărilor publicate.

Efectul activității ADN-glicozilazei uracil asupra substraturilor oligonucleotidice care conțin o singură pereche de baze U:A sau nepotrivire U:G. Incubarea cu recombinant Escherichia coli uracil ADN glicozilaza a dus la dependenta de concentratia enzimei (A) și dependent de timp (B) scade cantitatea de substrat care conțin U:A (simboluri deschise) și U:G (simboluri închise) intact reținut în godeuri după denaturarea alcalină. Pentru analiza timpului, pătratele, cercurile și triunghiurile indică datele generate cu 0,1, 0,2 sau 0,4 unități/godeu, respectiv, pentru substratul care conține U:A sau cu 0,0125, 0,025 sau, respectiv, 0,05 unități/godeu, pentru U:G care contine substrat. Incubarea cu extract nuclear HepG2 (C) sau extract combinat de celule mononucleare din sângele periferic (D) a determinat, de asemenea, scăderi dependente de concentrație ale cantității de substrat intact care conține U:A și U:G reținut în godeuri. Pentru ambele substraturi, activitatea aparentă a ADN-glicozilazei de uracil a fost direct proporțională cu concentrația de HepG2 (E) și celulele mononucleare din sângele periferic (F) extract nuclear pe întreaga gamă testată (r 2 = 0,99 în ambele cazuri). Datele prezentate reprezintă media ± SD a replicărilor tehnice în trei exemplare, cu excepția datelor privind cursul de timp pentru care au fost analizate duplicatele.

Efectul activității ADN-glicozilazei uracil asupra substraturilor oligonucleotidice care conțin o singură pereche de baze U:A sau nepotrivire U:G. Incubarea cu recombinant Escherichia coli uracil ADN glicozilaza a dus la dependenta de concentratia enzimei (A) și dependent de timp (B) scade cantitatea de substrat intact care conține U:A (simboluri deschise) și U:G (simboluri închise) reținut în godeuri după denaturarea alcalină. Pentru analiza timpului, pătratele, cercurile și triunghiurile indică datele generate cu 0,1, 0,2 sau 0,4 unități/godeu, respectiv, pentru substratul care conține U:A sau cu 0,0125, 0,025 sau, respectiv, 0,05 unități/godeu, pentru U:G care contine substrat. Incubarea cu extract nuclear HepG2 (C) sau extract combinat de celule mononucleare din sângele periferic (D) a determinat, de asemenea, scăderi dependente de concentrație ale cantității de substrat intact care conține U:A și U:G reținut în godeuri. Pentru ambele substraturi, activitatea aparentă a ADN-glicozilazei de uracil a fost direct proporțională cu concentrația de HepG2 (E) și celulele mononucleare din sângele periferic (F) extract nuclear pe întreaga gamă testată (r 2 = 0,99 în ambele cazuri). Datele prezentate reprezintă media ± SD a replicărilor tehnice în trei exemplare, cu excepția datelor privind cursul de timp pentru care au fost analizate duplicatele.

În prezența ADN-ului de spermă de hering, scăderea așteptată a semnalului dependentă de concentrație a fost observată cu cantități crescânde de extract nuclear HepG2 (Figura 1C) și extract nuclear PBMC (Figura 1D) atât pentru substratul care conține U:A, cât și U:G. Ca și în cazul enzimei recombinante, ambele extracte nucleare au excizat uracilul de 4 până la 6 ori mai eficient din substratul care conține U:G decât substratul care conține U:A. Pentru ambele substraturi U:A și U:G, nivelul absolut aparent al activității UDG în extractul nuclear PBMC combinat a fost de aproximativ 7 ori mai mic decât în ​​extractul nuclear HepG2. Activitățile aparente UDG în extractele nucleare HepG2 și PBMC, determinate prin interpolare din curba standard generată de acțiunea recombinanților E coli UDG pe substratul care conține U:A sau U:G relevant, au fost direct proporționale cu cantitatea de extract nuclear adăugată pe întregul interval testat (0-4 μg/godeu pentru extractul HepG2 și 0-10 μg/godeu pentru PBMC extract) (Figura 1E și F).

Pentru a confirma faptul că reducerea semnalului dependentă de concentrație produsă de extractul nuclear s-a datorat în mod specific numai exciziei uracilului și nu degradării nespecifice a substratului oligonucleotidic, a fost incubat un substrat de control fără uracil intern sau alte leziuni ADN. în aceleaşi condiţii cu recombinant E coli Extract nuclear UDG sau HepG2. În aceste condiții, nici preparatul recombinant UDG și nici extractul nuclear nu au scăzut semnalul atunci când au fost incubate cu substratul de control, spre deosebire de efectul asupra substratului care conține uracil (Figura suplimentară S3). Mai mult, a fost utilizată analiza electroforetică pe gel pentru a caracteriza materialul eluat în timpul etapei de denaturare a testului UDG. Aceasta a demonstrat că eluatul conținea o oligonucleotidă detectabilă unică, care diferă ca dimensiune de Loop01Aird sau Loop01Aird legată la URA03, dar a migrat, așa cum era de așteptat, cu oligonucleotida marcată cu fluorofor produsă atunci când Loop01Aird s-a hibridizat și ligat la URA03 în soluție a fost incubată. E coli UDG și apoi încălzit în condiții alcaline pentru a converti site-urile AP în SSB (Figura suplimentară S4).

Am evaluat în continuare specificitatea acestui test prin investigarea efectelor inhibitorului specific UDG UGI de la bacteriofagul PBS2 ( 32). Includerea UGI în incubațiile de reparare cu substratul care conține o pereche U:A a provocat inhibarea dependentă de concentrație a activității UDG cu un IC50 de 0,002 U/godeu atât pentru recombinant E coli UDG și activitatea UDG în extractul nuclear HepG2 (Figura suplimentară S5A). În schimb, UGI la concentrații de până la 2 U/godeu nu a avut un efect semnificativ asupra activității altor enzime de reparare a ADN-ului din extractul nuclear HepG2 analizat utilizând incizia situsului AP, testele ADN polimerază sau ADN ligază descrise mai jos (Figura suplimentară S5B-D ). Celulele de mamifere pot exprima până la patru UDG-uri cunoscute UNG (cu forma variantă UNG1 localizată în mitocondrii și UNG2 localizată în nucleu), TDG, SMUG1 și MBD4 ( 7). Dintre acestea, UGI inhibă numai UNG1 și 2. Deoarece diferite tipuri de celule au profile de expresie unice ale acestor UDG-uri diferite, am comparat efectele UGI asupra activității UDG aparente în HepG2 față de extractele nucleare PBMC. UGI, la 2U per reacție, a redus activitatea UDG aparentă cu 85-100% pentru ambele extracte celulare cu ambele substraturi de analiză (Figura suplimentară S5E), indicând faptul că UNG2 este activitatea predominantă detectată cu acest test pentru ambele tipuri de celule.

Activitatea de incizie a locului AP

Activitatea inciziei site-ului AP a fost măsurată folosind un substrat care conține un singur THF, un analog sintetic al site-ului AP utilizat în mod obișnuit în scopuri de cercetare ( 33, 34). THF a fost poziționat în aceeași locație în substratul oligonucleotid ca și uracilul în substratul UDG. APE1 uman recombinant a acționat asupra acestui substrat pentru a produce urme de caten, ceea ce duce la scăderi dependente de concentrație și de timp ale cantității de oligonucleotidă intactă care conține THF purtând o fluoresceină 3′ după denaturarea neutră (Figura 2A și B). Pe baza analizei cursului de timp, KPisică/KM pentru recombinatul purificat APE1 a fost estimat la 0,05 nM-1 s-1. Estimări ale KPisică/KM pentru APE1 derivat din publicațiile anterioare, am identificat (35-44) a variat de aproximativ 50 de ori de la 0,026 (42) la 1,2 nM -1 s -1 (43). Cu toate acestea, 5 din cele 9 estimări au fost în intervalul 0,026–0,050 nM −1 s −1 , în acord cu estimarea KPisică/KM, am obtinut.

Efectul activității de incizie a situsului apurinic/apirimidinic (AP) asupra unui substrat oligonucleotidic care conține un singur analog de situs AP de tetrahidrofuran. Incubarea cu APE1 uman recombinant a dus la concentrația dependentă de enzimă (A) și dependent de timp (B) scade cantitatea de substrat intact retinuta in godeuri dupa denaturarea neutra. Pentru analiza timpului, pătratele, cercurile și triunghiurile indică datele generate cu 0,1, 0,2 sau 0,4 unități/godeu, respectiv. Incubarea cu extract nuclear HepG2 (C) sau extract nuclear combinat PBMC (D) a determinat, de asemenea, scăderi dependente de concentrație ale cantității de substrat intact reținut în godeuri. Activitatea aparentă de incizie a locului AP a fost direct proporțională cu concentrația de extract nuclear în intervalul 0-0,02 μg/godeu pentru extractul nuclear HepG2 (r 2 = 0.99) (E) și în intervalul 0–0,0125 μg/godeu pentru extractul nuclear de celule mononucleare din sângele periferic (r 2 = 0.95) (F). Datele prezentate reprezintă media ± SD a replicărilor tehnice în trei exemplare, cu excepția datelor privind cursul de timp pentru care au fost analizate duplicatele.

Efectul activității de incizie a situsului apurinic/apirimidinic (AP) asupra unui substrat oligonucleotidic care conține un singur analog de situs AP de tetrahidrofuran. Incubarea cu APE1 uman recombinant a condus la concentrația dependentă de enzimă (A) și dependent de timp (B) scade cantitatea de substrat intact retinuta in godeuri dupa denaturarea neutra. Pentru analiza timpului, pătratele, cercurile și triunghiurile indică datele generate cu 0,1, 0,2 sau 0,4 unități/godeu, respectiv. Incubarea cu extract nuclear HepG2 (C) sau extract nuclear combinat PBMC (D) a determinat, de asemenea, scăderi dependente de concentrație ale cantității de substrat intact reținut în godeuri. Activitatea aparentă de incizie a locului AP a fost direct proporțională cu concentrația de extract nuclear în intervalul 0-0,02 μg/godeu pentru extractul nuclear HepG2 (r 2 = 0.99) (E) și în intervalul 0–0,0125 μg/godeu pentru extractul nuclear de celule mononucleare din sângele periferic (r 2 = 0.95) (F). Datele prezentate reprezintă media ± SD a replicărilor tehnice în trei exemplare, cu excepția datelor privind cursul de timp pentru care au fost analizate duplicatele.

Extractele nucleare HepG2 și PBMC au provocat, de asemenea, scăderi dependente de concentrație ale cantității de substrat intact reținut în godeuri (Figura 2C și D). Activitatea de incizie a locului AP în extractele nucleare a fost direct proporțională cu cantitatea de extract adăugată în intervalul 0-0,02 μg/godeu pentru extractul nuclear HepG2 (Figura 2E) și 0-0,0125 μg/godeu pentru extractul nuclear PBMC (Figura 2F). ). Analiza electroforetică pe gel a materialului eluat în timpul etapei de denaturare a confirmat că incubarea substratului cu extract nuclear HepG2 a condus la eliberarea unei oligonucleotide unice care a migrat împreună cu oligonucleotida eluată în timpul etapei de denaturare a testului UDG (Figura suplimentară S4).

De asemenea, am evaluat efectul nucleotidului opus leziunii THF prin compararea activităților de incizie a situsului AP ale extractului nuclear recombinant APE1 și HepG2 care acționează asupra substraturilor oligonucleotidice generate prin hibridizarea și ligatura Loo01Aflc, Loop01Cflc, Loop01Gflc sau Loop01Tflc sau Loop01Tflc cu plăcile imobilizate AP002. . Folosind această abordare, am descoperit că APE1 recombinant a avut activitate de incizie în esență identică, indiferent de nucleotida situată vizavi de THF (Figura suplimentară S6A). Această observație este în conformitate cu funcția generalizată a APE1 de a acționa la orice situs AP și cu caracterizarea anterioară a acestei enzime ( 45). Extractul nuclear HepG2 a prezentat, de asemenea, activitate similară de incizie a locului AP, indiferent de tipul de nucleotidă opusă THF (Figura suplimentară S6B).

Din cunoștințele noastre, în prezent nu există un inhibitor competitiv de înaltă specificitate validat riguros disponibil pentru activitatea de incizie a site-ului AP a APE1, principala endonuclează de situs AP a mamiferelor. Cu toate acestea, metioxiamina acționează ca un inhibitor necompetitiv al APE1 prin modificarea chimică a situsurilor AP într-o formă asupra căreia APE1 acționează mult mai puțin eficient ( 46 ). Prin urmare, am investigat efectele pretratării cu metoxiamină a unui substrat care conține un situs AP (generat de tratamentul UDG al substratului care conține uracil) asupra activității de incizie a site-ului AP a extractului nuclear HepG2. Pre-tratamentul cu metoxiamină a condus la o scădere dependentă de concentrație a gradului de incizie a firului obținut atunci când a fost utilizat extract nuclear HepG2 4 ng/godeu (Figura suplimentară S7A). IC50 valoarea estimată pentru această acțiune inhibitorie a fost de 1,4 mM și nicio activitate de incizie a locului AP nu a fost detectabilă atunci când substratul a fost pretratat cu concentrații de metoxiamină de 5 mM sau mai mari. Cu toate acestea, incubarea cu 1 μg/godeu de extract nuclear HepG2 în godeuri pretratate cu metoxiamină 25 mM a condus la o măsură similară a inciziei substratului cu cea observată cu 4 ng de extract nuclear HepG2 în absența pretratării cu metoxiamină (date neprezentat), în concordanță fie cu capacitatea raportată a APE1 de a acționa asupra situsurilor AP modificate cu metoxiamină cu o eficiență mult redusă ( 47), fie cu prezența, la niveluri mai mici, a altor enzime capabile de incizie AP la situsurile AP modificate cu metoxiamină din extract .

Pretratamentul cu metoxiamină (25 nM) a substratului pentru testul UDG sau substratul pentru testul inciziei site-ului AP, care conține analogul situsului AP THF, nu a avut niciun efect asupra activității aparente de incizie UDG și a site-ului AP a extractului nuclear HepG2 (Figura suplimentară S7B și C). Pe de altă parte, pretratarea cu metoxiamină (25 nM) a substraturilor pentru testele ADN polimerază și ADN ligază, descrise mai jos, a condus la o reducere moderată (aproximativ 25–50%) a activităților enzimatice detectate în extractul nuclear HepG2 folosind aceste două teste (Figura suplimentară S7D și E). Aceste observații sugerează că, la concentrații mari, metoxiamina reacționează slab cu substraturile care conțin o singură ruptură a catenei pentru a inhiba parțial ligatura catenei și poate etapa de umplere a golului, dar cu substraturi de oligonucleotide intacte ea reacționează doar cu situsurile abazice naturale pentru a crea o formă care este mult mai mare. mai rezistent la incizia locului AP.

Activitatea ADN polimerazei

Pentru a determina activitatea ADN-polimerazelor din extractele nucleare capabile să lucreze pe goluri cu un singur nucleotide cu capete ale coloanei vertebrale ADN prelucrate, substratul preparat a fost identic cu cel utilizat în testele descrise mai sus, dar cu un singur gol nucleotidic în aceeași poziție în secvență. ca uracil și THF utilizate pentru testele de incizie UDG și AP. Acest test necesită nu numai acțiunea ADN polimerazei pentru a umple golul, ci și ADN-ligazei pentru a sigila ruptura monocatenarului, astfel încât activitatea enzimatică să fie detectată ca o creștere a oligonucleotidei intacte care poartă fragmentul de fluoresceină 3′ în urma reacției de reparare și ulterioară. etapa de denaturare. Prin urmare, excesul de ADN ligază T4 a fost adăugat la toate reacțiile pentru a se asigura că activitatea polimerazei a fost limitatoare de viteză. O curbă standard, construită folosind diluții în serie ale fragmentului exo - Klenow recombinant, a produs creșterea așteptată a semnalului dependentă de concentrație (Figura 3A). Incubarea substratului cu extract nuclear HepG2 sau PBMC a produs, de asemenea, o creștere dependentă de concentrație a semnalului (Figura 3B și C). Activitatea aparentă a ADN polimerazei în extractele nucleare, bazată pe interpolarea din curba standard produsă folosind exo - Klenow, a fost direct proporțională cu cantitatea de extract adăugată în intervalul 0–0,06 μg/godeu pentru extractul nuclear HepG2 și 0–0,25 μg /godeu pentru extractul nuclear PBMC combinat (Figura 3D și E). În absența dNTP-urilor sau ATP-ului din amestecul de reacție, nu a fost detectată nicio activitate de reparare cu exo - Klenow sau cu extracte nucleare (datele nu sunt prezentate). Astfel, omiterea dNTP-urilor și ATP-urilor din amestecurile de reacție pentru testele de incizie a ADN-glicozilazei și a site-ului AP evită potențiala confuzie a acestor teste prin acțiunea ADN polimerazelor sau ADN-ligazelor din extractul nuclear.

Test pentru activitatea de reparare a ADN polimerazei. Incubarea unui substrat oligonucleotidic imobilizat în buclă de ac de păr care conține un singur spațiu nucleotidic pe o singură catenă din regiunea dublu catenară cu exonuclează minus fragmentul Klenow de Escherichia coli ADN polimeraza I, în prezența dNTPs, ATP și excesul de ADN ligază T4, a condus la o creștere a substratului intact reținut în godeurile microplăcilor după denaturarea neutră care a fost dependentă de concentrația polimerazei (A). Incubarea cu extract nuclear HepG2 (B) sau extract nuclear combinat cu celule mononucleare din sângele periferic (C) a determinat, de asemenea, creșteri dependente de concentrație ale cantității de substrat intact reținut în godeuri. Activitatea aparentă a ADN polimerazei a fost direct proporțională cu concentrația de extract nuclear în intervalul 0-0,06 μg/godeu pentru extractul nuclear HepG2 (r 2 = 0.98) (D) și în intervalul 0–0,25 μg/godeu pentru extractul nuclear de celule mononucleare din sângele periferic (r 2 = 0.99) (E). Datele prezentate reprezintă media ± SD a replicilor tehnice în trei exemplare.

Test pentru activitatea de reparare a ADN polimerazei. Incubarea unui substrat oligonucleotidic imobilizat în buclă de ac de păr care conține un singur spațiu nucleotidic pe o singură catenă din regiunea dublu catenară cu exonuclează minus fragmentul Klenow de Escherichia coli ADN polimeraza I, în prezența dNTPs, ATP și excesul de ADN ligază T4, a condus la o creștere a substratului intact reținut în godeurile microplăcilor după denaturarea neutră care a fost dependentă de concentrația polimerazei (A). Incubarea cu extract nuclear HepG2 (B) sau extract nuclear combinat cu celule mononucleare din sângele periferic (C) a determinat, de asemenea, creșteri dependente de concentrație ale cantității de substrat intact reținut în godeuri. Activitatea aparentă a ADN polimerazei a fost direct proporțională cu concentrația de extract nuclear în intervalul 0-0,06 μg/godeu pentru extractul nuclear HepG2 (r 2 = 0.98) (D) și în intervalul 0–0,25 μg/godeu pentru extractul nuclear de celule mononucleare din sângele periferic (r 2 = 0.99) (E). Datele prezentate reprezintă media ± SD a replicilor tehnice în trei exemplare.

Activitatea ADN ligazei

Substratul pregătit pentru testul ADN ligazei a fost identic cu cel utilizat în testul ADN polimerazei, cu excepția faptului că o nucleotidă suplimentară (T) a fost inclusă la capătul 5′ al oligonucleotidului atașat prin capătul său 3′ direct la suprafața godeurilor la generează un complex de oligonucleotide care conține o singură piesă ligabilă. S-au folosit diluții în serie de ADN ligază T4 recombinată pentru a genera curba standard (Figura 4A). Din nou, incubarea substratului cu HepG2 sau extract nuclear PBMC combinat a produs o creștere a semnalului dependentă de concentrație (Figura 4B și C). Activitatea aparentă a ADN-ligazei din extractele nucleare, bazată pe interpolarea din curba standard produsă folosind ADN-ligaza T4, a fost direct proporțională cu cantitatea de extract adăugată în intervalul 0-0,5 μg/godeu pentru extractul nuclear HepG2 și 0-0,63 μg/godeu pentru extractul nuclear PBMC reunit (Figura 4D și E). Ca și în cazul testelor ADN-polimerazei, nu a fost detectată nicio activitate de reparare cu testul ADN-ligazei atunci când ATP a fost omis din reacțiile de reparare. Mai mult, includerea L189, un inhibitor specific al ligazelor I, III și IV de ADN de mamifer ( 25), a inhibat activitatea ADN ligazei în extractul nuclear HepG2 într-o manieră dependentă de concentrație cu un IC50 de 14 μM (Figura suplimentară S8A), foarte asemănătoare cu IC-ul publicat anterior50 valori de 5 μM pentru ambele ADN ligaza I și IV și 9 μM pentru ADN ligaza III, determinate folosind enzimele purificate individuale ( 25). În contrast, ADN-ligaza T4 a fost mult mai puțin sensibilă la prezența L189. La concentrații sub 100 μM L189 nu a avut efecte semnificative ale activității ADN ligazei T4 și chiar și la 100 și 200 μM, cele mai mari concentrații testate, L189 a redus activitatea doar la 89% și, respectiv, 84% din valorile de control. L189 la o concentrație de 200 μM nu a avut niciun efect semnificativ asupra activităților BER ale extractului nuclear HepG2 măsurat folosind testele UDG, incizia site-ului AP sau ADN polimerază (Figura suplimentară S8B-D).

Test pentru activitatea ADN-ligazei. Incubarea unui substrat oligonucleotidic imobilizat în buclă de ac de păr, care conține o singură tăietură ligabilă într-o singură catenă din regiunea dublu catenară cu ADN ligază T4, în prezența ATP, a condus la o creștere a substratului intact reținut în godeurile microplăcilor după denaturarea neutră care a fost depinde de concentrația polimerazei (A). Incubarea cu extract nuclear HepG2 (B) și extract nuclear combinat cu celule mononucleare din sângele periferic (C) a determinat, de asemenea, creșteri dependente de concentrație ale cantității de substrat intact reținut în godeuri. Activitatea aparentă a ADN-ligazei a fost direct proporțională cu concentrația de HepG2 (D) și PBMC (E) extract nuclear în intervalul 0–0,5 μg/godeu pentru extractul nuclear HepG2 (r 2 = 0,99) și în intervalul 0–0,63 μg/godeu pentru extractul nuclear de celule mononucleare din sângele periferic (r 2 = 0,99). Datele prezentate reprezintă media ± SD a replicilor tehnice în trei exemplare.

Test pentru activitatea ADN-ligazei. Incubarea unui substrat oligonucleotidic imobilizat în buclă de ac de păr, care conține o singură tăietură ligabilă într-o singură catenă din regiunea dublu catenară cu ADN ligază T4, în prezența ATP, a condus la o creștere a substratului intact reținut în godeurile microplăcilor după denaturarea neutră care a fost depinde de concentrația polimerazei (A). Incubarea cu extract nuclear HepG2 (B) și extract nuclear combinat cu celule mononucleare din sângele periferic (C) a determinat, de asemenea, creșteri dependente de concentrație ale cantității de substrat intact reținut în godeuri. Activitatea aparentă a ADN-ligazei a fost direct proporțională cu concentrația de HepG2 (D) și PBMC (E) extract nuclear în intervalul 0–0,5 μg/godeu pentru extractul nuclear HepG2 (r 2 = 0,99) și în intervalul 0–0,63 μg/godeu pentru extractul nuclear de celule mononucleare din sângele periferic (r 2 = 0,99). Datele prezentate reprezintă media ± SD a replicilor tehnice în trei exemplare.

Sensibilitatea testului și reproductibilitatea

Limitele inferioare de detecție pentru fiecare dintre testele cu un singur pas de reparare descrise mai sus au fost estimate pe baza curbelor standard, așa cum este explicat în secțiunea metode, iar cantitatea minimă de proteină nucleară HepG2 necesară pentru a detecta activitatea a fost găsită utilizând limita inferioară de detecție pentru fiecare enzimă. Coeficienții de variație intra și inter-test (CV) au fost determinați prin analize repetate ale probelor de control al calității extractului nuclear (Tabelul 2). Aceste analize demonstrează că toate cele patru teste sunt foarte sensibile și oferă o bună reproductibilitate, cu CV-uri intra-test în general <10% și CV-uri inter-test în general <15%. Luate împreună, rezultatele noastre demonstrează că am generat un panou sensibil și reproductibil de teste pe bază de microplăci care sunt capabile să măsoare fiecare pas controlat enzimatic al căii BER.

Sensibilitatea și reproductibilitatea testelor activității enzimelor de reparare a ADN-ului

Testare . LoD inferior (U/godeu) a . Cantitatea de NE (ng/godeu) b . CV intra-test (%) c. CV inter-test (%) d.
1000 18 ± 3 18
UDG (U:A) e 0.009 2000 10 ± 2 10
3000 8 ± 2 6
UDG (U:G)6 0.006 nd nd nd
2 28 ± 11 8
Incizie la locul AP 0.005 4 14 ± 3 13
8 12 ± 4 12
12.5 12 ± 4 15
ADN polimeraza 8 × 10 −7 25 5 ± 1 9
50 9 ± 3 6
100 5 ± 1 6
ADN ligaza 2 × 10 −6 200 5 ± 2 10
200 10 ± 4 20
Testare . LoD inferior (U/godeu) a . Cantitatea de NE (ng/godeu) b . CV intra-test (%) c. CV inter-test (%) d.
1000 18 ± 3 18
UDG (U:A) e 0.009 2000 10 ± 2 10
3000 8 ± 2 6
UDG (U:G)6 0.006 nd nd nd
2 28 ± 11 8
Incizie la locul AP 0.005 4 14 ± 3 13
8 12 ± 4 12
12.5 12 ± 4 15
ADN polimeraza 8 × 10 −7 25 5 ± 1 9
50 9 ± 3 6
100 5 ± 1 6
ADN ligaza 2 × 10 −6 200 5 ± 2 10
200 10 ± 4 20

a Limită inferioară de detecție (LoD) calculată prin interpolarea activității enzimatice pentru absorbanța medie la enzima 0U minus 2 × SD pentru uracil ADN glicozilazei (UDG) și testele de incizie a locului AP sau absorbanța medie la enzima 0U plus 2 × SD pentru ADN polimeraza și Testele ADN ligazei.

b Cantități de extract nuclear (NE) utilizate pentru determinările coeficienților de variație (CV) de testare.

c Media ± SD a CV intra-test pe baza a patru analize individuale, fiecare dintre cele opt replici tehnice.

d CV intertestare calculat din testele efectuate pe patru plăci independente.

e Sensibilitatea și reproductibilitatea testului UDG care măsoară excizia uracilului dintr-un substrat care conține o pereche de baze U:A.

f Sensibilitatea testului UDG care măsoară excizia uracilului dintr-un substrat care conține o nepotrivire U:G. O probă de control al calității HepG2 NE a fost utilizată pentru toate determinările CV ale testului, cu excepția UDG, pentru care a fost utilizată o probă de control al calității Caco-2 NE.

Sensibilitatea și reproductibilitatea testelor activității enzimelor de reparare a ADN-ului

Testare . LoD inferior (U/godeu) a . Cantitatea de NE (ng/godeu) b . CV intra-test (%) c. CV inter-test (%) d.
1000 18 ± 3 18
UDG (U:A) e 0.009 2000 10 ± 2 10
3000 8 ± 2 6
UDG (U:G)6 0.006 nd nd nd
2 28 ± 11 8
Incizie la locul AP 0.005 4 14 ± 3 13
8 12 ± 4 12
12.5 12 ± 4 15
ADN polimeraza 8 × 10 −7 25 5 ± 1 9
50 9 ± 3 6
100 5 ± 1 6
ADN ligaza 2 × 10 −6 200 5 ± 2 10
200 10 ± 4 20
Testare . LoD inferior (U/godeu) a . Cantitatea de NE (ng/godeu) b . CV intra-test (%) c. CV inter-test (%) d.
1000 18 ± 3 18
UDG (U:A) e 0.009 2000 10 ± 2 10
3000 8 ± 2 6
UDG (U:G)6 0.006 nd nd nd
2 28 ± 11 8
Incizie la locul AP 0.005 4 14 ± 3 13
8 12 ± 4 12
12.5 12 ± 4 15
ADN polimeraza 8 × 10 −7 25 5 ± 1 9
50 9 ± 3 6
100 5 ± 1 6
ADN ligaza 2 × 10 −6 200 5 ± 2 10
200 10 ± 4 20

a Limită inferioară de detecție (LoD) calculată prin interpolarea activității enzimatice pentru absorbanța medie la enzima 0U minus 2 × SD pentru uracil ADN glicozilazei (UDG) și testele de incizie a locului AP sau absorbanța medie la enzima 0U plus 2 × SD pentru ADN polimeraza și Testele ADN ligazei.

b Cantități de extract nuclear (NE) utilizate pentru determinările coeficienților de variație (CV) de analiză.

c Media ± SD a CV intra-test pe baza a patru analize individuale, fiecare dintre cele opt replici tehnice.

d CV inter-testare calculat din testele efectuate pe patru plăci independente.

e Sensibilitatea și reproductibilitatea testului UDG care măsoară excizia uracilului dintr-un substrat care conține o pereche de baze U:A.

f Sensibilitatea testului UDG care măsoară excizia uracilului dintr-un substrat care conține o nepotrivire U:G. O probă de control al calității HepG2 NE a fost utilizată pentru toate determinările CV ale testului, cu excepția UDG, pentru care a fost utilizată o probă de control al calității Caco-2 NE.

Apoi am folosit aceste teste pentru a compara activitățile enzimei BER în două linii celulare diferite (HepG2 și Caco-2) folosind seturi de extracte nucleare din fiecare tip de celulă care au fost izolate prin pasaje de cultură în serie. Analizele au demonstrat niveluri în general consistente de UDG, incizie a site-ului AP, activitate ADN polimerază și ADN ligază în cadrul fiecărui tip de celulă, dar diferențe notabile între cele două linii celulare (Figura 5). În timp ce activitatea activității de incizie a site-ului AP nu a diferit semnificativ între cele două tipuri de celule, activitatea aparentă UDG a fost de 1,7 ori mai mare în celulele Caco-2 decât în ​​HepG2 (P < 0,0005), în timp ce activitățile ADN polimerazei și ADN ligazei au fost de 2,0 și, respectiv, de 3,8 ori mai mici în celulele Caco-2 decât HepG2 (P < 0,0005 pentru ADN polimerază şi P < 0,05 pentru ADN ligaza). Aceste date indică faptul că activitățile enzimatice BER sunt relativ stabile în timp în fiecare dintre aceste linii celulare, că activitățile consistente pot fi obținute cu protocolul de extracție nucleară și că testele pot fi utilizate pentru a distinge profilurile specifice celulei ale activităților enzimatice BER.

Variabilitatea în interiorul și între linia celulară a activității enzimei de reparare a ADN-ului a celulelor HepG2 și Caco-2. (A) Activitatea ADN-glicozilazei de uracil a fost mai mare în extractul nuclear Caco-2 decât extractul nuclear HepG2. (B) Nu s-au găsit diferențe semnificative în activitatea de incizie a locului apurinic/apirimidinic între cele două linii celulare. (C) Activitatea ADN polimerazei a fost mai mică în extractul nuclear Caco-2 decât extractul nuclear HepG2. (D) Activitatea ADN ligazei a fost mai mică în extractul nuclear Caco-2 decât extractul nuclear HepG2. Barele indică media ± SD a șase replici independente. Simbolurile * și *** indică diferențe semnificative între activitățile enzimatice ale liniilor celulare la P < 0,05 și P < 0,001, respectiv (bazat pe două cozi nepereche t-teste).

Variabilitatea în interiorul și între linia celulară a activității enzimei de reparare a ADN-ului a celulelor HepG2 și Caco-2. (A) Activitatea ADN-glicozilazei de uracil a fost mai mare în extractul nuclear Caco-2 decât extractul nuclear HepG2. (B) Nu s-au găsit diferențe semnificative în activitatea de incizie a locului apurinic/apirimidinic între cele două linii celulare. (C) Activitatea ADN polimerazei a fost mai mică în extractul nuclear Caco-2 decât extractul nuclear HepG2. (D) Activitatea ADN ligazei a fost mai mică în extractul nuclear Caco-2 decât extractul nuclear HepG2. Barele indică media ± SD a șase replici independente. Simbolurile * și *** indică diferențe semnificative între activitățile enzimatice ale liniilor celulare la P < 0,05 și P < 0,001, respectiv (bazat pe două cozi nepereche t-teste).

Un obiectiv cheie al acestei lucrări a fost de a dezvolta teste adecvate pentru utilizare cu probe colectate din studii clinice. Pentru a evalua acest lucru, am efectuat o analiză pilot a activităților enzimelor de reparare a ADN-ului în extracte nucleare individuale PBMC derivate de la 13 voluntari aparent sănătoși (9 femei și 4 bărbați, cu vârsta cuprinsă între 22 și 50 de ani). UDG, incizia site-ului AP, activitățile ADN polimerază și ADN ligază au fost cuantificate în extracte nucleare PBMC de la fiecare individ. Pe baza observației unei activități UDG mai scăzute detectate la utilizarea substratului care conține o pereche de baze U:A, substratul care conține o pereche de baze U:G a fost utilizat pentru analiza UDG a acestor probe.

În conformitate cu rapoartele anterioare, a existat o variație inter-individuală substanțială a activităților enzimatice BER, variind de la 3,6 ori până la 6,3 ori diferențe de la activitățile maxime la minime la cei 13 voluntari pentru incizia site-ului AP și, respectiv, ADN ligaza ( 15) . Interesant, au existat, de asemenea, dovezi clare ale corelațiilor între activitățile diferitelor enzime cu o asociere semnificativă statistic între activitățile de incizie a UDG și AP (r = 0.703, P < 0,01), activitățile UDG și ADN ligazei (r = 0.753, P < 0,005), incizia locului AP și activitățile ADN ligazei (r = 0.786, P < 0,005) și activitățile ADN polimerazei și ADN ligazei (r = 0.725, P < 0,01) (Figura 6). Acest lucru sugerează că activitatea acestor diferite enzime BER poate fi coordonată. Cu toate acestea, aceste date provin dintr-un mic studiu pilot și este necesară analiza eșantioanelor dintr-o cohortă mult mai mare pentru a confirma aceste asocieri.

Activitatea enzimei de reparare prin excizie de bază este corelată între unele, dar nu toate, enzimele căii din extractele nucleare ale celulelor mononucleare din sângele periferic de la diferiți indivizi. (A) Activitatea uracilului ADN glicozilazei (UDG) a fost corelată pozitiv cu activitatea de incizie a locului apurinic/apirimidinic (AP) (r = 0.61, P < 0,05). (B) Activitatea UDG nu a fost corelată semnificativ cu activitatea ADN polimerazei (r = 0.58, P = 0.053). (C) Activitatea UDG a fost corelată pozitiv cu activitatea ADN ligazei (r = 0.81, P < 0,001). (D) Activitatea de incizie a locului AP nu a fost corelată semnificativ cu activitatea ADN polimerazei (r = 0.40, P = 0.177). (E) Activitatea de incizie a locului AP a fost corelată pozitiv cu activitatea ADN ligazei (r = 0.73, P < 0,01). (F) Activitatea ADN-polimerazei a fost corelată pozitiv cu activitatea ADN-ligazei (r = 0.67, P < 0,05).

Activitatea enzimei de reparare prin excizie de bază este corelată între unele, dar nu toate, enzimele căii din extractele nucleare ale celulelor mononucleare din sângele periferic de la diferiți indivizi. (A) Activitatea uracilului ADN glicozilazei (UDG) a fost corelată pozitiv cu activitatea de incizie a locului apurinic/apirimidinic (AP) (r = 0.61, P < 0,05). (B) Activitatea UDG nu a fost corelată semnificativ cu activitatea ADN polimerazei (r = 0.58, P = 0.053). (C) Activitatea UDG a fost corelată pozitiv cu activitatea ADN ligazei (r = 0.81, P < 0,001). (D) Activitatea de incizie a locului AP nu a fost corelată semnificativ cu activitatea ADN polimerazei (r = 0.40, P = 0.177). (E) Activitatea de incizie a locului AP a fost corelată pozitiv cu activitatea ADN ligazei (r = 0.73, P < 0,01). (F) Activitatea ADN polimerazei a fost corelată pozitiv cu activitatea ADN ligazei (r = 0.67, P < 0,05).

Repararea totală a situsului AP și testele ADN polimerază/dRP liază

În plus față de utilizarea pentru analiza activităților enzimelor de reparare la etapele individuale ale BER, acest format de analiză are potențialul de a fi utilizat pentru a determina activitatea combinată a enzimei pe mai multe etape în BER. Am testat acest lucru folosind site-ul AP ca punct de plecare, deoarece aceasta este o etapă comună în repararea multor leziuni procesate prin BER ( 3). Substratul pentru aceste teste a fost generat prin tratarea perechii de baze U:A care conține substratul testului UDG cu exces de recombinant. E coli UDG în godeurile plăcilor pentru a genera oligonucleotide în ac de păr imobilizate care conţin un singur situs AP. Această strategie a fost favorizată față de utilizarea substratului pentru testul de incizie a locului AP deoarece, în timp ce fragmentul THF încorporat ca analog al site-ului AP este acționat de către APE1, grupa de blocare 5′ rămasă în urmă nu poate fi excizată de POLB (48). Prin urmare, am prezice că repararea substratului care conține leziunea THF nu ar putea continua prin BER de plasture scurte.

Repararea completă a situsului AP generat din complexul URA03/Loop01Aflc ar trebui să conducă la încorporarea unei deoxitimidine la locul leziunii, iar complexul reparat rezultat va fi rezistent la denaturarea alcalină. Deoarece acesta este un proces de reparare în mai multe etape, o curbă standard nu poate fi generată utilizând diluții în serie ale unei singure enzime recombinante în același mod ca pentru testele descrise mai sus. Cu toate acestea, prin amestecarea oligonucleotidelor URA03 și Contr01 în rapoarte diferite înainte de cuplarea amestecurilor de oligonucleotide la godeurile microplăcilor, am reușit să generăm structuri bucle în ac de păr cu Loop01Aflc care conțineau proporții diferite de leziuni de uracil și apoi am putut demonstra că culoarea s-a dezvoltat în urma tratarea acestora cu exces de UDG și denaturarea alcalină ulterioară a fost direct proporțională cu cantitatea de substrat reținută în godeuri (Figura 7A). Astfel, prin includerea godeurilor de control în testul complet de reparare a situsului AP care au fost tratate fără extract celular și apoi supuse fie denaturarii alcaline, fie neutre, putem determina semnalul echivalent cu repararea zero și, respectiv, 100% și din acest interpolat. reparație procentuală realizată cu diferite cantități de extract nuclear.

Repararea completă a unui situs apurinic/apirimidinic (AP) sau a unui analog de situs AP tetrahidrofuran prin extract nuclear HepG2. Datele prezentate în (A) demonstrează că dezvoltarea culorii observată în godeurile plăcii de testare este direct proporțională cu cantitatea de oligonucleotidă modificată cu fluoresceină reținută în godeuri (r 2 = 0,99). Aceste date au fost generate prin (i) acoperirea godeurilor unei plăci Nunc® Immobilizer™ cu 0,5 pmol/godeu de amestecuri care conțin proporții variate de oligonucleotide URA03 (conținând o singură leziune de uracil) și Contr01 (control fără leziune), (ii) hibridizare și ligarea unei oligonucleotide complementare (Loop01Aflc) la amestecurile URA03/Contr01 imobilizate pentru a forma structuri de buclă de ac de păr intacte atașate covalent de placă la capătul 3′ cu un fragment de fluoresceină la capătul 5′, (iii) incubarea substraturilor imobilizate cu exces Escherichia coli uracil ADN glicozilaza pentru a exciza uracilul din acele oligonucleotide care le poartă pentru a crea situsuri AP, (iv) supunerea substratului la denaturarea alcalină fierbinte pentru a converti toate situsurile AP în rupturi monocatenari și pentru a elimina orice oligonucleotide eliberate ca rezultat și (v) detectarea fluoresceinei reținut în godeuri utilizând conjugat de peroxidază de hrean anti-fluoresceină și substrat TMB. Pe baza acestei observații, reparația procentuală a fost determinată prin interpolare liniară din valorile absorbanței pentru godeurile de control cu ​​reparare 0 și 100%. (B) Efectele concentrațiilor variate de extract nuclear HepG2 asupra gradului de reparare completă a situsului AP în absența (cercuri deschise) și prezența (cercuri închise) a excesului de ADN ligază T4. (C) Comparația gradului de reparare completă prin extractul nuclear HepG2 a unui complex de oligonucleotide care conține un situs AP care a fost fie pretratat, fie nu cu exces de endonuclează AP umană recombinată 1. (D) Comparația gradului de reparare completă a unei oligonucleotide care conține fie un situs AP normal (bare negre), fie analogul situsului AP tetrahidrofuran (bare albe) cu 800 sau 400 ng/godeu de extract nuclear HepG2 în prezența fie a 30 μM de toate cele patru deoxinucleotide (dATP, dCTP, dGTP și dTTP) sau doar 30 μM dTTP. Barele de eroare indică media ± SD a replicărilor tehnice triplicate.

Repararea completă a unui situs apurinic/apirimidinic (AP) sau a unui analog de situs AP tetrahidrofuran prin extract nuclear HepG2. Datele prezentate în (A) demonstrează că dezvoltarea culorii observată în godeurile plăcii de testare este direct proporțională cu cantitatea de oligonucleotidă modificată cu fluoresceină reținută în godeuri (r 2 = 0,99).Aceste date au fost generate prin (i) acoperirea godeurilor unei plăci Nunc® Immobilizer™ cu 0,5 pmol/godeu de amestecuri care conțin proporții variate de oligonucleotide URA03 (conținând o singură leziune de uracil) și Contr01 (control fără leziune), (ii) hibridizare și ligarea unei oligonucleotide complementare (Loop01Aflc) la amestecurile URA03/Contr01 imobilizate pentru a forma structuri de buclă de ac de păr intacte atașate covalent de placă la capătul 3′ cu un fragment de fluoresceină la capătul 5′, (iii) incubarea substraturilor imobilizate cu exces Escherichia coli uracil ADN glicozilaza pentru a exciza uracilul din acele oligonucleotide care le poartă pentru a crea situsuri AP, (iv) supunerea substratului la denaturarea alcalină fierbinte pentru a converti toate situsurile AP în rupturi monocatenari și pentru a elimina orice oligonucleotide eliberate ca rezultat și (v) detectarea fluoresceinei reținut în godeuri utilizând conjugat de peroxidază de hrean anti-fluoresceină și substrat TMB. Pe baza acestei observații, reparația procentuală a fost determinată prin interpolare liniară din valorile absorbanței pentru godeurile de control cu ​​reparare 0 și 100%. (B) Efectele concentrațiilor variate de extract nuclear HepG2 asupra gradului de reparare completă a situsului AP în absența (cercuri deschise) și prezența (cercuri închise) a excesului de ADN ligază T4. (C) Comparația gradului de reparare completă prin extractul nuclear HepG2 a unui complex de oligonucleotide care conține un situs AP care a fost fie pretratat, fie nu cu exces de endonuclează AP umană recombinată 1. (D) Comparația gradului de reparare completă a unei oligonucleotide care conține fie un situs AP normal (bare negre), fie analogul situsului AP tetrahidrofuran (bare albe) cu 800 sau 400 ng/godeu de extract nuclear HepG2 în prezența fie a 30 μM de toate cele patru deoxinucleotide (dATP, dCTP, dGTP și dTTP) sau doar 30 μM dTTP. Barele de eroare indică media ± SD a replicărilor tehnice triplicate.

Cu acest format de analiză, a fost observată o creștere dependentă de concentrație a reparației procentuale a substratului care conține site-ul AP utilizând extractul nuclear HepG2 variind de la 0 la 1 μg/godeu (Figura 7B). Am emis ipoteza, având în vedere nivelurile foarte ridicate ale activității de incizie a site-ului AP determinate în extractele celulare, că incizia la locul AP nu ar fi o etapă determinantă a ratei în acest test. În sprijinul acestui lucru, am constatat că amploarea reparării finalizate a fost aproape identică, indiferent dacă substratul care conține site-ul AP a fost sau nu tratat cu APE1 recombinat în exces înainte de incubarea reparației cu extract nuclear HepG2 de 0,4 μg/godeu (Figura 7C). În plus, amploarea reparării a fost în esență identică, indiferent dacă un amestec de toate cele patru dNTP-uri (30 μM fiecare) a fost inclus în incubația de reparare sau 30 μM numai de dTTP, ceea ce sugerează că a predominat repararea de plasture scurte (Figura 7D). Având în vedere aceste observații, unul sau mai mulți dintre ceilalți trei pași (umplerea golului de către o ADN polimerază, îndepărtarea grupului 5′ dRP printr-o lază dRP și legarea catenelor) trebuie să determine reparația totală procentuală observată. Prin urmare, am produs o variantă a acestui test în care excesul de ADN ligază T4 a fost inclus în reacțiile de reparare. ADN ligază T4 suplimentară a fost testată inițial la concentrații de 0,005 și 0,05 U/reacție pe baza faptului că acestea au fost suficiente pentru a conduce reacția la finalizare timp de 1 oră în testul ADN ligazei (Figura 4A). Am observat o îmbunătățire aproape identică a amplorii reparării complete a situsului AP cu ambele concentrații (datele nu sunt prezentate), confirmând că aceste concentrații de ADN ligază T4 au fost suficiente pentru a asigura efectul maxim. O analiză mai detaliată utilizând cea mai mare dintre aceste două concentrații de ADN ligază T4 a arătat că amploarea reparării a fost crescută cu aproximativ 8-12% în comparație cu testul efectuat în absența adăugată a ADN ligazei T4, în funcție de concentrația de extract nuclear utilizat. (Figura 7B). Propunem ca acest format să ofere un test specific pentru activitățile combinate de ADN polimerază de umplere a golurilor și dRP liază ale extractelor.

Atunci când un substrat care conține analogul situsului THF AP a fost utilizat în locul unui situs AP generat de acțiunea UDG asupra unui complex de oligonucleotide care conține uracil, repararea substratului a fost realizată de extractul nuclear atunci când un amestec al celor patru dNTP a fost inclus în reacția de reparare, deși amploarea reparării a fost mai mică, la aproximativ 55% din cea observată atunci când a fost utilizat un substrat care conține un loc AP normal (Figura 7D). Mai mult, spre deosebire de repararea unui substrat care conține un situs AP normal, includerea dTTP ca singura deoxinucleotidă în amestecul de reparare nu a fost suficientă pentru a susține orice reparare detectabilă a substratului care conține THF (Figura 7D). Acest lucru indică faptul că, așa cum a fost prezis, repararea patch-urilor scurte nu poate fi finalizată folosind analogul site-ului AP care conține THF, dar poate fi reparată printr-un proces alternativ, care este cel mai probabil BER cu patch lung.

Pentru a investiga specificul testelor pentru ADN polimerază, ADN polimerază combinată/dRP liază și repararea completă a substratului care conține un analog de situs THF AP, am comparat activitatea detectată cu fiecare test folosind extracte nucleare preparate din tip sălbatic și PolB MEF-uri nule. Activitatea detectată cu toate cele trei teste a fost substanțial mai mică în PolB extracte nucleare nule decât în ​​probele de tip sălbatic (Figura suplimentară S9A-C), în timp ce activitatea UDG a fost de 2 ori mai mare în PolB extracte nule decât în ​​extractele WT (Figura suplimentară S9D). Incizia locului AP și activitățile ADN ligazei de tip sălbatic și PolB celulele nule au fost foarte asemănătoare (Figura suplimentară S9E și F). Pentru testul ADN polimerazei, a existat o diferență de 45 de ori între tipul sălbatic și PolB extracte nule (P < 0,0001). Pentru testul combinat ADN polimerază/dRP liază, a existat o diferență de 56 de ori (P < 0,0001). Pentru testul care determină repararea completă a substratului care conține un analog de situs THF AP, a existat o diferență de 9 ori (P < 0,0001). Cu toate acestea, pentru ultima dintre aceste teste, activitatea de reparare a fost determinată cu cea mai mare concentrație de PolB extractul nuclear nul testat (2 μg/godeu) a rămas sub limita de detecție. Astfel, în timp ce există în mod clar o diferență izbitoare în capacitatea de tip sălbatic și PolB extractele nucleare MEF nule pentru a repara analogul situsului THF AP, diferența aparentă de pliere în activitate poate să nu fie la fel de precisă ca diferențele de ori determinate cu celelalte două teste.

În cele din urmă, am evaluat capacitatea POLB uman recombinant purificat de a rectifica deficiențele de reparare ale PolB extract nul observat folosind fiecare dintre aceste trei teste. În fiecare caz, adăugarea de POLB a fost suficientă pentru a completa activitatea extractului, astfel încât să se poată realiza o reparație similară sau chiar depășită cu cea a extractului MEF de tip sălbatic (Figura suplimentară S9G-I).

Analiza activității ADN-glicozilazei alchiladeninei

După ce am demonstrat că formatul de analiză poate fi utilizat pentru fiecare pas individual în BER al leziunilor de uracil, am evaluat, de asemenea, fezabilitatea extinderii formatului de analiză la repararea unei alte leziuni de bază printr-o glicozilază ADN diferită. Hipoxantina de bază modificată se poate forma în ADN prin dezaminarea spontană a adeninei. Această leziune este excizată de AAG ( 49). Prin urmare, am pregătit o oligonucleotidă buclă ac de păr imobilizat în plăci de analiză care conținea o singură hipoxantină (denumită inozină (I) sub formă de deoxinucleozidă), într-o pereche de baze I:T, ca substrat pentru testul AAG. Incubarea acestui substrat cu AAG uman recombinant a condus la producerea dependentă de concentrație și de timp a situsurilor alcaline labile, așa cum este evidențiată prin reducerea fluoresceinei reținute în godeuri după etapa de denaturare alcalină (Figura 8A și B). Din analiza timpului, KPisică/KM a fost estimată la 2,8 × 10 −4 nM −1 s −1 . Aceasta se compară cu KPisică/KM valorile pentru AAG derivate din publicațiile anterioare pe care le-am identificat (49-54), unde substraturile utilizate conțineau perechi de baze I:T, care au variat de peste 400 de ori de la 2,4 × 10 -5 (54) la 0,01 nM -1 s -1 ( 50) dar cu 4 din cele 6 estimări în intervalul mult mai restrâns de la 2,4 × 10 −5 la 6,4 × 10 −4 nM −1 .s −1 . Astfel, iar aici, estimarea pe care am obţinut-o pentru KPisică/KM cu noul format de analiză bine aliniat cu majoritatea estimărilor anterioare ale acestui parametru.

Test pentru activitatea alchiladenin ADN glicozilazei (AAG). Incubarea cu AAG uman recombinant a condus la concentrarea enzimei- (A) și dependent de timp (B) scade cantitatea de substrat oligonucleotidic intact care conține o pereche de baze I:T în urma denaturarii alcaline. Pentru analiza timpului, pătratele, cercurile și triunghiurile indică datele generate cu 0,1, 0,2 sau 0,4 unități/godeu, respectiv. Incubarea cu extract nuclear HepG2 (C) sau extract combinat de celule mononucleare din sângele periferic (D) a determinat, de asemenea, scăderi dependente de concentrație ale cantității de substrat intact reținut în godeuri. Activitatea aparentă AAG a fost direct proporțională cu concentrația probei în intervalul 0-10 μg/godeu pentru HepG2 (E) și celulele mononucleare din sângele periferic (F) extracte nucleare (r 2 = 0,94 în ambele cazuri). Datele prezentate reprezintă media ± SD a replicărilor tehnice în trei exemplare, cu excepția datelor privind cursul de timp pentru care au fost analizate duplicatele.

Test pentru activitatea alchiladenin ADN glicozilazei (AAG). Incubarea cu AAG uman recombinant a condus la concentrarea enzimei- (A) și dependent de timp (B) scade cantitatea de substrat oligonucleotidic intact care conține o pereche de baze I:T în urma denaturarii alcaline. Pentru analiza timpului, pătratele, cercurile și triunghiurile indică datele generate cu 0,1, 0,2 sau 0,4 unități/godeu, respectiv. Incubarea cu extract nuclear HepG2 (C) sau extract combinat de celule mononucleare din sângele periferic (D) a determinat, de asemenea, scăderi dependente de concentrație ale cantității de substrat intact reținut în godeuri. Activitatea aparentă AAG a fost direct proporțională cu concentrația probei în intervalul 0-10 μg/godeu pentru HepG2 (E) și celulele mononucleare din sângele periferic (F) extracte nucleare (r 2 = 0,94 în ambele cazuri). Datele prezentate reprezintă media ± SD a replicărilor tehnice în trei exemplare, cu excepția datelor privind cursul de timp pentru care au fost analizate duplicatele.

Incubarea substratului care conține I: T cu HepG2 sau extract nuclear PBMC combinat a condus, de asemenea, la o reducere a semnalului dependentă de concentrație (Figura 8C și D). Activitatea aparentă AAG în extractele nucleare, bazată pe interpolarea din curba standard produsă de AAG recombinant, a fost direct proporțională cu cantitatea de extract adăugată în intervalul 0-10 μg / godeu (Figura 8E și F).

Pentru a evalua specificitatea acestui test pentru AAG, am comparat expresia AAG și activitatea aparentă AAG în extractul nuclear din celulele ARPE19 (de tip sălbatic pentru AAG) cu cele din trei clonale diferite. AAG linii celulare knockout derivate din linia celulară parentală. Proteina AAG a fost detectată prin analiza Western blot în extractul preparat din linia originală de celule ARPE19, dar nu în niciuna dintre cele trei linii de celule knockout (Figura suplimentară S10A). Activitatea aparentă în fiecare dintre liniile celulare knockout a fost foarte scăzută cu mult sub limita de detecție a testului, în timp ce activitatea AAG a fost ușor detectabilă în celulele care exprimă AAG (Figura suplimentară S10B), în timp ce activitățile UDG au fost similare pe toate liniile celulare (Figura suplimentară S10C). ).


Abstract

Raportăm aici dezvoltarea și optimizarea unui test colorimetric simplu cu 384 de godeuri pentru a măsura H2O2 generate de ciclul redox a compușilor incubați cu agenți reducători în tampoane de testare de screening cu randament ridicat (HTS). Testul fenol roșu-peroxidază de hrean (HRP) a detectat cu ușurință H2O2 fie adăugată exogen, fie generată de ciclul redox a compuşilor din ditiotreitol (DTT). Generația lui H2O2 a fost dependentă atât de concentrația compusului, cât și de DTT și a fost eliminată de catalază. Deși atât DTT, cât și tris(2-carboxietil)-fosfină susțin generarea ciclului redox de H2O2 printr-un model de chinolindionă, 6-clor-7-(2-morfolin-4-il-etilamino)-chinolin-5,8-dionă (NSC 663284 DA3003-1), alți agenți reducători cum ar fi β-mercaptoetanol, glutation și cisteina nu. Testul este compatibil cu HTS. Odată terminat, semnalul testului a fost stabil timp de cel puțin 5 ore, permițând un debit rezonabil. Testul a tolerat până la 20% dimetil sulfoxid, permițând testarea unei game largi de concentrații de compuși. Fereastra de semnal al testului a fost robustă și reproductibilă cu medie Z-factori ≥0,8 și generarea ciclului redox a H2O2 de DA3003-1 în DTT a prezentat o concentrație eficientă medie de 50% de 0,830 μ 0,068 μM. Cinci dintre inhibitorii protein kinazei fosfatazei (MKP) 1 activați de mitogen identificați într-un HTS s-au dovedit că generează H2O2 în prezența DTT, iar inhibarea lor a activității MKP-1 s-a dovedit a fi dependentă de timp și a fost eliminată sau redusă semnificativ fie cu 100 U de catalază, fie prin niveluri mai mari de DTT. O interogare încrucișată a bazei de date PubChem cu trei pirimidotriazinedione legate structural a evidențiat semnale active în 36-39% din testele de screening primare. Activitatea a fost confirmată împotriva unui număr de ținte care conțin cisteine ​​cu situs activ, inclusiv protein tirozin fosfataze, catepsine și caspaze, precum și un număr de teste de citotoxicitate celulară. În loc să utilizeze resurse pentru a realiza un efort de caracterizare a rezultatelor care implică mai multe teste secundare, testul roșu fenol-HRP oferă o metodă simplă, rapidă, sensibilă și ieftină pentru a identifica compușii care ciclează redox în DTT sau tris(2-carboxietil)fosfină pentru a produce H2O2 care pot modula indirect activitatea țintă și pot reprezenta false pozitive promiscue dintr-un ecran primar.


Partea 2: Condiții pentru fotosinteză

Elevii ar fi trebuit să vină cu un test cu o zi înainte și să-l verifice cu instructorul, acest lucru vă oferă o zi pentru a aduna orice materiale de care ar putea avea nevoie.

Variabile comune pe care elevii aleg să le testeze:

Culoare deschisă - aveți grijă să utilizați becuri fluorescente colorate, acestea nu funcționează, în schimb încercați să utilizați celofan sau velum pentru a servi ca filtru de lumină

Intensitatea luminii - oferiți diferite dimensiuni de becuri, sau elevii pot experimenta cu mutarea becurilor mai departe de plante

Temperatura - se pot asigura bai cu gheata si apa calda

Partea 3: Utilizarea dioxidului de carbon - Acest lucru a fost eliminat din foaia de lucru pentru elev, dar poate fi o demonstrație interesantă. Timpul este foarte important pentru a obține rezultatele dorite.

Roșu fenol este folosit ca indicator pentru o bază. Cu exces de dioxid de carbon, roșul fenol va fi galben, pe măsură ce dioxidul de carbon este îndepărtat, soluția devine mai bazică, revenind la roșu.

Aceasta poate fi o parte dificilă a laboratorului de coordonat, deoarece sincronizarea este importantă. Am folosit 10 ml roșu fenol la 200 ml apă. Apa galbenă începe să se schimbe în roz în aproximativ o oră, cu cele mai spectaculoase rezultate în aproximativ 3 ore. Dacă este lăsată peste noapte, rozul va dispărea și flaconul va reveni la galben (din cauza respirației). Dacă este posibil, cereți elevilor să vină mai târziu în cursul zilei pentru a observa orice schimbare de culoare. Dacă acest lucru nu este posibil, puteți face acest lucru ca demonstrație instalând fiolele în prealabil și făcând fotografii sau pur și simplu folosiți fotografiile de mai jos.

Roșu fenol după 3 ore păstrat la lumină.

Roșu fenol după 3 ore păstrat la întuneric

S-ar putea să întâmpinați o mulțime de erori și rezultate anormale, așa că reamintiți studenților că nu este vorba întotdeauna de datele adunate, ci de calea parcursă, de proiectare și de explorare. Atenuați temerile că vor fi penalizați dacă datele lor nu sunt conforme cu ceea ce se așteaptă și, în schimb, încurajați-i să-și explice rezultatele și să includă orice probleme de proiectare.


Priveste filmarea: Fenol e suas nomenclaturas (Iunie 2022).


Comentarii:

  1. Cecilius

    Hiiii)) Zâmbesc de la ei

  2. Nile

    mesajul util

  3. Tojanos

    Acum este ceva asemănător!

  4. Mwaka

    Otpadddddd

  5. Abdul-Hamid

    the Excellent and timely answer.



Scrie un mesaj