Informație

Metabolismul bilirubinei și inhibarea UGT1A1 la om vs. maimuță?

Metabolismul bilirubinei și inhibarea UGT1A1 la om vs. maimuță?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

La om, UGT1A1 pare a fi singura enzimă relevantă pentru glucuronidarea bilirubinei neconjugate în forme excretate. Este calea aceeași pentru, de ex. maimuța Cynomolgus (Macaca fascicularis) in vivo? În cazul în care UGT1A1 este puternic inhibat, există vreo altă enzimă potențială pentru a metaboliza/glucuronidat bilirubina neconjugată la maimuță? În plus, bilirubina este o provocare analitică în studiile de inhibare a UGT1A1 in vitro. Estradiolul (3-glucuronidare) a fost utilizat ca substrat specific pentru UGT1A1 uman. Cunoașteți substraturi cunoscute a fi specifice pentru maimuța UGT1A1? Orice referință ar fi foarte apreciată.


UGT1A1 este comună la majoritatea mamiferelor care produc bilirubină (de asemenea, șobolanii). Nu am văzut nicio dovadă care să sugereze o cale alternativă în metabolismul bilirubinei la mamifere. Uitați-vă la pacienții cu sindrom Gilbert (au un SNP care este o mutuație care face ca UGT1A1 să fie mai puțin eficient și, prin urmare, o creștere a bilirubinei neconjugate în plasmă).

De asemenea, analiza bilirubinei din plasmă/țesuturi este destul de simplă cu testele HPLC sau LCMS. Cu toate acestea, inhibarea UGT1A1 in vitro este încă o provocare. Cred că trucul va fi să folosești CRISPR pentru a-l elimina.


Metabolismul bilirubinei

Metabolismul normal al bilirubinei poate fi rezumat ca o serie de etape, incluzând (1) producerea, (2) absorbția de către hepatocit, (3) conjugare, (4) excreția în canalele biliare și (5) livrarea în intestin. Icterul poate rezulta din defecte în oricare dintre aceste etape ale metabolismului bilirubinei.

La adulți, se produc 250 până la 350 mg de bilirubină în fiecare zi. Aproximativ 80% până la 85% din această bilirubină este derivată din distrugerea celulelor roșii senescente de către sistemul reticuloendotelial. Restul de 15% până la 20% provine din descompunerea proteinelor non-hemoglobine, cum ar fi mioglobina și citocromii. Fig. 7a.1 prezintă metabolismul bilirubinei. În celulele reticuloendoteliale, enzima microzomală hemoxigenaza scindează hemul în biliverdină. Biliverdina este redusă la bilirubină de către enzima citosolică biliverdin reductază înainte de a fi eliberată în circulație. În această formă neconjugată, bilirubina este insolubilă în apă și este transportată la ficat strâns legată de albumină.

Ficatul elimină bilirubina neconjugată și alți anioni organici legați de albumină din plasmă. Când complexul bilirubină-albumină intră în circulația sinusoidală a ficatului, sunt recunoscute trei faze metabolice distincte: (1) captarea hepatocitelor, (2) conjugarea și (3) excreția în bilă. Bilirubina neconjugată este transportată prin membrana sinusoidală a hepatocitei în citoplasmă. În interiorul hepatocitei, bilirubina neconjugată este legată de o proteină citoplasmatică, în acest caz glutation S-transferaza. Enzima microzomală uridin difosfat-glucuronil transferaza conjugă apoi bilirubina neconjugată insolubilă cu acid glucuronic pentru a forma formele conjugate solubile în apă, monoglucuronida de bilirubină (15%) și diglucuronida de bilirubină (85%). Bilirubina conjugată este excretată din hepatocit în canaliculul biliar printr-un mecanism de transport activ.

Excreția în bilă este etapa de limitare a vitezei în metabolismul bilirubinei. După excreție, bila curge prin sistemul colector ductal biliar, poate fi stocată sau nu în vezica biliară și intră în duoden. În ileonul terminal și colon, bilirubina este transformată de enzimele bacteriene în urobilinogen. Zece la sută până la 20% din urobilinogen este reabsorbit din intestin în circulația portală, creând o circulație enterohepatică. Acest urobilinogen reciclat poate fi re-excretat în bilă de către ficat sau în urină de către rinichi. Urobilinogenul rămas în intestin este transformat în fecobilinogen, ceea ce conferă scaunului culoarea maroie caracteristică.


Introducere

Obezitatea a atins proporții epidemice la nivel global și cel puțin 2,8 milioane de oameni mor în fiecare an din cauza supraponderalității sau a obezității (OMS). Obezitatea reprezintă, de asemenea, cel mai important factor de risc pentru rezistența la insulină, bolile cardiovasculare și diabetul de tip 2 (T2D) 1 . Pacienții cu T2D sunt de obicei hiperglicemici și suferă de complicații precum hipertensiune arterială, accident vascular cerebral, ateroscleroză și cancer 2 . Strategiile care reduc obezitatea promit să reducă mortalitatea și să îmbunătățească calitatea vieții persoanelor afectate.

Țesutul adipos joacă un rol critic în homeostazia glucozei și metabolismul lipidic 3,4 prin producerea diferitelor proteine ​​cunoscute sub numele de adipokine sau adipocitokine, inclusiv factorul de necroză tumorală-α (TNF-α), interleukina-6, proteina chimioatractantă a monocitelor 1, leptina și adiponectina 5 ,6,7 . Adipokinele acționează ca comutatoare metabolice, conectând starea nutrițională a organismului cu alte funcții consumatoare de energie 8 . Dereglarea adipokinelor duce la boli legate de obezitate 9 . Printre adipokinele cunoscute, nivelurile de leptina corespund pozitiv cu energia stocată în masa de grăsime, iar nivelurile crescute de leptina se corelează cu adipozitatea crescută și inflamația care rezultă dintr-o eliberare crescută de citokine, cum ar fi TNF-α10. În schimb, adiponectina acționează ca un agent sensibilizant la insulină și îmbunătățește oxidarea acizilor grași, acțiunea insulinei hepatice și absorbția de glucoză 5,11,12. Șoarecii cu deficit de adiponectină prezintă niveluri crescute de glucoză și insulină în plasmă după ce au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi, dar supraexprimarea adiponectinei la acești șoareci prin infecția adenovirală restabilește sensibilitatea la insulină 13 . În plus, adiponectina are, de asemenea, efecte antiinflamatorii și anti-aterogene rezultate din capacitatea sa de a suprima activarea NF-kB mediată de TNF-α în celulele endoteliale 14 . Nivelurile circulante de adiponectină sunt crescute după pierderea în greutate 15 , prin inducerea hemoxigenazei-1 (HO-1) 16 și prin tratament cu liganzi PPARy, inclusiv tiazolidindione 17,18.

HO-1 este o enzimă limitatoare de viteză care degradează hemul generând cantități molare egale de biliverdină, monoxid de carbon și fier feros 19 . Biliverdina poate fi transformată rapid în bilirubină de către biliverdin reductază, iar fierul poate regla feritina. S-a demonstrat că HO-1 joacă roluri critice în inversarea rezistenței la insulină. De exemplu, inducția HO-1 sensibilizează calea de semnalizare a insulinei la șobolanii Zucker 20 și la șoarecii cu deficit de leptină (ob/ob), la șoarecii cu deficit de receptor de leptină (db/db) și la șoarecii obezi induși de dietă (DIO) 16,21 ,22,23,24,25,26,27. Bilirubina imită efectul inducției HO-1 și îmbunătățește sensibilitatea la insulină la modelele de șoareci obezi 28 . Bilirubina este un antioxidant puternic cu proprietăți antiinflamatorii și de reglare imună 29 . Deși bilirubina anormal de crescută a fost folosită ca indicator pentru hepatită, anemie hemolitică și colestază, bilirubina neconjugată ușor crescută la pacienții cu sindrom Gilbert (1,1 mg/dl până la 2,7 mg/dl) este asociată cu protecția împotriva aterosclerozei coronariene, bolilor cardiovasculare, precum precum și alte boli 30,31,32,33 . Asocierea pozitivă dintre bilirubina neconjugată și hemul plasmatic liber, fierul și hemoglobina carboxil la acești pacienți sugerează o buclă de feedback pozitiv în care expresia HO-1 este indusă de bilirubina neconjugată 34 .

Am arătat că administrarea sistemică a bilirubinei crește sensibilitatea la insulină prin suprimarea stresului ER și a inflamației la șoarecii DIO 35 . Acum am extins aceste observații și am investigat dacă bilirubina reglează metabolismul lipidic așa cum s-a observat la pacienții cu boala Gilbert 34 și dacă bilirubina reglează nivelul adipokinelor serice la șoarecii DIO. De asemenea, am evaluat efectele pe termen lung ale tratamentului cu bilirubină asupra metabolismului lipidelor și a nivelurilor de adipokine la 7 săptămâni după terminarea tratamentului cu bilirubină.


Rezultate

Umanizat UGT1 Șoareci și hiperbilirubinemie neonatală.

Evenimente celulare și moleculare care stau la baza reglementării UGT-urilor, în special cele codificate de om UGT1 familia de gene, au fost studiate la șoareci transgenici umanizați care exprimă omul UGT1 locus (TgUGT1 soareci) in a Ugt1-null fundal (Ugt1 −/− șoareci) (Fujiwara și colab., 2010). La oameni, sunt nouă UGT1A gene, inclusiv UGT1A1, care sunt codificate de UGT1 locus (Clarke și colab., 1997 Mackenzie și colab., 1997 Gong și colab., 2001). Pentru a examina importanța omului UGT1 locus și cel UGT1A1 gena care controlează bilirubinei serice, o mutație de inactivare a fost introdusă în exonul 4 al murinei Ugt1a1 genă, generatoare Ugt1 −/− șoareci (Nguyen și colab., 2008). Proteinele UGT1A sunt codificate de cinci exoni, secvența de codificare pentru exonii 2-5 fiind identică. Situat pe cromozomul 1, organizarea murinei Ugt1 locusul este codificat de >150 kDa de ADN, cu exonii 2-5 localizați la capătul 3′ și flancați consecutiv de o serie de nouă exoni casete care codifică porțiunea N-terminală a fiecărei proteine ​​UGT1A. Astfel, cel UGT1 locus la oameni și la Ugt1 locusul la șoareci codifică nouă funcționale UGT1A proteine, fiecare compus dintr-o regiune N-terminală unică codificată de unul dintre cei 5 exoni de flancare în timp ce împărtășesc o regiune C-terminală identică codificată de exonii 2-5. Când este heterozigot Ugt1 +/− au fost crescuți șoareci, urmași cu a Ugt1 −/− genotipul s-a născut cu o culoare portocalie uimitoare a pielii care a rezultat din nivelurile sever crescute de UCB care s-au dezvoltat în SNH letal între 4 și 7 zile după naștere. Pentru a recupera letalitatea rezultată din expresia UGT1A1 murină nefuncțională, TgUGT1 soareci care au purtat si exprimat intregul UGT1 locus (Chen et al., 2005) au fost încrucișați cu Ugt1 +/− soareci pentru a genera TgUGT1/Ugt +/− soareci. Acești fondatori au fost apoi încrucișați pentru a genera TgUGT1/Ugt1 −/− şoareci sau umanizaţi UGT1 (hUGT1) șoareci. Expresia omului UGT1A1 gena a salvat letalitatea atribuită SNH în Ugt1 −/− şoareci (fig. 2).

Umanizat UGT1 șoareci și hiperbilirubinemie neonatală. Ugt1 −/− șoarecii au fost generați prin întreruperea exonului 4 comun cu o genă neomicină, afectând funcția întregului Ugt1 locus. Ugt1 −/− Șoarecii nou-născuți sunt ușor de identificat prin culoarea lor portocalie distinctă a pielii, care rezultă din acumularea de bilirubină neconjugată. Pierderea lui Ugt1 locus și UGT1A1 din linia germinativă este letal, cu toate Ugt1 −/− șoareci care mor în decurs de 2 săptămâni de la naștere. Când am încrucișat șoareci care transportau întregul om UGT1 locusul genei ca transgenă cu șoarecii purtători de Ugt1-null alelă, umanizată UGT1 soareci (hUGT1) au fost generate. Prezența omului UGT1A1 gena salvează letalitatea asociată cu absența UGT1A1 murină. Tot nou-născut hUGT1 șoarecii dezvoltă hiperbilirubinemie neonatală severă (SNH). Nivelurile bilirubinei serice totale (TSB) în hUGT1 nou-născuții cresc după naștere, ating nivelurile de vârf la aproximativ 2 săptămâni după naștere, nivelurile revenind la un interval normal după înțărcare. Majoritatea celor hUGT1 șoarecii se pot maturiza până la vârsta adultă. Aproximativ 10% dintre nou-născuți hUGT1 soarecii fac convulsii si mor. Acești șoareci acumulează concentrații mari de bilirubină în țesutul cerebral. Dezvoltarea SNH rezultă din expresia hepatică întârziată a UGT1A1. Expresia UGT1A1 în intestinul subțire este asociată cu salvarea letalității hUGT1 șoareci și scăderea nivelului TSB.

Reglarea dezvoltării și specifică țesutului UGT1A genele în hUGT1 S-a demonstrat că șoarecii (Chen și colab., 2005 Senekeo-Effenberger și colab., 2007 Fujiwara și colab., 2010 Yueh și colab., 2017) reflectă modele de expresie similare celor caracterizate în țesuturile umane (Strassburg și colab., 1997a). ,b, 1998a,b Tukey și Strassburg, 2000), permițându-ne să valorificăm utilizarea hUGT1 șoareci în experimente concepute pentru a caracteriza mecanismele care conduc la expresia specifică, inductibilă și de dezvoltare a țesutului uman UGT1A genele. O descoperire importantă a fost constatarea că omul UGT1A1 gena, care este întârziată din punct de vedere al dezvoltării la nou-născuți, este, de asemenea, întârziată sau reprimată din punct de vedere al dezvoltării hUGT1 șoareci nou-născuți (Fujiwara și colab., 2012). Deoarece UGT1A1 este singura enzimă responsabilă de metabolizarea bilirubinei serice, această întârziere a UGT1A1 expresia genelor conduce la SNH la nou-născuți hUGT1 șoareci, cu letalitatea care afectează 10% dintre nou-născuți, așa cum se manifestă prin deficiențe motorii dramatice cu mișcări asemănătoare convulsiilor. Creierele lui hUGT1 șoarecii care dezvoltă convulsii concentrează bilirubina în țesuturi, ceea ce este evident printr-un aspect galben intens sau icteric (Fujiwara și colab., 2010). Modelul icteric nu este localizat regional, așa cum se găsește în globul pallidus și nucleul subtalamic din țesutul creierului uman, deși am clasificat acest fenotip la neonatal. hUGT1 soareci ca kernicterus. Dezvoltarea maximă a nivelurilor de TSB la nou-născuți hUGT1 șoarecii apare în zilele 10-14 după naștere și scade brusc în următoarele 5 zile. Pe parcursul perioadei neonatale, pe care o clasificăm ca fiind primele 3 săptămâni după naștere, expresia UGT1A1 hepatică este reprimată. Clearance-ul TSB în etapele ulterioare ale perioadei neonatale corespunde cu inducerea dezvoltării exprimării UGT1A1 intestinale (Fujiwara et al., 2010) (Fig. 2).

În timpul acestei faze de dezvoltare, activarea alimentată sau determinată de mediu a UGT1A1 gena și inducerea UGT1A1 în hUGT1 șoarecii are ca rezultat metabolismul bilirubinei și o scădere bruscă a nivelurilor de TSB. Cartografierea site-urilor de legare a receptorilor nucleari asociate cu UGT1A1 gena a indicat că activarea transcripțională poate fi realizată prin receptorii steroizi din subfamilia 3 activați în plus față de receptorii nucleari xenobiotici din subfamilia 1 (XNR) (Fig. 3). Sugatani şi colab. (2001) au caracterizat pentru prima dată modulul de amplificare sensibil la fenobarbital (Pb) la om. UGT1A1 genă care se leagă de receptorul activ constitutiv (CAR). Cand hUGT1 Șoarecii nou-născuți sunt tratați cu Pb, ficatul UGT1A1 este indus și nivelurile TSB sunt reduse dramatic (Chen și colab., 2012 Shibuya și colab., 2013 Yoda și colab., 2017 Yueh și colab., 2017). Cu toate acestea, în hUGT1/Mașină −/− la șoareci, administrarea de Pb nu induce UGT1A1 și nu are niciun impact asupra nivelurilor neonatale de TSB, confirmând genetic că CAR reglează UGT1A1 gena. În hUGT1 soareci, cel UGT1A1 gena poate fi indusă transcripțional de alte XNR, inclusiv receptorul pregnane X (PXR) (Chen și colab., 2012), receptorul alfa activat de proliferatorul peroxizomului (PPAR).α) (Senekeo-Effenberger et al., 2007), receptorii X hepatici alfa și beta (LXRα/β observații nepublicate) și senzorii de mediu, receptorul de hidrocarburi arii (AhR) (Yueh și colab., 2003 Chen și colab., 2005 Bonzo și colab., 2007) și Nrf2 (Yueh și Tukey, 2007 Yoda și colab., 2007). 2017). Administrarea orală sau intraperitoneală a liganzilor capabili să activeze acești receptori la nou-născuți hUGT1 șoarecii conduce la inducerea UGT1A1 hepatică sau intestinală, urmată de reduceri ale nivelurilor de TSB. Reducerea nivelurilor TSB devreme în fereastra neonatală asigură că șoarecii evită disfuncția neurologică indusă de bilirubină (Fig. 3).

Activarea, reprimarea și dereprimarea umană mediată de receptorul nuclear (NR). UGT1A1 genă și impactul asupra hiperbilirubinemiei în hUGT1 soareci. Elemente de legare ale diferitelor NR, inclusiv PPARα, AhR, Nrf2, CAR, PXR și LXRα, au fost identificate în regiunea promotor în amonte de situsul de început al transcripţiei al UGT1A1 gena. La legarea ligandului, acești NR pot recruta coactivatori și pot iniția în aval UGT1A1 expresia genelor. Cand hUGT1 nou-născuții au fost expuși la diferiți agoniști NR, s-au observat niveluri scăzute ale bilirubinei serice (cu excepția PPARγ). În absența ligandului, unii NR se asociază cu corepresorii NR (cum ar fi NCoR1 și SMRT) și recrutează HDAC-uri enzimelor modificatoare de cromatina pentru a forma un complex represiv și a limita activarea transcripțională. Perturbarea complexului represiv poate duce la dereprimarea expresiei genelor. Umanizat UGT1 soareci cu deficit de PXR (hUGT/Pxr −/− și hUGT1/Pxr −/− /Mașină −/− ), dar nu CAR (hUGT1/Mașină −/− ), sunt asociate cu o reducere a bilirubinei serice totale. Când sunt reduse la tăcere selectiv, corepresorii SMRT, NCoR1 sau HDAC din hepatocitele primare izolate din hUGT1 soareci, UGT1A1 a fost observată activarea genelor.

PXR este o țintă de steroizi, o proteină represoare și un regulator al UGT1A1.

Importanța PXR ca regulator al controlului endocrin, al metabolismului medicamentelor și al hiperbilirubinemiei a început să apară atunci când am prezis că PXR a controlat metabolismul medicamentului direcționat de UGT în timpul gestației. De exemplu, nivelurile circulante de TSB sunt mai scăzute la femei în timpul sarcinii, ceea ce indică faptul că metabolismul bilirubinei este accelerat prin UGT1A1 indus (Bacq et al., 1996). Labetalolul, un medicament antihipertensiv care este metabolizat în principal de UGT1A1, prezintă un clearance crescut în al doilea și al treilea trimestru de sarcină în comparație cu perioada postpartum (Jeong și colab., 2008). Sarcina are ca rezultat creșteri dramatice ale hormonilor în timpul dezvoltării gestaționale, cu creșteri ale steroizilor, cum ar fi estrogeni, progestative și glucocorticoizi. Deoarece PXR a fost prezis să servească drept o țintă endogenă cu afinitate scăzută pentru pool-urile de steroizi circulanți care ar avea ca rezultat modificări fiziologice, cum ar fi metabolismul medicamentelor (Blumberg și colab., 1998), am examinat impactul PXR asupra controlului UGT1A genele în timpul sarcinii în hUGT1*1 și hUGT1*28 șoareci (Fujiwara și colab., 2010). Adult hUGT1*28 șoarecii sunt hiperbilirubinemici, cu niveluri de TSB care în medie 1 mg/dl în comparație cu niveluri nedetectabile în hUGT1*1 soareci. În timpul sarcinii și al gestației târzii, nivelurile TSB în hUGT1*28 șoarecii au avut o medie de 0,4 mg/dl, cu peste 50% mai puțin decât la șoarecii negraviți. În timpul gestației târzii, proteinele UGT1A sunt induse în ficat. Activarea PXR a fost, de asemenea, documentată prin analiza CHIP, demonstrând o legare crescută a PXR asociată cu UGT1A1 genă în timpul sarcinii târzii (Chen et al., 2012). Pentru a examina rolul PXR ca modulator al metabolismului medicamentelor, ne-am încrucișat hUGT1*1 soareci cu Pxr −/− soareci si a examinat expresia UGT1 locus la gravidă hUGT1/Pxr −/− soareci. În comparație cu hUGT1 soareci, UGT1A1, -1A3, -1A4, -1A6, și -1A9 expresia genelor în hUGT1/Pxr −/− șoarecii sunt mult reduse în etapele ulterioare ale gestației. Când s-a administrat glucocorticoid dexametazonă (DEX). hUGT1 șoareci, fiecare dintre cei cinci UGT1A genele exprimate în ficat au fost induse. Deși activarea receptorului glucocorticoid de către DEX s-a arătat anterior că se activează UGT1A1 constructe ale genei reporter, DEX nu a avut niciun efect asupra inducerii UGT1A1 în hUGT1/Pxr −/− șoareci, indicând faptul că inducerea UGT1A genele de către glucocorticoizi este facilitată numai de activarea PXR in vivo.

Tăcere transcripțional a UGT1A1 Gene.

În experimente de reproducere pentru a crea hUGT1/Pxr −/− șoareci, analiza nivelurilor de TSB la nou-născuți hUGT1 și hUGT1/Pxr −/− șoarecii au demonstrat că PXR joacă un rol cheie în controlul nivelurilor TSB în timpul dezvoltării. La nou-născuți hUGT1/Pxr −/− la șoareci, ficatul UGT1A1 este indus în comparație cu expresia sa în hUGT1 șoareci (Chen și colab., 2012). Nivelurile crescute de UGT1A1 hepatic în hUGT1/Pxr −/− șoarecii duc la niveluri reduse de TSB. Această descoperire sugerează că, în absența ligandului endogen, rolul fiziologic al PXR duce la reprimarea UGT1A1 genă în timpul dezvoltării timpurii. Mai important, blocarea activării UGT1A1 gena PXR este controlată în ficat prin procese de dezvoltare neonatală, de la eliminarea sa la adulți. hUGT1/Pxr −/− soarecii nu are nici un impact asupra UGT1A1 expresia genelor, cu excepția șoarecilor gestante. Astfel, PXR este implicat în tăcere transcripțională a UGT1A1 gena (fig. 3).

În combinație cu receptorii nucleari, tăcere transcripțională sau reprimare este realizată în mare măsură cu doi corepresori prototipi represori nucleari, mediatorul de tăcere al receptorului retinoid și al hormonului tiroidian (SMRT) și corepresorul 1 al receptorului nuclear (NCoR1) (Francis et al., 2003). Mottis et al., 2013), sugerând că NCoR1 și/sau SMRT participă la controlul exprimării UGT1A1 în timpul dezvoltării. Din punct de vedere mecanic, proteinele corepresoare interacționează cu XNR, cum ar fi RXR, LXR, PPAR și PXR, pentru a controla colectiv modelele de expresie a genelor prin recrutarea de enzime modificatoare de cromatina care limitează accesibilitatea ADN-ului nucleozomal și activarea transcripțională. În absența fie a receptorului nuclear, fie a corepresorului, coactivatorii suplimentari cooperează cu un set diferit de enzime care modifică cromatina pentru a promova activarea transcripțională. În experimentele care vizează ștergerea NCoR1/SMRT în diferite țesuturi sau linii celulare, ștergerea corepresorului duce spontan la activarea nonligand a XNR-urilor, facilitând activarea transcripțională a genelor țintă XNR (Li și colab., 2013). Adesea, activarea transcripțională a genelor țintă din aval de către XNR-urile activate spontan oferă o semnătură genomică care poate fi utilizată pentru a identifica exact XNR implicat în răspuns. Pentru a determina dacă NCoR1 și SMRT sunt implicate în reprimarea UGT1A1 genă în ficat, distrugerea NCoR1 și SMRT la neonatal primar hUGT1 hepatocitele prin siARN duce la dereprimarea UGT1A1 (Chen și colab., 2017). Efecte similare au fost observate după ablația HDAC1 sau HDAC3, indicând faptul că NCoR1 și SMRT sunt implicate împreună cu HDAC1/HDAC3 în reprimarea expresiei UGT1A1 expresia genelor. În timp ce distrugerea genelor în cultura de țesut este un instrument eficient pentru a identifica potențialele evenimente de reglementare, knockout-ul specific țesuturilor țintite a genelor in vivo oferă dovezi suplimentare ale impactului biochimic și fiziologic al rolului lor în homeostazia normală. Având dovezi că PXR împreună cu NCoR1 și SMRT este legat de reprimarea neonatală a exprimării UGT1A1 hepatice, au fost inițiate experimente folosind ștergerea condiționată a NCoR1 pentru a examina mecanismele moleculare care leagă dezvoltarea neonatală cu ficatul și intestinul. UGT1A1 expresia genelor (Fig. 3).

Un rol important pentru NCoR1 în reglementare UGT1A1 expresia genelor la nou-născuți a apărut (Chen et al., 2017). Am generat floxed Ncor1 soareci sub a hUGT1 fundal (TgUGT1/Ugt1 −/− /Ncor1 F/F ), numită ca șoareci F/F UN, și apoi a eliminat NCoR1 în ficat (ΔHEP UN șoareci) și țesutul intestinal (ΔIEC UN soareci) de hUGT1 soareci. Când nivelurile de TSB au fost examinate la șoarecii nou-născuți, de tip sălbatic F/F ONU și ΔHEP UN șoarecii au prezentat modele similare de hiperbilirubinemie neonatală, așa cum s-a observat în hUGT1 soareci. Deleția NCoR1 în țesutul hepatic nu a avut niciun impact asupra hepaticului UGT1A1 expresia genelor. În mod surprinzător, după deleția specifică intestinală a NCoR1, dezvoltarea hiperbilirubinemiei neonatale a fost complet diminuată în ΔIEC UN soareci. Impactul ștergerii NCoR1 intestinale a condus la dereprimarea exprimării UGT1A1 intestinale, cu inducerea semnificativă a proteinei, care are loc atât pe axa longitudinală [adică, toate secțiunile intestinului subțire (SI)], cât și pe axa criptă-vilozități. Din punct de vedere mecanic, dereprimarea sau inducerea UGT1A1 după knockout NCoR1 a fost observată numai în timpul dezvoltării neonatale, deoarece dereprimarea UGT1A1 nu a apărut la adulți. ΔIEC UN soareci. Această observație interesantă indică faptul că NCoR1 joacă un rol cheie ca proteină corepresoare în procesele importante pentru dezvoltare legate de homeostazia intestinală. Aceste procese pot fi direct sau indirect legate de dereprimarea UGT1A1 gena (Fig. 4).

NCoR1 reprimă uman UGT1 expresia genelor în timpul dezvoltării. NCoR1 F/F şoarecii au fost încrucişaţi în hUGT1 a genera F/F ONU șoareci, care, la rândul lor, au fost încrucișați cu șoareci care purtau recombinaza Cre și au eliminat NCoR1 în mod specific în ficat (ΔHEP UN ) și țesutul intestinal (ΔIEC UN ). Nivelurile serice de bilirubină au fost examinate la șoareci nou-născuți, ΔHEP UN șoarecii au prezentat un model similar de hiperbilirubinemie neonatală ca hUGT1 (F/F UN ) șoareci, dar acest model a fost complet diminuat cu knockout NCoR1 în tractul intestinal al ΔIEC UN soareci. Modificarea acumulării de bilirubină a fost evidențiată și în țesuturile adipoase. Inducerea UGT1A1 intestinală în ΔIEC UN șoarecii a fost observat și a fost cel mai proeminent pe tot parcursul etapei de dezvoltare, dar nu a apărut după înțărcare sau la vârsta adultă. Datele sunt exprimate ca medie ± SEM, **p<0.01, ***p<0,001, ****p<0,0001, testul t al elevului. Analiză ANOVA bidirecțională pentru ΔIEC UN vs F/F ONU (p<0,0001).

Când am efectuat profilarea transcripțională a țesutului intestinal prin implementarea analizei ARN-seq F/F ONU și ΔIEC UN șoareci, analiza ontologiei genelor a identificat calea metabolică ca fiind cea mai semnificativ alterată cale în ΔIEC UN șoareci, urmată de fosforilarea oxidativă și metabolismul medicamentelor. Ștergerea NCoR1 a promovat expresia PPARα și LXRα genele țintă, indicând faptul că NCoR1 este andocat pe aceste gene în timpul dezvoltării neonatale. Deleția NCoR1 a avut un impact extins asupra metabolismului acizilor grași și energetic, în plus față de metabolismul lipidelor și colesterolului. Nivelurile de ARN mesager ale genelor ciclului TCA și ale genelor de fosforilare oxidativă au fost crescute coordonat. Aceste căi metabolice accelerate au indicat că NCoR1 reprima căile cheie esențiale pentru maturarea și sinteza celulelor epiteliale. În ΔIEC UN șoareci nou-născuți, lungimea medie a intestinului subțire a fost cu aproximativ 8% mai lungă și cu 15% mai grea decât în F/F ONU tovarăși, indicând o proliferare intestinală crescută. Descoperirile histologice și ale microscopiei electronice au indicat o margine de perie foarte maturată și microvilozități în interior ΔIEC UN . Când am examinat semnalele de proliferare celulară, imunocolorarea Ki-67, un marker celular pentru proliferare, a fost crescută în ambele ΔIEC UN duoden si jejun. În sprijinul acestei descoperiri, colorația cu bromodeoxiuridină, utilizată pentru a detecta celulele în proliferare, a arătat o creștere progresivă a celulelor epiteliale pozitive. Aceste descoperiri au demonstrat că deleția NCoR1 a fost catalizatorul pentru a accelera proliferarea celulară și pentru a promova proliferarea celulelor epiteliale. În sprijinul proliferării celulare, reglarea în creștere a maturării intestinale Sucraza izomaltaza, o glucozidază care există doar în țesutul intestinal diferențiat și este un marker pentru maturarea enterocitelor, a fost indusă semnificativ în ΔIEC UN șoareci, împreună cu alți markeri de maturare care au inclus specificul duodenal Akp3 gena şi specificul jejunal Krt20 gena. Aceste studii au confirmat că expresia NCoR1 neonatală servește la reprimarea expresiei genelor, inclusiv UGT1A1, controlând în același timp mecanic modificările de dezvoltare care stau la baza maturării intestinale de la stadiul neonatal la țesutul adult.

Reglarea NCoR1 și expresia UGT1A1 intestinală.

NCoR1 intestinal poate fi piesa centrală în controlul metabolismului bilirubinei în celulele epiteliale intestinale (IEC) în timpul ferestrei neonatale. Capacitatea funcțională a NCoR1 de a-și promova proprietățile represive cu receptorii nucleari, precum și potențialul său de a activa transcripția genelor au fost legate de evenimentele de fosforilare (Mottis et al., 2013 Jo et al., 2015), controlate de o serie de kinaze diferite. (Fernández-Majada et al., 2007 Huang et al., 2009 Choi et al., 2013). De exemplu, pierderea NCoR1 nucleară în melanomul malign a fost asociată cu fosforilarea dependentă de IKK a resturilor specifice de serină NCoR1 (Gallardo et al., 2015). Când NCoR1 este fosforilat, se disociază de cromatină și migrează către citoplasmă, o mișcare care stimulează evenimentele de derepresie transcripțională. Constatările din studiile noastre au stabilit, de asemenea, legături strânse între activarea IKK, funcția NCoR1 și reducerile nivelurilor TSB în hUGT1 șoareci (Chen și colab., 2017). IKK intestinalβ este critic în controlul metabolismului bazal al bilirubinei dependent de UGT1A1. Când IKKβ este șters în IEC în hUGT1 soareci (hUGT1/Ikkβ ΔIEC șoareci), expresia bazală a UGT1A1 intestinal în picături de șoareci nou-născuți, ceea ce duce la creșteri ale nivelurilor TSB care sunt letale (Liu și colab., 2016). Când NCoR1 este defosforilat, așa cum există potențial atunci când IKKβ este șters, emitem ipoteza că complexul NCoR1/NR își întărește legarea de cromatină pentru a îmbunătăți reprimarea transcripțională, așa cum se observă prin reducerea mai mare a expresiei IEC a UGT1A1. Această ipoteză a fost testată prin supraexprimarea IKK activβ în IEC, un eveniment care a condus la dereprimarea genelor de maturare intestinală, precum răspunsurile menționate mai sus pe care le-am documentat când NCoR1 a fost șters (Chen și colab., 2017). Capacitatea IKK activată constitutivβ pentru a imita acțiunile de ștergere a NCoR1 a fost de asemenea demonstrat când hUGT1 Șoarecii nou-născuți au fost tratați oral cu cadmiu (Cd2+), acționând atât ca un inductor puternic al stresului oxidativ, cât și ca un activator al IKK.β (NF)-κCalea B (Liu et al., 2016). Tratamentul cu cadmiu a dus la inducerea intestinală a UGT1A1, o reducere bruscă a nivelurilor de TSB și inducerea genelor de maturare intestinală, evenimente care sunt observate atunci când NCoR1 este șters. Inducerea dependentă de Cd 2+ a UGT1A1 intestinal ar putea fi condusă de activarea IKK, prin care poate contribui direct sau prin mecanisme alternative la producerea de specii reactive de oxigen (ROS). Interesant este că ambele procese ar putea juca un rol în țintirea fosforilării NCoR1, un eveniment care ar avea ca rezultat activarea intestinului. UGT1A1 gena.

Stresul oxidativ și reglarea UGT1A1.

Cunoscând că expresia constitutivă a IKK intestinalβ este critic în menținerea nivelurilor adecvate de expresie a UGT1A1 gena, cel mai probabil prin activarea și modificarea NCoR1, am examinat impactul stresului oxidativ intestinal asupra inducerii UGT1A1. Motivul pentru acest experiment a provenit din constatările că IKKβ/NF-κCalea B răspunde la modificări redox, cum ar fi modificări ale ROS. Pentru a efectua acest experiment și a elimina rolul IKKβ, hUGT1 și hUGT1/Ikkβ ΔIEC șoarecii au fost tratați oral fie cu Cd 2+, fie cu arsenic (As 3+), ambele cunoscute că induc stres oxidativ semnificativ (Santra și colab., 2000 Ercal și colab., 2001 Li și colab., 2002 Liu și colab., 2003 López et al., 2006). Netratat hUGT1/Ikkβ ΔIEC șoarecii au prezentat o expresie intestinală redusă a UGT1A1 și niveluri crescute de TSB, majoritatea șoarecilor murind din cauza SNH (Liu și colab., 2016). Când neonatal hUGT1 șoarecii au fost tratați oral fie cu Cd2+, fie cu As3+, UGT1A1 intestinal a fost indus și nivelurile de TSB au fost scăzute (Liu și colab., 2016 Yoda și colab., 2017). La fel, când hUGT1/Ikkβ ΔIEC șoarecii au fost tratați cu Cd2+ sau As3+, stresul oxidativ a fost indus în intestine, proporțional cu inducerea UGT1A1 și cu o scădere a nivelurilor TSB. În timp ce netratat neonatal hUGT1/Ikkβ ΔIEC șoarecii au acumulat niveluri toxice de TSB care au fost letale, tratamentul oral cu Cd 2+ sau As 3+ a condus la inducerea UGT1A1 intestinală și la scăderea nivelurilor de TSB (Fujiwara și colab., 2012 Liu și colab., 2016). Arsenicul, un inductor al stresului oxidativ, duce la activarea rapidă a protein kinazei activate de mitogen p38 (Yoda et al., 2017) și a kinazei reglate de semnal extracelular, ambii senzori ai stresului oxidativ. Interesant, tratamentul oral As 3+ a confirmat că genele marker de maturare IEC au fost, de asemenea, induse. În plus, expresie a Glb1, Nox4, și Lrp2 genele, care sunt reglate în jos la tranziția de la alăptare la înțărcare, a fost redusă, mimând același model observat în ΔIEC UN soareci. Activarea MAPK și a kinazei reglate de semnal extracelular de către As 3+ poate stimula activitatea kinazei în IEC, promovând dereprimarea expresiei genelor într-un mod dependent de NCoR1.

O presupunere preventivă a stresului oxidativ în țesuturi și celule este existența sau evoluția unui sistem de apărare puternic pentru a contracara potențialele toxicități asociate cu generarea de ROS. The formation of oxidative stress, induced by natural diet or through environmental exposure, sets into motion a unique signaling cascade that activates gene families that regulate cytoprotective proteins to provide an active defense against cellular damage. The central mediator of this defense is the nuclear E2-factor related factor 2 (Nrf2), which exists as an Nrf2-Keap1 complex that is sensitive to ROS (Wasserman and Fahl, 1997). Activation of Nrf2 sets into motion transcriptional activation of target genes following binding to unique enhancer sequences identified as antioxidant response elements (AREs) (Wasserman and Fahl, 1997 Nguyen et al., 2000). The ARE sequences are clustered with the AhR xenobiotic response element flanking the UGT1A1 gene and bind activated Nrf2 (Yueh and Tukey, 2007). The antioxidant response can target the UGT1A1 gene, in addition to other genes responsive to ROS, such as NAD(P)H:quinine oxidoreductase 1 (McWalter et al., 2004), glutathione-S-transferase, and heme oxygenase (Alam et al., 1999). Thus induction of these genes following oxidative stress provides a molecular footprint that can be leveraged to identify substances that activate the Nrf2-Keap1 complex in providing antioxidant protection.

CAR, Oxidative Stress, and UGT1A1.

Some of the more potent inducers of oxidative stress are the isothiocyanates (ITCs). Regarded as an important component of our diet, cruciferous vegetables (i.e., broccoli, Brussels sprouts, cauliflower, watercress) have been linked to a lower incidence of cancer development (Murillo and Mehta, 2001) because they produce antioxidative metabolites that induce cytoprotective proteins, such as the UGTs, believed to protect tissue from dietary or environmental toxicity such as cancer. These vegetables are rich in glucosinolates, which are hydrolyzed by plant myrosinases following chewing or by microflora in the gastrointestinal tract to form ITCs (Shapiro et al., 2001a,b, 2006), the active anticarcinogenic metabolites. Isothiocyanates activate the Nrf2-Keap1 complex, initiating a series of events leading to induction of ARE containing target genes (Nguyen et al., 2003). We rationalized that ITC treatment would induce intestinal and potentially liver UGT1A1 in hUGT1 mice and serve as an efficient modulator of neonatal hyperbilirubinemia by inducing UGT1A1 and lowering TSB levels. When neonatal hUGT1 mice were treated orally with phenethyl isothiocyanate (PEITC), TSB levels were reduced to normal after 24 hours (Yoda et al., 2017). Induction of UGT1A1 was dramatic in both liver and small intestines, but the impact on the classic Nrf2-target genes Nqo1 și Gsta1/2 was not significant. We showed previously that oral As 3+ , which generates a potent antioxidant response, has a dramatic impact on Gsta1 și Gsta2 induction while also upregulating several of the cytochrome P450 2 and 4 subfamilies (Liu et al., 2016), indicating that the antioxidant response potentially initiated by PEITC treatment could be influencing the activation of additional signaling pathways. A screen of potential target genes induced by XNRs resulted in prominent induction of Cyp2b10/CYP2B10 in both liver and SI, indicating that CAR may be involved in the PEITC induction of UGT1A1 (Fig. 5).

PEITC regulates UGT1A1 gene expression through ROS-mediated nuclear receptor signaling. Consumption of cruciferous vegetables leads to the generation of reactive oxygen species (ROS). ROS activates Nrf2 nuclear translocation, thus facilitating Nrf2-antioxidant response element (ARE) signaling and the transcriptional activation of the susceptible target genes. In addition, ROS are linked to the activation of CAR in both liver and small intestines, which results in the induction of Cyp2b10 and UGT1A1. The addition of N-acetylcysteine (NAC) blocks ROS production, nullifying both CAR and Nrf2 activation.

To examine the component of CAR linking induction of UGT1A1 and CYP2B10 by PEITC, hUGT1/Car −/− were bred to generate CAR knockout hUGT1/Car −/− and heterozygous hUGT1/Car −/+ littermates. Ambii hUGT1/Car −/− și hUGT1/Car +/− neonatal mice develop hyperbilirubinemia at the same rate. When treated with an oral dose of PEITC, UGT1A1 and CYP2B10 were induced in liver and SI of hUGT1/Car +/− mice, with a total reduction in TSB levels. The induction of hepatic UGT1A1 was significant and most likely drove the metabolism of bilirubin, leading to the reduction in TSB levels. In liver tissue from PEITC-treated hUGT1/Car −/− mice, there was no expression of CYP2B10 or UGT1A1, indicating that CAR was essential for induction by PEITC. In SI, the induction of CYP2B10 was also absent, yet TSB levels were significantly reduced. In the absence of CAR, there was induction of UGT1A1 in the SI, which we expect was responsible for the reduction in TSB levels. While the induction by PEITC in SI could be attributed to activation of Nrf2, there was no significant transcriptional activation of other ARE target genes. The possibility exists that PEITC induction of intestinal UGT1A1 in neonatal mice is being driven by a mechanism that is independent from CAR and Nrf2 activation (Fig. 5).

Confirmation that CAR underlies CYP2B10 and UGT1A1 induction by PEITC was validated in adult hUGT1/Car +/− și hUGT1/Car −/− soareci. In liver and SI, oral PEITC treatment induced CYP2B10 in a strictly CAR-dependent fashion. Significant induction of CYP2B10 by PEITC in these tissues was generated only in hUGT1/Car +/− mice, with no response in hUGT1/Car −/− mice in either tissue, leaving us to speculate that induction of CYP2B10 by PEITC involved activation of CAR. A different pattern of induction was observed with UGT1A1 expression. In liver, UGT1A1 expression was greatly reduced in hUGT1/Car −/− mice, clearly linking CAR activation with UGT1A1 expression. However, in SI, PEITC treatment effectively induced UGT1A1 in both hUGT1/Car +/− și hUGT1/Car −/− mice, indicating that alternative CAR processes, such as activation of Nrf2, are responsible for the induction. In addition, Nrf2 target genes were induced in both liver and SI, confirming that the actions of PEITC are also initiating an ARE response. These findings indicate that two important signaling events, the activation of CAR and Nrf2, are linked to induction of UGT1A1 (Fig. 5).

Independently, the activation of CAR by ligands or the activation of Nrf2 by oxidative stress can facilitate the induction of UGT1A1. However, with PEITC treatment, evidence suggests that CAR and Nrf2 are linked in the induction of liver UGT1A1. To separate an antioxidative response initiated by PEITC from activation of CAR and induction of UGT1A1, we first administered adult hUGT1 soareci N-acetylcysteine (NAC) for 3 weeks in their drinking water. Cysteine is the rate-limiting substrate for the synthesis of glutathione (GSH), and thus supplementation of NAC promotes the resynthesis of GSH and the neutralization of free radicals (Rizzardini et al., 1994). GSH has antioxidant properties in addition to facilitating the activity of enzymatic antioxidant systems, including GSH peroxidase and GSH reductase. After 2 weeks of NAC exposure, the mice were treated with PEITC, and antioxidant responses were measured. In the absence of NAC exposure, PEITC treatment leads to robust induction of Nrf2 target genes Nqo1, Gsta1, și Gsta2, along with UGT1A1 și Cyp2b10. In mice exposed to NAC and treated with PEITC, Cyp2b10 gene expression was completely suppressed, along with Nqo1, Gsta1, și Gsta2. While PEITC induces oxidative stress that targets Nrf2 target genes, induction of UGT1A1 and CYP2B10 is dependent upon CAR. These findings indicate that induction of liver UGT1A1 by PEITC is dependent upon both Nrf2 and CAR, while the generation of oxidative stress is a prerequisite toward CAR activation and induction of UGT1A1 and CYP2B10 (Fig. 5).

Breast Milk-Induced Hyperbilirubinemia.

Breast milk (BM) plays a significant role in neonatal hyperbilirubinemia (Newman and Gross, 1963 Fujiwara et al., 2015), termed breast milk jaundice (BMJ) and is characterized by prolonged increases in unconjugated bilirubin. Infants with BMJ have elevated TSB levels above 10 mg/dl that can reach levels above 20 mg/dl, approaching the range that can induce bilirubin-induced neurologic toxicities. The prolonged increases in TSB levels during the neonatal window in hUGT1 mice indicate that breast milk may be participating in the development of hyperbilirubinemia. When neonatal hUGT1 mice were fed human breast milk, the mice continued to develop jaundice (Fujiwara et al., 2012). Clinical studies have demonstrated that newborns with jaundice given a formula diet have lower levels of TSB than breast-fed newborns, indicating that breast milk facilitates the repression of UGT1A1 (Schneider, 1986 Huang et al., 2004). To examine if we could replicate this effect in hUGT1 mice, neonatal mice were given a diet of baby formula for 72 hours (Fujiwara et al., 2012). After formula treatment, TSB levels were reduced over 95% compared with breast-fed mice. Formula induced UGT1A1 in intestinal tissue, which correlated with the reductions in TSB levels. Of significance, formula also induced the CAR target gene Cyp2b10 and PXR target gene Cyp3a11, indicating that formula targeted activation of CAR and PXR. When formula was given to neonatal hUGT1/Car −/− sau hUGT1/Pxr −/− mice, intestinal UGT1A1, Cyp2b10, and Cyp3a11 were induced in both strains, indicating formula was not activating either CAR or PXR. However, formula feeding led to activation of IκB/NF-κB target genes, linking activation of NF-κB with induction of intestinal UGT1A1. Given the finding that formula leads to activation of NF-κB and induction of intestinal UGT1A1 in neonatal hUGT1 mice, it can be speculated that the repressive effects of BM are tied with inhibition of the IKK/NF-κB pathway.

While IκB kinase (IKK) is an upstream component of NF-κB signaling, it is linked to propagating the cellular response to inflammation (Karin, 2009) and plays an important role in neonatal intestinal UGT1A1 expression (Fujiwara et al., 2012). Human breast milk, especially colostrum, is rich in human milk oligosaccharides (HMOs) (Bode, 2015 Lin et al., 2017) that bind to Toll-like receptors (TLRs) and prevent activation of the receptors by pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), which are expressed by microflora (He et al., 2016a Newburg et al., 2016). When TLRs are activated, they initiate intracellular signaling events that result in regulation of IKK and NF-κB. In comparison with term babies and adults, preterm children express higher concentrations of TLRs, and if activated, could induce an IKK/NF-κB inflammatory response that results in sepsis or necrotizing enterocolitis (NEC) (He et al., 2016a,b Niño et al., 2016). Components of breast milk block intestinal TLR activation by PAMPs, which in turn blocks downstream IKK phosphorylation. Since we have demonstrated that targeted deletion of intestinal IKKβ în hUGT1 mice represses newborn intestinal UGT1A1, we can speculate that IKK activity is directly linked to intestinal UGT1A1 expression. This concept is further supported by findings that when intestinal TLRs are activated in neonatal hUGT1 mice by agents, such as LPS, or IKK is directly activated by Cd 2+ , intestinal UGT1A1 is induced followed by a reduction in TSB levels. Thus the delayed expression of intestinal UGT1A1 can be traced to breast milk inhibition of TLR activation, which controls downstream activation of IKK. This concept can be highly relevant toward understanding the underlying mechanism associated with BMJ, since NCoR1 activity controls intestinal maturation and is directly linked to induction of intestinal UGT1A1. This also may explain why a diet of formula, which lacks TLR binding glycans, allows downstream activation of the IKK/NCoR1 loop, induction of intestinal UGT1A1, and a reduction in TSB levels. Equation would naturally dilute the concentrations of the TLR binding glycans allowing activation of the TLRs by PAMPs, followed by derepression of NCoR1 and induction of intestinal UGT1A1.


Principii generale

1.07.4.2 Glucuronosyl Transferases

Glucuronosyl transferases are a family of enzymes that catalyze the transfer of glucuronic acid from uridine diphosphate (UDP)-glucuronic acid to acceptor molecules containing hydroxyl, phenol, carboxylic acid, thiol, or amine groups ( Mulder 1992 Tukey and Strassburg 2000 ). Kinetic studies have shown that these enzymes follow a random sequential mechanism. Glucuronosyl transferases are located in the endoplasmic reticulum, and their biosynthesis can be induced by a number of drugs and xenobiotics. Some forms of glucuronosyl transferases are coordinately induced with cytochromes P450. Conjugation with glucuronic acid makes lipophilic molecules much more water-soluble and readily excretable, and therefore is considered a detoxication pathway. However, acyl glucuronides can undergo structural rearrangements and react with nucleophilic groups in cells ( Faed 1984 Ritter 2000 ). Thus glucuronidation of some molecules may represent bioactivation. For example, the acyl glucuronide of the hypolipidemic drug clofibrate acylates cellular macromolecules ( Faed 1984 ). However, the toxicological significance of this reaction is unclear.


UGT1A6

Common UGT1A6 Polymorphisms

UGT1A6 is a phenol-metabolizing UGT, primarily involved in the glucuronidation of simple phenols and planar arylamines 5,93 that mediates the conjugation of many currently prescribed drugs including antidepressants, neuroleptics and β-adrenoreceptor blockers. 93,129,130,131,132,133,134 The UGT1A6 gene has been found to be polymorphic with at least four alleles characterized by three SNPs in the coding sequence. The unmodified ‘wild-type’ allele is referred to as UGT1A6 * 1, while the allele characterized by the presence of both missense polymorphisms at codons 181 (Thr 181 Ala) and 184 (Arg 184 Ser) is referred as UGT1A6 * 2. 130 Although these two mutations are usually linked, both mutations have been observed separately. A single mutation at codon 184 is designated UGT1A6 * 3 and a single mutation at codon 181 is designated UGT1A6 * 4 (Table 4). 130,135 Functional studies by Ciotti et al 130 revealed that the protein encoded by the UGT1A6 * 2 allele has lower activity towards several phenolic compounds (27–75% of the rate of the wild-type enzyme). Also, 3-O-methyl-dopa and methyl salicylate were conjugated at 41–74% of the wild-type rate, whereas a series of β-blockers were metabolized at 28–69% of the normal level. The clinical implications of these variant alleles still remain to be determined. The data reported by Ciotti et al 130 has suggested that the UGT1A6 * 2 low-activity allele is frequent in the population (frequency of 0.173). The impact of single substitutions at codons 181 ( * 4) and 184 ( * 3) was not assessed in vitro. The allelic distribution as a function of ethnicity was further assessed in a second study conducted by Lampe et al. 135 They reported higher frequencies of the UGT1A6 * 2 and UGT1A6 * 3 alleles compared to previous studies, with distributions being slightly different between Caucasian and Asian populations (Table 4). In a population composed of healthy Caucasian subjects (n=103), frequencies of 0.010 and 0.024 were observed for the alleles UGT1A6 * 3 and UGT1A6 * 4 and the genotype frequencies were found to be in Hardy–Weinberg equilibrium (Table 4).

The combined distribution of polymorphisms in the TATA-box region of the UGT1A1 promoter and polymorphisms in UGT1A6 was assessed in the study of Lampe et al. 135 A significant linkage disequilibrium between genotypes for UGT1A1 * 28 and UGT1A6 * 2 was observed in both Caucasian and Asian populations. Homozygous variants were observed in 8% of the cases and 43% of individuals had at least one variant allele for both UGT1A1 * 28 and UGT1A6 * 2. Therefore, for compounds metabolized by these two hepatic UGT enzymes, neither of them would theoretically be able to compensate for the deficiency of the other enzyme since low-activity UGT1A6 and UGT1A1 alleles are closely linked.

Modulation of Colon Adenoma Risk by UGT1A6 Genotypes

The group of Bigler et al 136 have explored the role of UGT1A6 polymorphic variations in relation to the risk of developing colon adenoma. In their population-based study, 474 adenoma cases and 563 control subjects were genotyped for the variations at codons 181 and 184 of UGT1A6. Regression analyses, adjusted for age, sex, smoking and hormone replacement therapy, did not reveal any significant increase in the risk of developing adenoma in subjects carrying variant UGT1A6 alleles. However, the UGT1A6 genotype was shown to modulate colon adenoma risk in aspirin users (OR=0.53 (95% CI=0.33–0.86)) and nonaspirin NSAID users (OR=0.47 (95% CI=0.24–0.92)) when compared to aspirin and nonaspirin NSAID users carrying the UGT1A6 wild-type genotype, respectively. These results suggest that the UGT genotype modulates the efficacy of chemopreventive drugs, such as NSAID.


Neonatal Jaundice

Fiziopatologia

Kernicterus, which is characterized by a deposition of unconjugated bilirubin in brain cells, may occur in neonates as the result of hyperbilirubinemia and the immaturity of the blood-brain barrier. Unconjugated bilirubin is the major breakdown product of heme and is normally glucuronidated in liver . Bilirubin diglucuronide is excreted in feces by way of the bile. When this process is altered, the unconjugated bilirubin may be deposited in the basal ganglia, hippocampus and hypothalamic nuclei as bilirubin-phosphatidylcholine precipitate, where it gives rise to neuronal necrosis. Clinical manifestations of this condition may include weakness in drinking, vomiting , attacks of fever , convulsions, reflex anomalies, shrill shrieking, apathy, muscular hypertonicity, cramps, opisthotonus, strabismus, nystagmus and apnea. The lethality rate is about 75%. Survival is accompanied by cerebral paresis, deafness and mental retardation Kuntz and Kuntz (2002) .


Rezultate

HMOX1 promoter variants and CRC risk

HMOX1 L/M/S-allele carrier status was not found to be associated with CRC risk (Table 1) neither was the A(-413)T variation (Table 1). However, a diplotype analysis revealed that the A23/A30 diplotype (indicating A(-413)T and (GT)n genetic variations (GT)23 belonging to the S allele class, while (GT)30 belonging to the M allele class) was associated with a substantially increased risk of CRC as it occurred only rarely in the control population. This association remained significant after adjustment for age and sex (OR 95%CI: 12.1 3.2–46.3, p < 0,001). LD was strong for both analyzed promoter gene variants (D′ for A23 = −0.914, p = 10 −20 and D′ for A30 = 0.923, p = 10 −20 ).

UGT1A1 promoter variants and CRC risk

The UGT1A1*28 allele carrier status was associated with a 20% decrease in risk of CRC (Table 1). To determine if age influenced the results, both groups were stratified according to age into 10-year age groups. The CRC risk in these subgroups was estimated separately for men and women. A consistent protective effect of UGT1A1*28 allele was observed mainly in men, whereas in women, this effect was less pronounced. The overall results showed a substantial decrease in CRC risk in males (0.75 [0.58–0.96]), but only a nonsignificant decline in females (0.88 [0.66–1.18]). The logistic regression and the stratified analyses provided practically identical results. Therefore, the latter, more intuitive results are reported in our study.

Serum bilirubin levels in CRC patients and controls

CRC patients displayed significantly lower serum bilirubin levels, when compared to the controls (9.8 vs. 11.35 μmol/L, p < 0.001 Fig. 1). This difference was more pronounced in males (10.08 vs. 12.8 μmol/L, p < 0.001) than in females (9.17 vs. 10.22 μmol/L, p = 0.023 (Fig. 1). As age and gender are potential confounders of the association between serum bilirubin levels and the CRC risk, we controlled for their effects by multiple binary logistic regression analysis. The results indicated that CRC risk was explained by serum bilirubin levels [OR (95% CI) = 0.93 (0.88–0.97)], age [OR (95% CI) = 1.08 (1.06–1.10)], but not gender [OR (95% CI) = 1.00 (0.65–1.55)]. Furthermore, the data also implied that each 1 μmol/L decrease in serum bilirubin was associated with a 7% increase in CRC risk (Table 2). When stratified according to gender, this association was again stronger in males than in females (Fig. 1). In accord with that the occurrence of unconjugated hyperbilirubinemia, similar to that found in individuals with Gilbert's syndrome (>17.1 μmol/L), was almost two times lower in CRC patients than in the control population [OR (95% CI) = 0.55 (0.31–0.98)]. In addition, a trend demonstrating possible association between low serum bilirubin and progressive cancer disease was observed (10.3 vs. 6.6 μmol/L, p = 0.06 for patients with N1 compared to N3 disease 10.05 vs. 8.1 μmol/L, p = 0.22, for patients with M0 vs. M1 disease), regardless of low statistical power.

Serum bilirubin levels in a subset of studied subjects. Data expressed as median and IQ range. Mann–Whitney Rank Sum test was used for comparison of analyzed variables.

Analysis of serum bilirubin levels in subjects clustered according to individual genotypes (Table 3) revealed that the presence of (TA)7 allele in the promoter of UGT1A1 is associated with increased serum bilirubin levels in both CRC patients and in control subjects (Table 3). The results also indicate that the number of GT repeats in the promoter region of HMOX1 did not affect serum bilirubin levels. However, the T(-413)T carriers had substantially lower serum bilirubin levels in both CRC and control groups (Table 3). Interestingly, a diplotype A23/A30 linked with an increased CRC risk was not associated with exceptionally low serum bilirubin levels, suggesting that these variants may modulate the CRC risk by some other mechanisms. The data consistently indicate that serum bilirubin levels were substantially lower in CRC patients within all studied genotype groups (Table 3).


Introducere

Vertebrates evolved with the UGT (UDP-glucuronosyltransferase) gene family, 1, 2 a set of endoplasmic reticulum-specific enzymes that catalyze the transfer of glucuronic acid from uridinediphospho-glucuronic acid to various lipophilic substrates. This reaction is crucial to the processing of bilirubin and endogenous hormones, the elimination of therapeutic drugs from the circulation, and the inactivation of environmental toxins. Omul UGT1A locus on chromosome 2q37 contains 13 promoters/first exons that encode nine proteins sharing a common C-terminus encoded by the 3′ exons 2–5. 3 The lead exon in any given transcript is predicted to be spliced to the four common exons to generate a functional enzyme. Each product is named for the UGT1A locus and an additional number representing the spliced first exon. For the enzyme product, this lead exon encodes the amino-terminal substrate specificity and the common exons encode the UDP-glucuronic acid-accepting domain. This multiple tandem exon structure is a shared feature of several important genes and may provide a common mechanism for directing cell- and tissue-specific gene expression. 4

Products of the UGT1A locus metabolize endogenous molecules such as thyroxine, estrone, and bilirubin. Of the nine UGT1A isoenzymes, UGT1A1 has the greatest bilirubin-conjugating activity, 1 required for elimination of bilirubin. Diminished production or activity of this enzyme leads to the hyperbilirubinemic syndromes described by Crigler–Najjar and Gilbert 5, 6, 7, 8 these syndromes have been associated with several common and rare variants of UGT1A1. 1, 8, 9, 10, 11 Genome-wide scanning of healthy human pedigrees has linked serum bilirubin levels most strongly to the chromosome 2q37 region containing UGT1A. 12 However, bilirubin levels also depend on the rate of production of bilirubin. Hence, the severity of inherited hemolytic syndromes such as glucose 6-phosphate dehydrogenase deficiency and sickle cell anemia may be exacerbated or mitigated by variants of UGT1A and these interactions may have affected the evolutionary history of this gene in different human populations. 13, 14, 15

While the primary selective pressure for UGT1A enzyme function may have been metabolism of endogenous molecules, UGT1A function is necessary for elimination of exogenous compounds such as the anti-cancer drug irinotecan. 16, 17, 18 The same common UGT1A1 variants associated with mild elevations of serum bilirubin are associated with diminished in vitro glucuronidation of the active irinotecan metabolite, SN-38, 19, 20, 21, 22 and prolonged exposure and increased toxicity in patients receiving this agent. 23, 24, 25 As shown by Sai et al., 25 re-sequencing of the UGT1A1 gene in 85 Japanese patients treated with irinotecan confirmed that the haplotypes containing lower expression variants were associated with both a low SN-38G/SN-38 AUC ratio and elevated pretreatment bilirubin concentration. Importantly, however, additional haplotypes appeared to have distinct modifying effects on the SN-38 AUC ratio and total bilirubin level phenotypes, suggesting that more complete genetic variation data for UGT1A may better predict bilirubin and irinotecan metabolism phenotypes. As common genetic variants of the UGT1A locus may better predict toxicity of irinotecan than conventionally used variables, 26 ongoing clinical trials have been designed to test the safety and efficacy of adjusting doses of irinotecan according to patients’ UGT1A genotypes.

For the anti-keloid/anti-allergy agent tranilast, hyperbilirubinemia is a common toxicity. 27 A staged, genome-wide analysis has associated three single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the UGT1A locus with this toxicity. 28 Although it is reasonable to assume that the association between hyperbilirubinemia and these pharmacologic agents is based on genetic variation at UGT1A1, for other metabolic/toxicologic phenotypes of UGT1A, the overlapping tissue distributions and substrate affinities of enzymes encoded by this locus may complicate interpretation of single genotype or single exon–haplotype association studies. As suggested by the results of Sai et al., 25 detailed knowledge of the interindividual genetic variability across this region, especially if focused on the segments most likely to affect expression and activity of these enzymes, could yield a better understanding of the pathopharmacology of new drugs.

The analysis of patterns of human variation is an important prerequisite for designing association studies aimed at assessing the role of genetic variation in drug response phenotypes. Re-sequencing approaches to the study of human variation may provide information to clarify the relative roles of common and rare variants on gene regulation and function. Pentru UGT1A, a re-sequencing approach is complicated by the size of the region, spanning approximately 200 kb. Many previous studies of the breadth of human diversity of pharmacologically relevant genes have focused on exon re-sequencing and in vitro assays of protein function. 29, 30 Such studies are likely to identify many functional variants, but may miss functional non-coding sequence variants, 31 as have already proved important for UGT1A1. 8, 11, 32 To focus on the regions of the entire UGT1A locus most likely to affect clinical phenotypes, we identified 29 kb of non-coding sequence highly conserved between humans and four mammalian species and re-sequenced these regions as well as over 8 kb of exon sequence in 72 individuals from three ethnic populations.

Typically, genotype/phenotype association studies of UGT1A have been performed on populations derived predominantly from a single population (e.g. Japanese, European, European-American), but the variants selected for genotyping are often based on allele frequency data generated from a population of greater ethnic diversity than the test group. To provide information useful to the interpretation of published studies and the design of future studies we present (1) a comparative genomics analysis aimed at identifying evolutionary conserved regions most likely to affect UGT1A function, (2) the relationship between the degree of sequence conservation across species and the proportion of polymorphic variants at conserved coding and non-coding sites, (3) the frequency distribution of coding variants as a function of the probability of an effect on enzyme function, and (4) differences in allele frequency and linkage disequilibrium (LD) of newly and previously identified variants in European-Americans, Asians, and African-Americans.


Rezumat

Clinical studies show that individuals with elevated bilirubin concentrations, in the absence of liver pathology, are at reduced risk of CKD, CVD, and related mortality. Mildly elevated bilirubin concentrations are consistently associated with reduced vascular resistance (10, 52), improved eGFR (25, 145), renal tubular function, and slowing of the progression of kidney damage (1), in the absence of comorbidities including liver dysfunction and bacterial infection (42, 133, 167). Multiple mechanisms likely explain the protective effect of bilirubin (Fig. 3), including antioxidant and anti-inflammatory effects, suggesting that it could represent a biomarker and potential therapeutic target to reduce CKD/CVD risk (19). Indeed, recent studies have identified numerous molecules that either induce HO activity or partially inhibit UGT1A1, which could be used therapeutically to induce the protective effects of bilirubin in individuals at increased risk of CVD/CKD (81, 105, 184, 199).


Priveste filmarea: Formação e metabolismo da bilirrubina (Iunie 2022).


Comentarii:

  1. Durr

    Gloomy pictures are like that :)

  2. Donal

    Clasa =)

  3. Ilhicamina

    mi se pare ca ai dreptate

  4. Dounos

    Nu ai dreptate. Sa discutam. Scrie -mi în PM, vom comunica.



Scrie un mesaj