Informație

Cum să verificați dacă un fișier fastq are citiri unice sau asociate

Cum să verificați dacă un fișier fastq are citiri unice sau asociate



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Încerc să verific dacă un fișier fastq are citiri unice sau asociate. Cum pot realiza acest lucru cu o metodă rezistentă la erori?

Am verificat wikipedia și MAQ, dar vreau să știu dacă există un document de încredere care să descrie toate variantele posibile în ID-ul secvenței pentru a verifica citirile unice/pereche.

De asemenea, caut o bibliotecă, mai bună în Python, pentru a realiza acest lucru.

Mulțumiri


Până acum am primit câteva răspunsuri interesante la această întrebare pe Biostars

Practic ceea ce am făcut este următorul:

  • În primul rând, am verificat dacă Id-ul secvenței conține notație finală pereche. După cum este descris în această pagină wikipedia, pentru citirile Illumina există două notații posibile pentru citirile finale unice/pereche:

    @HWUSI-EAS100R:6:73:941:1973#0/1

    Dacă ultimul număr este/2în unele citiri, atunci citirile sunt împerecheate final; altfel pot avea un singur capăt.

    A doua notație este:

    @EAS139:136:FC706VJ:2:2104:15343:197393 1:Y:18:ATCACG

    Dacă primul număr din a doua grupă este2în unele citiri, atunci citirile sunt împerecheate final; în caz contrar, pot fi un singur capăt;

  • Apoi am verificat pentru mai multe fișiere. Dacă un eșantion are două fișiere fastq, este probabil ca citirile să fie împerecheate la sfârșit. Cu toate acestea, este de remarcat că, cu un singur fișier, nu este posibil să se excludă că citirile de sfârșit pereche pot fi intercalate într-un singur fișier, chiar dacă nu este obișnuit (în opinia mea);

  • Cea mai generală metodă este verificarea încrucișată a fiecărei citiri cu întregul set de citiri. Dacă prima parte a ID-ului secvenței (în acest caz câmpul pornind de la@și se termină înainte de#- în prima notație - sau spațiul alb - în a doua notație) este unic între toate citirile (pentru fiecare citire) este probabil ca citirile să fie citiri simple, în caz contrar - dacă poate fi găsit un duplicat pentru fiecare citire - citirile sunt împerecheate capăt. În acest caz, pe sistemele *nix se poate realiza cu următoarea comandă (mulțumită răspunsurilor biostars):

    grep --no-filename @HWUSI-EAS100R:6:73:941:1973 *.fastq | cut -d"-f1 | sort | uniq -c | sort -rgk 1,1 | head

    Dacă rezultatul arată în primele rânduri un rezultat ca acesta:

    1 citire1_ID

    1 citire2_ID

    Este probabil să fie un singur capăt. In caz contrar:

    2 read1_ID

    2 read2_ID

    este împerecheat capăt.

Am citit documentația BioPython API, dar nu găsesc ceva util să o fac.

Sugestiile și corecturile sunt binevenite.

Mulțumiri


Acesta este un răspuns complementar la ceea ce a furnizat @gc5.

pentru cazurile care folosesc „a doua notație” care arată astfel:

@EAS139:136:FC706VJ:2:2104:15343:197393 1:Y:18:ATCACG' ^ |________________ce încercăm să extragem

Următorul cod va trece prin toate fișierele în mod iterativ și va produce o ieșire per fișier:

grep -P "^@" *.fastq | grep -oP „sd+” | sortare | uniq -c

sau dacă ai.fastq.gzfisiere:

zgrep -e "^@" *.fastq.gz | grep -oP „sd+” | sortare | uniq -c

dacă ai single-end vei vedea doar unul și dacă ai paired-end vei vedea unul și doi. De asemenea, ca verificare a stării de spirit, puteți vedea câte aveți din fiecare:

zgrep --max-count=10000 -e "^@" *.fastq.gz | grep -oP „sd+” | sortare | uniq -c
6333652 1 6333652 2

Notă pe care am adăugat--max-count=10000până la ultimul. Acest lucru este util în special dacă aveți capete împerecheate în fișiere separate, deoarece veți obține toate cele din unul și toate două de la celălalt. Acest lucru va trece doar prin primele 10.000 de linii, ceea ce face ca această linie să fie mult mai rapidă.


Cum să verificați dacă un fișier fastq are citiri unice sau pereche - Biologie

Tehnologia de secvențiere Illumina utilizează generarea de clustere și secvențierea prin chimie de sinteză (SBS) pentru a secvenția milioane sau miliarde de clustere pe o celulă de flux, în funcție de platforma de secvențiere. În timpul chimiei SBS, pentru fiecare cluster, apelurile de bază sunt efectuate și stocate pentru fiecare ciclu de secvențiere de către software-ul Real-Time Analysis (RTA) de pe instrument. RTA stochează datele apelului de bază sub formă de fișiere individuale de apel de bază (sau BCL). La încheierea secvenței, apelurile de bază din fișierele BCL trebuie convertite în date secvențe. Acest proces se numește conversie BCL în FASTQ.

Un fișier FASTQ este un fișier text care conține datele secvenței de la clusterele care trec filtru pe o celulă de flux (pentru mai multe informații despre clusterele care trec filtrul, consultați secțiunea „informații suplimentare” din acest buletin). Dacă mostrele au fost multiplexate, primul pas în generarea fișierului FASTQ este demultiplexarea. Demultiplexarea atribuie clustere unui eșantion, pe baza secvenței de index ale clusterului. După demultiplexare, secvențele asamblate sunt scrise în fișiere FASTQ per probă. Dacă probele nu au fost multiplexate, etapa de demultiplexare nu are loc și, pentru fiecare bandă de celule de flux, toate clusterele sunt atribuite unei singure probe.

Pentru o analiză cu o singură citire, este creat un fișier FASTQ Read 1 (R1) pentru fiecare probă pe banda de celule de flux. Pentru o rulare cu sfârșit împerecheat, se creează un fișier FASTQ R1 și unul Read 2 (R2) pentru fiecare probă pentru fiecare bandă. Fișierele FASTQ sunt comprimate și create cu extensia *.fastq.gz.

Cum arată un fișier FASTQ?

Pentru fiecare grup care trece filtrul, o singură secvență este scrisă în fișierul R1 FASTQ al eșantionului corespunzător și, pentru o rulare cu sfârșit de pereche, o singură secvență este, de asemenea, scrisă în fișierul R2 FASTQ al eșantionului. Fiecare intrare dintr-un fișier FASTQ constă din 4 rânduri:

  1. Un identificator de secvență cu informații despre rularea de secvențiere și cluster. Conținutul exact al acestei linii variază în funcție de software-ul de conversie BCL în FASTQ utilizat.
  2. Secvența (baza numește A, C, T, G și N).
  3. Un separator, care este pur și simplu un semn plus (+).
  4. Scorurile de bază ale calității apelurilor. Acestea sunt codificate Phred +33, folosind caractere ASCII pentru a reprezenta scorurile numerice de calitate.

Iată un exemplu de o singură intrare într-un fișier R1 FASTQ:

Informații mai detaliate despre formatul de fișier al secvenței FASTQ pot fi găsite aici.

Cum să vizualizați un fișier FASTQ

Fișierele FASTQ pot conține până la milioane de intrări și pot avea o dimensiune de câțiva megaocteți sau gigaocteți, ceea ce le face adesea prea mari pentru a fi deschise într-un editor de text normal. În general, nu este necesar să vizualizați fișierele FASTQ, deoarece acestea sunt fișiere de ieșire intermediare utilizate ca intrare pentru instrumentele care efectuează analize în aval, cum ar fi alinierea la o referință sau un ansamblu de novo.

Dacă trebuie să vizualizați un fișier FASTQ în scopuri de depanare sau din curiozitate, veți avea nevoie fie de un editor de text care poate gestiona fișiere foarte mari, fie de acces la un sistem Unix sau Linux unde fișierele mari pot fi vizualizate prin linia de comandă.

Cum se generează fișiere FASTQ

Generarea fișierelor FASTQ este primul pas pentru toate fluxurile de lucru de analiză utilizate de MiSeq Reporter pe MiSeq și Local Run Manager pe MiniSeq. Când analiza se finalizează, fișierele FASTQ sunt localizate în folderul <run>DataIntensitiesBaseCalls pe MiSeq și <output folder>Alignment_#<subfolder>Fastq pe MiniSeq.

Pentru toate rulările încărcate în BaseSpace Sequence Hub, generarea fișierelor FASTQ are loc automat după ce rularea este complet încărcată, iar fișierele FASTQ sunt folosite ca intrare pentru diferitele aplicații de analiză de pe BaseSpace Sequence Hub. Pe BaseSpace Sequence Hub, puteți găsi fișierele dvs. FASTQ în proiectul(ele) asociat(e) rulării dvs.

Software-ul de conversie bcl2fastq poate fi folosit pentru a genera fișiere FASTQ din datele generate pe toate sistemele actuale de secvențiere Illumina.

Pentru informații despre diferitele setări care pot fi aplicate în timpul generării fișierelor FASTQ, consultați ghidurile de utilizare a software-ului de mai jos.


Acum trecem la o preprocesare reală. Vom folosi fastq-mcf pentru a tăia adaptorul din citirile noastre și pentru a face niște filtrare de calitate. Trebuie să tăiem adaptorul, deoarece dacă un fragment este suficient de scurt, vom secvența tot drumul prin fragment și în adaptor. Evident, secvența adaptorului nu se găsește în genom și poate împiedica alinierea corectă a citirii. Pentru a face tăierea, trebuie să generăm un fișier adaptor.

Primul pas este să obțineți secvența adaptorului. Putem obține acest lucru din manual, dar secvențele dintr-un PDF pot prelua caractere ciudate, așa că este mai bine să obținem secvențele adaptorului din Primer Sample Sheet.

Putem descărca și afișa Sample Sheet folosind curl:

Vrem secvențele adaptorului din foaia de probă:

Acum trebuie să facem ca fișierul adaptorului să fie în format FASTA.

Navigați la scratch/bioinf_intro/myinfo

Faceți clic pe meniul jupyter „Fișier” și selectați „Deschidere”.

Când se deschide noua fereastră/filă de browser, faceți clic pe fila „Fișiere” dacă nu este deja activă.

Faceți clic pe simbolul „acasă” pentru a merge la directorul de nivel superior, apoi faceți clic pe „informațiile mele”

În meniul „Nou” selectați „Fișier text”.

În acest fișier text, lipiți liniile adaptorului de sus.

De asemenea, dorim să includem și complementul invers al adaptorului, în cazul în care contaminarea adaptorului așa cum este secvențial este completarea inversă a ceea ce este dat. Cel mai simplu mod de a face acest lucru este să utilizați https://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html pentru a genera complementul invers, apoi numiți-l așa cum ar fi „Adapter_RC”

Acum curățați asigurându-vă că...

Fiecare secvență este pe linia ei

Fiecare secvență are un nume pe linia dinaintea ei

Numele secvenței este precedat de un „>”

Toate virgulele și spațiile trebuie eliminate, iar caracterele care nu sunt secvențe trebuie eliminate din liniile de secvență. Acum ar trebui să arate astfel:

Faceți clic pe „untitled.txt” pentru a schimba numele fișierului în „neb_e7600_adapters.fasta”


Secvențierea cu sfârșit pereche vs. cu o singură citire

Înțelegeți diferențele cheie dintre aceste tipuri de citire în secvențiere

Ce este secvențierea cu final perechi?

Secvențierea la capăt pereche permite utilizatorilor să secvențeze ambele capete ale unui fragment și să genereze date de secvență de înaltă calitate, aliniabile. Secvențierea la capătul pereche facilitează detectarea rearanjamentelor genomice și a elementelor de secvență repetitivă, precum și a fuziunilor de gene și a transcrierilor noi.

Pe lângă faptul că produc de două ori mai mult număr de citiri pentru același timp și efort în pregătirea bibliotecii, secvențele aliniate ca perechi de citire permit o aliniere mai precisă a citirii și capacitatea de a detecta variante de inserare-ștergere (indel), ceea ce nu este posibil cu citirea unică. date. 1 Toate sistemele de secvențiere de ultimă generație (NGS) Illumina sunt capabile de secvențiere în pereche.

Ce este secvențierea cu final perechi?

Repere secvențiere cu sfârșit pereche

  • Biblioteci simple cu sfârșit pereche: Fluxul de lucru simplu permite generarea de game unice de dimensiuni de insert
  • Utilizare eficientă a probei: Necesită aceeași cantitate de ADN ca ADN-ul genomic cu citire simplă sau secvențierea ADNc
  • Gamă largă de aplicații: Nu necesită metilarea ADN-ului sau digestia de restricție poate fi utilizată pentru secvențierea bisulfiților
  • Analiza simplă a datelor: Permite ansambluri de secvențe de înaltă calitate cu biblioteci cu inserare scurtă. O modificare simplă a procesului standard de pregătire a bibliotecii cu citire unică facilitează citirea atât a șablonului direct cât și invers al fiecărui grup în timpul unei citiri la capăt pereche. Ambele citiri conțin informații de poziție pe distanță lungă, permițând alinierea foarte precisă a citirilor.
Introducere în secvențierea Illumina

Această prezentare generală descrie progresele majore ale tehnologiei de secvențiere, metodele cheie, elementele de bază ale chimiei de secvențiere Illumina și multe altele.

Secvențierea ADN-ului cu capăt pereche

Citirile de secvențiere a ADN-ului la capătul pereche oferă o aliniere de înaltă calitate între regiunile ADN care conțin secvențe repetitive și produc contig lungi pentru de novo secvențierea prin completarea golurilor din secvența consensului. Secvențierea ADN-ului la capătul pereche detectează, de asemenea, rearanjamente comune ale ADN-ului, cum ar fi inserții, ștergeri și inversiuni.

Metode pentru secvențierea ADN-ului

Secvențierea ADN-ului poate fi aplicată regiunilor mici, vizate sau întregului genom printr-o varietate de metode.

Secvențierea lungimii de citire

Alegerea lungimii corecte de citire a secvenței depinde de tipul eșantionului, aplicația și cerințele de acoperire. Aflați cum să calculați lungimea corectă de citire pentru rularea dvs. de secvențiere.

Secvențierea ARN cu capăt pereche

Secvențierea ARN la capătul pereche (ARN-Seq) permite aplicații de descoperire, cum ar fi detectarea fuziunilor de gene în cancer și caracterizarea izoformelor noi de îmbinare. 2

Pentru ARN-Seq cu capăt pereche, utilizați următoarele kituri cu un protocol de fragmentare alternativ, urmat de generarea și secvențierea standard de cluster la capătul pereche Illumina.

Pentru pregătirea bibliotecii mRNA-Seq, utilizați:
Pentru pregătirea bibliotecii de ARN total catenar, utilizați:
Prezentare generală ARN-Seq

Această metodă oferă o vedere de înaltă rezoluție a regiunilor de codificare și necodificare ale transcriptomului pentru o înțelegere mai profundă a biologiei.

NGS dezvăluie lumea misterioasă a microbilor

Cercetătorii folosesc 16sRNA pentru a investiga genomul microbilor și pentru a ne îmbunătăți înțelegerea sănătății umane, bolilor și evoluției microbiene.

Secvențierea cu o singură citire

Secvențierea cu o singură citire implică secvențierea ADN-ului de la un singur capăt și este cea mai simplă modalitate de a utiliza secvențierea Illumina. Această soluție oferă volume mari de date de înaltă calitate, rapid și economic. Secvențierea cu citire unică poate fi o alegere bună pentru anumite metode, cum ar fi secvențierea ARN-Seq mică sau secvențierea imunoprecipitării cromatinei (ChIP-Seq).

Pregătirea bibliotecii

Soluțiile inovatoare și cuprinzătoare de pregătire a bibliotecii sunt o parte cheie a fluxului de lucru de secvențiere Illumina.

Sunteți interesat să primiți buletine informative, studii de caz și informații de la Illumina pe baza domeniului dvs. de interes? Inscrie-te acum.

Resurse aditionale

Tehnologia de secvențiere video

Vedeți tehnologia SBS în acțiune.

Tehnologia de secvențiere video

Instrument de selecție a platformei de secvențiere

Comparați viteza și debitul sistemelor de secvențiere Illumina pentru a găsi cel mai bun instrument pentru laboratorul dvs.

Referințe
  1. Nakazato T, Ohta T, Bono H. Exploatare funcțională bazată pe proiectare experimentală și caracterizare a datelor de secvențiere cu randament ridicat în arhiva de citire a secvenței. Plus unu. 20138(10):e77910.
  2. Wang Z, Gerstein M, Snyder M. ARN-Seq: un instrument revoluționar pentru transcriptomics. Nat Rev Genet. 200910:57–63.

Tehnologii inovatoare

La Illumina, scopul nostru este să aplicăm tehnologii inovatoare la analiza variației genetice și a funcției, făcând posibile studii care nici măcar nu erau imaginabile cu doar câțiva ani în urmă. Este esențial pentru noi să oferim soluții inovatoare, flexibile și scalabile pentru a satisface nevoile clienților noștri. În calitate de companie globală care acordă o mare valoare interacțiunilor colaborative, livrării rapide de soluții și oferind cel mai înalt nivel de calitate, ne străduim să facem față acestei provocări. Tehnologiile inovatoare de secvențiere și matrice Illumina alimentează progrese inovatoare în cercetarea în știința vieții, genomica translațională și de consum și diagnosticarea moleculară.

Numai pentru uz de cercetare. A nu se utiliza în procedurile de diagnosticare (cu excepția celor menționate în mod specific).


Cum să verificați dacă un fișier fastq are citiri unice sau pereche - Biologie

NGmerge: îmbinarea citirilor cu sfârșitul împerecheat și eliminarea adaptoarelor de secvențiere

Gaspar JM. BMC Bioinformatica. 2018 Dec 2019(1):536. [PubMed] [BMC] [PDF]

NGmerge operează pe secvențe de perechi de mare debit în două moduri distincte (Fig. 1).

În modul de cusătură implicit, NGmerge combină citirile la capăt pereche care se suprapun într-o singură citire care se întinde pe întreaga lungime a fragmentului ADN original (Fig. 1A). Capetele citirii îmbinate sunt definite de capetele 5' ale citirilor originale. Citirile care nu reușesc procesul de îmbinare (din cauza lipsei unei suprapuneri suficiente sau a erorilor excesive de secvențiere) sunt plasate în fișiere de ieșire secundare, dacă utilizatorul le solicită.

Modul alternativ de îndepărtare a adaptorului returnează citirile originale ca perechi, eliminând proeminențele de 3’ ale acelor citiri a căror aliniere validă cusut are această caracteristică (Fig. 1B). Citirile ale căror aliniamente nu au astfel de supraîncărcări (sau nu se aliniază deloc) vor fi de asemenea tipărite în fișierele de ieșire, nemodificate.

Figura 1. Moduri de analiză ale NGmerge. Diagramele arată citirile cu capete perechi (R1, R2) derivate din secvențierea fragmentelor de ADN (cutii albe) cu adaptoare de secvențiere (cutii gri) la fiecare capete.

  • sample_R1.fastq.gz , sample_R2.fastq.gz (fișiere de secvență de sfârșit pereche pentru o probă)
  • NGmerge (descărcat și compilat așa cum este descris mai jos)

Pentru a produce citiri cusute (Fig. 1A): sample_merged.fastq.gz

Pentru a produce citiri cu adaptoarele îndepărtate (Fig. 1B): sample_noadapters_1.fastq.gz și sample_noadapters_2.fastq.gz

Software-ul poate fi descărcat de pe GitHub. (și ești deja aici! felicitări!)

Un Makefile este furnizat pentru compilare cu GCC și sunt, de asemenea, necesare atât zlib, cât și OpenMP. Programul a fost testat după compilare cu GCC 6.3.0, zlib 1.2.8 și OpenMP 4.0.

Pentru a compila, executați make în folderul în care a fost descărcat software-ul. Ar trebui să fie produs executabilul NGmerge.

În oricare dintre modurile de analiză (Fig. 1), NGmerge evaluează toate aliniamentele posibile fără întreruperi ale unei perechi de citiri în încercarea de a găsi una optimă. Determinările a căror aliniamente sunt luate în considerare, și apoi care aliniere (dacă există) este atât validă, cât și optimă, se fac în funcție de mai mulți parametri: -m , -p , -d , -e , și -s .

NGmerge începe prin alinierea unei perechi de citiri (R1, R2) astfel încât parametrul minim de suprapunere (-m , implicit 20bp) să fie îndeplinit. Apoi verifică fiecare aliniere posibilă a citirilor până când acestea se suprapun fără proeminențe de 3' (Fig. 2A). Dacă este selectată opțiunea -d (sau în modul de îndepărtare a adaptorului [ -a , care setează automat -d ]), NGmerge evaluează în plus aliniamentele în coadă de rândunică (cu 3' de deasupra), până la lungimea minimă setată de parametrul -e ( Fig. 2B).

Figura 2. Aliniamente considerate de NGmerge. A: Aliniamentele implicite variază de la cele cu lungimea minimă de suprapunere (setată cu -m ), până la suprapuneri complete fără depășiri. B: Când este selectată opțiunea -d, NGmerge evaluează și aliniamentele în coadă de rândunică.

Pentru fiecare aliniere, NGmerge calculează nepotrivirea fracției (numărul de nepotriviri dintre citirile R1 și R2, împărțit la lungimea suprapunerii). Aliniamentele cu valori calculate care nu depășesc pragul stabilit de parametrul -p (implicit 0,10) sunt considerate valide. Dacă sunt găsite mai multe aliniamente valide, cea cu cea mai mică nepotrivire a fracțiunii este selectată ca aliniere optimă. În cazuri rare în care aliniamentele multiple au nepotriviri de fracțiuni identice, cea mai lungă este preferată implicit (cu excepția cazului în care este setat -s). În toate aceste calcule, bazele ambigue (Ns) nu sunt considerate nici potriviri, nici nepotriviri.

Mai jos sunt oferite descrieri suplimentare ale acestor parametri.

NGmerge analizează citirile pereche nealiniate în format FASTQ. Fișierele de intrare pot fi comprimate cu gzip. Se pot specifica mai multe seturi de fișiere de intrare, separate prin virgulă (sau separate prin spațiu, între ghilimele).

Fișierele de intrare trebuie să enumere citirile în aceeași ordine. Programul necesită ca anteturile citirilor asociate să se potrivească, cel puțin până la primul caracter spațiu.

Un fișier de intrare cu citiri intercalate poate fi analizat prin nespecificarea unui fișier -2. De asemenea, este posibil să citiți din stdin folosind - , de ex. -1 - .

Deoarece citirile îmbinate sunt definite de capetele 5’ ale alinierii citirilor pereche (Fig. 1A), ar trebui să fim atenți la tăierea calității citirilor la acele capete. De exemplu, atunci când utilizați un program precum qualTrim, ar trebui să specificați -3 pentru a vă asigura că tăierea calității are loc numai la capete 3', înainte de a utiliza NGmerge.

Fișierul de ieșire primar în modul cusătură este fișierul de citiri îmbinate, în format FASTQ. Este posibil să scrieți în stdout cu -o - (vezi și -y , mai jos).

Când sunt specificate, toate citirile care nu au reușit procedura de îmbinare vor fi scrise în fișierele de ieșire, așa cum au apărut în intrările originale.

În mod implicit, toate fișierele de ieșire FASTQ vor fi comprimate prin gzip dacă și numai dacă fișierele de intrare sunt (cu mai multe seturi de fișiere de intrare, ieșirile vor fi comprimate dacă oricare dintre primul set de intrări este). Specificarea -z va garanta că ieșirile sunt comprimate cu gzip, în timp ce -y va garanta că nu sunt, indiferent de formatele intrărilor. Rețineți că toate ieșirile comprimate cu gzip vor avea automat „.gz” atașat la numele fișierelor, dacă este necesar.

În modul cusătură, acest lucru se aplică numai la ieșirea opțională de la -f (mai sus). În loc de două ieșiri, va fi produsă o singură ieșire intercalată (și niciun sufix „.fastq” nu va fi adăugat la numele fișierului).

Acest fișier jurnal listează următoarele pentru fiecare pereche de citire din fișierele de intrare:

Citit citiți antetul, fără @
OverlapLen lungimea totală a suprapunerii citirii, inclusiv Ns NA dacă citirile nu au fost îmbinate (și coloanele rămase sunt lăsate necompletate)
StitchedLen lungimea totală a citirii îmbinate
Nepotrivire fracțiunea de baze nepotrivite (numărul de nepotriviri împărțit la lungimea suprapunerii [fără a include Ns]) trebuie să fie mai mică sau egală cu valoarea -p (vezi mai jos)

Acest fișier jurnal listează următoarele pentru fiecare pereche de citire a cărei aliniere optimă validă are supraîncărcări de 3':

Citit citiți antetul, fără @
Adaptor_R1 3' proeminentă a R1 citire - dacă nu există proeminență
Adaptor_R2 3' depășire a R2 citire - dacă nu există

Coloanele sunt etichetate „Adaptor” deoarece, dacă citirile nu au fost tăiate la capetele lor de 5”, aceste secvențe suplimentare ar trebui să fie adaptoare. Dacă secvențele care apar în coloanele „Adaptor” nu sunt consecvente, ele pot fi fals pozitive și ar trebui să ia în considerare scăderea -p sau creșterea -e .

Pentru fiecare pereche de citiri care a fost îmbinată cu succes, acest fișier jurnal listează alinierea secvențelor citirilor și scorurile de calitate, împreună cu secvența îmbinată și scorurile de calitate rezultate. De exemplu:

Aceasta este lungimea minimă de suprapunere (în bp) pentru aliniamente valide ale unei perechi de citiri (vezi Fig. 2A). Rețineți că bazele ambigue (Ns) nu contează pentru această lungime minimă.

Acest parametru determină cât de riguroasă este evaluarea unui aliniament. Valoarea trebuie să fie în intervalul [0, 1), cu valori mai mici echivalând cu stringență crescută. Specificarea -p 0 înseamnă că numai aliniamentele perfecte (fără nepotriviri) sunt valide, valoarea implicită de 0,10 înseamnă că o aliniere validă poate avea cel mult 10% nepotriviri (calculat ca numărul de nepotriviri împărțit la lungimea suprapunerii [fără numărarea Ns] ).

Când această opțiune este selectată, aliniamentele în care capătul 3' al unei citiri se extinde dincolo de capătul 5' al perechii sale vor fi evaluate, până la o lungime minimă (vezi Fig. 2B). În mod implicit, astfel de aliniamente nici măcar nu sunt luate în considerare. Deoarece citirea îmbinată este definită de capetele de 5' ale citirilor originale, proeminențele de 3' sunt eliminate automat. Aceste suprapuneri, care sunt de obicei adaptoare, pot fi tipărite într-un fișier jurnal separat (vezi -c , mai sus).

Aceasta este lungimea minimă de suprapunere (în bp) pentru aliniamentele cu protuberanțe de 3' (vezi Fig. 2B). Această valoare ar trebui să fie setată la lungimea celui mai scurt fragment de ADN care ar fi putut fi secvențiat. Utilizarea unei valori prea scăzute poate duce la fals pozitive, mai ales dacă citirile conțin secvențe repetitive.

Având în vedere mai multe alinieri valide cu scoruri identice de nepotrivire a fracțiunilor, NGmerge va selecta în mod implicit cea mai lungă lectură cusută. Cu -s , va fi preferată cea mai scurtă cusătură.

Opțiuni de profil pentru scorul de calitate

În mod implicit, NGmerge utilizează profiluri hard-codate atunci când determină scorurile de calitate ale bazelor suprapuse. Există profiluri separate pentru cazurile în care baza R1 și baza R2 se potrivesc și pentru când nu se potrivesc. Cei care nu doresc să folosească aceste profiluri au două opțiuni alternative:

Cu această opțiune, NGmerge va folosi profilurile de scor de calitate din fișierul furnizat. Fișierul trebuie să enumere două matrice de valori separate prin virgulă sau prin tabulatori care urmează liniile de antet #match și #mismatch . Ar trebui să urmați șablonul fișierului qual_profile.txt dat, care imită profilele hard-coded ale NGmerge cu intervalul de scor de calitate [0, 40].

Cu această opțiune, NGmerge va folosi o metodă similară cu cea a programului fastq-join. În cazurile în care baza R1 și baza R2 se potrivesc, scorul de calitate mai mare este utilizat pentru baza îmbinată. Când nu se potrivesc, scorul de calitate al bazei îmbinate este calculat ca diferență între cele două scoruri de calitate.

Această opțiune trebuie sa să fie specificat pentru ca NGmerge să ruleze în modul de eliminare a adaptorului. După cum este indicat, setează automat opțiunea -d pentru a verifica aliniamentele în coadă de rândunică.

Formatarea fișierelor de intrare este descrisă mai sus.

În modul de îndepărtare a adaptorului, toate citirile sunt tipărite în fișierele de ieșire. Singurele modificări sunt tăierea proeminențelor de 3’ ale citirilor ale căror aliniamente au astfel de proeminențe.

Cu această opțiune, în loc de două ieșiri, va fi produsă o singură ieșire intercalată (și niciun sufix „.fastq” nu va fi atașat la numele fișierului).

Aceste opțiuni sunt descrise mai sus.

Acest fișier jurnal este descris mai sus.

În modul de îndepărtare a adaptorului, următoarele fișiere nu poti fi produs:

Acești parametri sunt descriși mai sus.

După cum sa menționat anterior, opțiunea -d este setată automat în modul de eliminare a adaptorului.

Pentru a reduce timpul de calcul, se poate rula NGmerge pe mai multe nuclee prin această opțiune. Rețineți că compresia și decompresia gzip nu sunt paralelizate, astfel încât economiile de calcul nu sunt liniare.

Acești doi parametri stabilesc intervalul de scoruri de calitate pentru fișierele FASTQ de intrare. Valorile implicite se potrivesc cu formatul Sanger, cu scoruri de calitate în intervalul [0, 40] care acoperă valorile ASCII [33, 73].

În loc să imprime aliniamente complete, fișierul jurnal specificat de -j va lista detaliile nepotrivirilor: antetul citit, poziția și scorul de bază și de calitate pentru citirile R1 și R2. Acest lucru este util pentru calcularea ratelor de eroare separate pentru potriviri și nepotriviri.

  • NGmerge nu poate comprima prin gzip mai multe fișiere de ieșire care sunt stdout . De exemplu, următoarele vor produce o eroare:
    • -o - -a fără -i
    • -f - fără -a și fără -i


    Cum să sortați fișierele fastq pentru a alinia citirile finale asociate folosind BWA.

    Încerc să aliniez citirile de sfârșit pereche folosind BWA, dar din moment ce fișierele fastq nu sunt sortate, se plâng că „citurile pereche au nume diferite”. Astfel: "M01628:49:000000000-D06TG:1:1102:25364:18377", "M01628:49:000000000-D06TG:1:1101:16377:1698"

    Există un instrument convenabil pentru sortare sau trebuie să creez un script pentru a face acest lucru?

    Un exemplu de citire arată astfel:

    Da, m-am uitat deja la cele mai bune rezultate ale căutării înainte de a posta întrebarea. Din păcate, nu a sortat corect și de aceea mă întrebam dacă există un instrument sau o metodă alternativă pentru asta.

    Citirile dvs. sunt în fișiere fastq intercalate sau divizate? Dacă citirile sunt intercalate, există câteva răspunsuri pe Google care vă vor deintercala fișierele pentru dvs. Dacă citirile sunt deja împărțite într-un fișier mate1 și mate2, atunci cu puțin Python sau Perl puteți sorta cu ușurință fișierele corect cu acces la suficient ram. Probabil că nu este cea mai eficientă metodă, dar dacă îți dorești ceva pe care să-l scrii foarte repede și să-l folosești doar pentru a obține rezultatele, aceasta va face șmecheria.

    Creați o listă de citiri folosind BioPython SeqRecords

    Sortați listele după id-urile de citire 3a) Repetați ambele liste, trăgând câte 1 citire din fiecare listă. 3b) Comparați ID-urile de citire (nu uitați /1 și /2 sau identificatorul unic pentru citirile mate1 și mate2) 3c) Dacă se găsește o potrivire, scrieți citirea mate1 în fișierul dvs. mate1 sortat și mate2 citit la fișierul dvs. mate2 sortat. (Mai bine să aveți liste mate1_paired și mate2_paired pe care le utilizați ca buffere. Apoi scrieți în fișierul dvs. de fiecare dată când obțineți 10k sau 50k citiri în bufferele pe care le veți goli după ce ați scris și începeți să le completați din nou. Reveniți la pasul 3a. 3d) Dacă nu se găsește nicio potrivire, luați id-ul de citire inferior și adăugați-l în buffer-ul de citire singleton pentru a scrie în fișierul de citire singleton. 3e) Trageți o nouă citire din lista de citire din care provine citirea singleton și repetați pașii 3b-3e până când se găsește o potrivire

    Când ați terminat, veți avea fișiere mate1_sorted.fq și mate2_sorted.fq care ar trebui acum să fie perfect ordonate între ele. Veți avea, de asemenea, un fișier singleton.fq care conține citiri care și-au pierdut perechea la un moment dat între secvențiere și pasul de mapare.

    Acestea fiind spuse, nu utilizați BWA pentru cartografierea citirilor decât dacă nu aveți altă opțiune. Dezvoltatorul este bine cunoscut pentru munca sa de cartografiere cu citire scurtă, programul în sine nu vă oferă niciodată ceea ce doriți cu adevărat. Analizarea datelor BWA este unul dintre cele mai obositoare lucruri pe care le-am avut de făcut cu datele NGS. Vă recomand cu căldură să îl utilizați numai dacă instrumentele pe care le utilizați sunt deja configurate pentru a funcționa direct cu ieșirea BWA. În caz contrar, căutați în BBMAP pentru nevoile dvs. de cartografiere de citire scurtă. Te vei îndrăgosti de flexibilitatea opțiunilor și formatelor de intrare și ieșire. Statisticile pe care îi puteți cere să le genereze ca parte a cursei sunt incredibile și face ceea ce doriți.


    Trimomatic

    Trimmomatic este un instrument popular pentru tăierea secvențelor de adaptoare din citirile Illumina. Manualul Trimmomatic descrie cum să instalați această aplicație, cum să o rulați și descrie toți parametrii necesari și opționali ai liniei de comandă. Dacă decideți să utilizați Trimmomatic pentru tăierea secvențelor adaptorului din citirile Illumina, o comandă minimă care efectuează doar tăierea adaptorului poate arăta astfel:

    • Majoritatea executărilor de secvențiere folosesc citiri cu sfârșit pereche, așa că specificăm “PE” în linia de comandă.
    • Pentru a accelera aplicația, specificăm numărul de fire de execuție de utilizat, până la numărul maxim de fire de execuție disponibile pentru procesor.
    • Există întotdeauna două fișiere FASTQ într-o execuție asociată: un fișier pentru citirile înainte și un fișier pentru citirile inverse. Specificăm ambele fișiere în lista de parametri.
    • Pentru fiecare fișier citit, specificăm numele unui fișier de ieșire asociat și al unui fișier de ieșire neîmperecheat.
    • Secvența(ele) adaptorului este/sunt conținut(e) într-un fișier formatat FASTA. Parametrul ILLUMINACLIP specifică numele acestui fișier. Acest parametru necesită, de asemenea, trei câmpuri suplimentare: seedMismatches, palindromClipThreshold, simpleClipThreshold. Consultați manualul pentru mai multe informații despre cum să setați aceste trei câmpuri.

    În exemplul nostru, folosind kitul de pregătire a bibliotecii Nextera XT, fișierul “adapters.fasta” ar arăta astfel:

    Acesta este un fișier formatat standard FASTA. Prima înregistrare conține caracterul cu caretul drept urmat de un șir arbitrar. A doua înregistrare conține secvența adaptorului. Acest fișier poate conține mai multe secvențe adaptoare utilizând un format de fișier multi-FASTA. Fișierele de ieșire Trimmomatic vor arăta care citiri (dacă există) au fost tăiate.


    Este nevoie doar de două modificări minore pentru a rula fastq-mcf pe date împerecheate, trebuie să îi spunem să încarce și fișierul read 2 și, de asemenea, ce să numească rezultatul tăiat din acest fișier.

    1. neb_adapters.fasta
    2. r1.8A_pilot.fq.gz
    3. r2.8A_pilot.fq.gz : NOU pentru datele asociate
    4. -q 20
    5. -x 0,5
    6. -o r1.8A_pilot.trim.fastq.gz
    7. -o r2.8A_pilot.trim.fastq.gz : NOU pentru datele asociate

    Notă: Acum că, deoarece includem acum citirile inverse, acum se observă contaminarea cu adaptorul universal


    Darencard / extract_fastq_bam.md

    Uneori, datele FASTQ sunt aliniate la o referință și stocate ca fișier BAM, în loc de fișierele normale de citit FASTQ. Acest lucru este în regulă, deoarece este posibil să recreați fișiere brute FASTQ pe baza fișierului BAM. Următoarele subliniază acest proces. Ambele sunt necesare software-ul util samtools și bedtools.

    Din fiecare bam, trebuie să extragem:

    1. citește care a fost mapat corect ca perechi
    2. citiri care nu s-au mapat corect ca perechi (ambele nu s-au mapat sau una nu s-a mapat)

    Pentru #1, următoarea comandă va funcționa. Acesta a fost preluat de pe această pagină web.

    Filtrul -f și -F utilizând steaguri din coloana 2 a fișierului BAM. Acestea nu sunt întotdeauna intuitive și nu le voi descrie mai mult aici, dar puteți folosi acest instrument la îndemână pentru a înțelege mai bine. De asemenea, rețineți că marcajul -u creează o ieșire BAM necomprimată, mai degrabă decât o ieșire BAM comprimată implicită, astfel încât fișierele vor fi mai mari. Acest lucru ajută la citirea mai rapidă în pașii următori, dar nu este necesar să includeți acest lucru dacă doriți să economisiți spațiu pe disc. samtools este super rapid în orice caz.

    Rezolvarea nr. 2 este mai complicată, deoarece există trei moduri în care o citire ar putea să nu fi mapat ca o pereche adecvată. A. Prima citire a fost mapată, dar citirea pereche nu a făcut-o. B. Prima citire nu s-a mapat, dar lectura pereche a făcut-o. C. Nicio citire pereche nu a fost mapată deloc. Din nou, steaguri vor fi folosite pentru a filtra fișierul BAM original. Aceste informații au fost găsite pe această pagină web.

    După cum v-ați putea aștepta, trebuie să îmbinați apoi cele trei fișiere care conțin cel puțin o pereche nemapată.

    Apoi, aceste fișiere BAM trebuie apelate astfel încât să fie ordonate după ID de citire în loc de locație în referință.

    În acest moment, este o idee bună să verificați dacă aveți numărul corect de citiri și nu există redundanță. Puteți rezuma fișierul BAM original pentru a vă face o idee despre unde ați început.

    Observați numărul total de citiri de intrare care se găsesc pe prima linie. Vrei să fii sigur că numărul de citiri nemapate și mapate totalizează acest număr. Este ușor de verificat folosind următoarele comenzi.

    Note that one paired read is counted as two reads here. If you sum these two numbers, they should equal the number you noted above, as they do here.

    If all is good, you can now extract the FASTQ reads into two paired read files, as follows.

    And then it also makes sense to combine both the first and paired reads together from the mapped and unmapped files.

    These two files should now have the same number of reads that are exactly as you would have received them if they had come directly from the sequencer as FASTQ.

    Please also note that all of the commands above can be piped together in bash using | , which will save on disk space and time. So it is best to combine commands where possible.


    NextSeq 500

    The NextSeq 500 is different from the other Illumina sequencers in two important ways that impact the FASTQ files it generates.

    The NextSeq 500 has 4 lanes. Each lane gets the same sample or pool, but they are imaged by different cameras. Therefore, the data is tagged with lane numbers 1 to 4. However, the data in each file is for the same sample and represents distinct set of fragments for the sample. We generally keep these files separate, but not always.

    The NextSeq 500 sequences the second read of a dual-indexed library in the reverse direction from the other sequencers. We reverse complement the second barcode in the file name, but not in the FASTQ deflines.

    So for example, a barcode pair TAAGGCGA and TAGATCGC would be sequenced as TAAGGCGA and GCGATCTA . The defline for a read would contain TAAGGCGA-GCGATCTA but we would rename the FASTQ file to TAAGGCGATAGATCGC .


    Priveste filmarea: DE CE NU MAI VORBESC CU DORIAN POPA.. (August 2022).