Informație

Formarea Dimerului - Fx Dimer - Biologie

Formarea Dimerului - Fx Dimer - Biologie


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Formarea Dimerului - Fx Dimer

Analiza cu o singură moleculă dezvăluie formarea de dimeri specifici agonistului a receptorilor p-opioizi

Receptorii cuplați cu proteinele G (GPCR) sunt proteine ​​de semnalizare cheie care funcționează în cea mai mare parte ca monomeri, dar pentru mai mulți receptori a fost descrisă formarea de dimeri constitutivi și, în unele cazuri, este esențială pentru funcționare. Folosind microscopia cu o singură moleculă combinată cu tehnici de super-rezoluție pe celule intacte, descriem aici un echilibru dinamic monomer-dimer al receptorilor µ-opioizi (µOR), în care formarea dimerilor este condusă de agonişti specifici. Agonistul DAMGO, dar nu morfina, induce formarea de dimeri într-un proces care se corelează atât temporal, cât și în dependența sa de agonist și fosforilare cu legarea p-arrestin2 la receptori. Această dimerizare este independentă de, dar poate preceda, internalizarea pOR. Aceste date sugerează un nou nivel de reglementare GPCR care leagă formarea dimerilor de agonişti specifici şi semnalele lor din aval.


INTRODUCERE

Cadherinele clasice sunt o familie de receptori transmembranari de adeziune care sunt responsabili pentru integritatea structurală și arhitectura specifică a tuturor țesuturilor solide la vertebrate. Defecțiunile sistemului de adeziune a cadherinei sunt adesea considerate ca un factor în invazia și metastaza celulelor tumorale (Takeichi, 1995 Provost și Rimm, 1999 Patel). et al., 2003 Gumbiner, 2005). Este larg acceptat că adeziunea celulă-celulă este produsă prin homodimerizarea moleculelor de caderină expuse pe celule opuse. Această interacțiune determină în mod evident mulți parametri critici ai adeziunii celulă-celulă, inclusiv rezistența, plasticitatea și stabilitatea acesteia. Deși s-a făcut o muncă extinsă pentru a caracteriza detaliile moleculare ale interacțiunilor de aderență a cadherinei, multe aspecte de bază ale acestui proces rămân necunoscute.

Principala întrebare la care încă nu s-a răspuns este rezistența legăturilor individuale de adeziune a cadherinei. Incertitudinea provine din două grupuri contradictorii de observații (revizuite în Troyanovsky, 2005 Mege et al., 2006). Pe de o parte, numeroase experimente biofizice cu fragmente de cadherină recombinată au arătat că durata de viață a unei astfel de legături este limitată la intervalul de milisecunde. Pe de altă parte, homodimerii de cadherină remarcabil de stabili cu o rată de disociere nedetectabilă au fost demonstrati în celulele cultivate prin experimente de coimunoprecipitare. În consecință, există două modele în principal diferite de aderență a cadherinei. Un model de aderență a caderinei cu afinitate scăzută sugerează că puterea unui contact adeziv celulă-celulă este mediată de gruparea receptorilor de caderine prin interacțiuni citoplasmatice (Yap et al., 1998 Kusumi et al., 1999). Conform acestui model, gruparea legăturilor adezive de scurtă durată asigură stabilitatea esențială pentru întreaga joncțiune. Cu toate acestea, se cunosc puține detalii despre detaliile moleculare ale grupării cadherinei. Mai mult, unele date contrazic în mod clar ipoteza „clustering-stability”. De exemplu, în unele experimente, mutanții E-cadherinei lipsiți în totalitate de regiunea intracelulară (și astfel deconectați de la mașina ipotetică de grupare intracelulară) au furnizat o forță adezivă suficientă pentru a agrega celulele în testul de agregare (Ozawa și Kemler, 1998). Astfel de date susțin circumstanțial un model alternativ, de mare afinitate, de aderență a cadherinei. Prin acest model, aderența celulă-celulă se bazează pe formarea continuă a dimerilor adezivi cadherinei de mare afinitate, care se disociază sub un control celular strict (Troyanovsky). et al., 2006). Cel mai obscur aspect al ultimului model este mecanismul de dimerizare a cadherinei de mare afinitate: de ce acest proces nu a fost niciodată detectat in vitro? De asemenea, nu este clar de ce, dacă aderența se bazează pe dimeri stabili, recrutarea cadherinei în joncțiuni depinde de interacțiunile intracelulare cadherină-catenină?

Obiectivul principal al acestei lucrări a fost acela de a clarifica aceste două întrebări, foarte critice pentru modelul de mare afinitate al aderenței cadherinei. Am întrebat mai întâi dacă dimeri stabili de cadherină identici cu cei detectați în celule ar putea fi asamblați in vitro. Pentru a răspunde la această întrebare, am studiat dimerizarea cadherinei pe suprafața granulelor de agaroză folosind un test de reticulare specifică site-ului. În total acord cu experimentele in vitro publicate, am arătat că, în condiții fiziologice, cadherina a format homodimeri instabili care s-au disociat imediat după epuizarea ionilor de calciu. Cu toate acestea, în condiții destabilizatoare (cum ar fi la pH 5, în prezența ionilor de cadmiu sau la temperatură ridicată) E-cadherina a produs dimeri stabili. După toți parametrii acești dimeri nu se distingeau de cei detectați în celulele vii. Aceste experimente au arătat în mod clar că în celulele vii se formează dimeri stabili ca rezultat al unei reacții specifice. Această reacție poate fi unul dintre pașii de reglementare importanți ai aderenței pe bază de cadherină.

Apoi am studiat un mutant de cadherină fără coadă Ec1Δ(748-882)M. Acest mutant, care nu este capabil să interacționeze cu niciun partener intracelular de caderină cunoscut, nici nu este recrutat în joncțiunile intercelulare și nici nu formează dimeri adezivi (Chitaev și Troyanovsky, 1998). Conform modelului de afinitate scăzută al aderenței cadherinei, un astfel de fenotip se bazează pe deconectarea acestui mutant de la mașina de grupare intracelulară. Cu toate acestea, acum am descoperit că inactivarea endocitozei clatrinei de către mai multe ARN-uri mici interferențe (siRNA-uri) a restabilit complet recrutarea acestui mutant în joncțiunile celulă-celulă. În plus, chiar și o depolimerizare completă a filamentelor de actină de către latrunculină A nu a împiedicat gruparea acestui mutant. Aceste observații au arătat că recrutarea cadherinei în joncțiuni se poate baza numai pe interacțiuni extracelulare. Luat împreună, studiul nostru prezintă dovezi noi, critice, care susțin modelul de mare afinitate al aderenței cadherinei.


Abstract

In vivo imagistica moleculară cu sonde „inteligente” activabile specifice țintei, care produc fluorescență numai la ținta dorită, permite detectarea sensibilă și specifică a cancerului. S-a demonstrat că dimerizarea și stingerea fluorescenței apar în soluții apoase concentrate de diverși fluorofori. Aici, am emis ipoteza că dimerizarea și stingerea fluoroforului după conjugarea cu proteinele țintite pot avea loc la concentrație scăzută. Această dimerizare poate fi exploatată ca un mecanism de activare a fluorescenței. Derivații de rodamină au fost conjugați cu avidină și trastuzumab, care vizează receptorul d-galactoză și respectiv antigenul HER2/neu. După conjugare, o proporție mare de R6G și TAMRA au format dimeri de tip H, chiar și la concentrații scăzute, dar au putut fi complet destinși la disociarea dimerilor la monomeri. Pentru a demonstra efectul de activare a fluorescenței în timpul in vivo Imagistica moleculară endoscopică cu fluorescență, o sondă foarte stinsă, avidin-TAMRA sau o sondă minim stinsă, avidin-Alexa488, a fost administrată la șoareci cu metastaze ovariene în peritoneu. Tumorile au fost vizualizate clar cu avidin-TAMRA, cu fluorescență de fond scăzută, în contrast, fluorescența de fond a fost ridicată pentru avidina-Alexa488. Astfel, formarea de H-dimer ca mecanism de stingere a fluorescenței ar putea fi utilizată pentru a dezvolta sonde activabile prin fluorescență pentru in vivo imagistica moleculara.


Rezultate

Formarea dimerului cromozomului în V. holerae

Creșterea de V. holerae tulpinile deficitare în CDR au fost comparate direct cu creșterea tulpinii lor parentale în experimente de competiție în medii bogate (Figura 2). Aceste experimente au evidențiat un defect de 5,8% și 3% per celulă pe generație pentru Δdif1 și Δdif2 celule, respectiv, în comparație cu omologii lor de tip sălbatic. Deoarece aceste defecte de creștere au fost complet suprimate în a recUn fundal (Figura 2), ele reflectă direct ratele de formare a dimerilor pe cromozomul I și II, fdimer Chr1 și fdimer Chr2 (vezi Material și Metode). Defectul de creștere de 8,6% al xerCelulele C Vc, care a fost de asemenea suprimată în a recUn fundal, reflectă rata totală de formare a dimerului cromozomal în V. holerae, fdimer Chr1+2 (Figura 2). Interesant, fdimer Chr1+2 este egal cu 1−(1−fdimer Chr1 )(1−fdimer Chr2), indicând că formarea de dimeri pe cei doi V. holerae cromozomii este independent.


REZULTATE

FOXA1 formează un homodimer foarte cooperant pe un element ADN compact

Prin notarea pentru îmbogățirea matricelor de greutate de poziție concomitente în regiunile hipersensibile la DNază (HS) specifice tipului celular din 78 de linii celulare umane, am identificat anterior configurații candidate de dimer TF care ar putea contribui la funcțiile lor specifice tipului celular ( 28, 29). Două motive palindromice FOXA1 au constituit cele mai bune rezultate ale acestei analize. În primul rând, a fost găsit un motiv compozit compact numit motiv DIV (D0) „divergent” în cazul în care miezul bogat în AT al cap de furcă motivul (TA TTT) se suprapun astfel încât dinucleotida TA centrală este împărtășită de jumătăți-situri juxtapuse (AAA TA TTT). Am identificat, de asemenea, un motiv compozit mai puțin compact cu cap de furcă motive aranjate în direcții alternative pe care le-am numit „convergent” sau motiv CON (C0) (Figura 1A). Am fost interesați de ambele motive pentru îmbogățirea lor puternică în linia de celule de cancer de sân MCF7 și linia de celule de cancer de prostată LNCaP.

Pentru a testa dacă FOXA1 homodimerizează pe aceste secvențe, am stabilit teste cantitative de schimbare a mobilității electroforetice (EMSA) folosind domeniul de legare la ADN purificat (DBD) al FOXA1 (denumit în continuare FOXA1). În absența ADN-ului, FOXA1 nu se dimerizează, ci formează un monomer monodispers, după cum se apreciază din cromatogramele calibrate de excludere a mărimii (Figura suplimentară S1D). Am efectuat mai întâi EMSA cu o sondă ADN de 1 nM care codifică elementul monomer FOXA1 și o serie de concentrații de FOXA și am măsurat o medie Kd_monomer de 2,4 ± 1,06 nM (n = 3, Figura 1B). Titrari similare în prezența ADN-ului DIV au arătat că benzile dimerice FOXA1 încep să se formeze la cele mai scăzute concentrații de FOXA1 (0,61 nM), indicând o dimerizare cu cooperare puternic pozitivă (Figura 1C). O aparentă afinitate de legare Kd_app pentru legarea FOXA1 la ADN-ul DIV a fost determinată a fi 4,5 ± 1,6 nM prin luarea în considerare a stărilor monomerice și dimerice ca o fracțiune globală de ADN legată. Pentru a cuantifica eficiența FOXA1 de homodimerizare, am estimat apoi factorul de cooperare (ω) în condiții de echilibru la o concentrație de ADN de 100 nM. Aceste măsurători oferă rapoarte ale constantelor de legare la echilibru (ω = Kd_monomer/Kd_dimer). Aici, Kd_dimer reprezintă constanta de disociere pentru legarea unei a doua molecule FOXA1 la un complex FOXA1/ADN pre-format. Astfel, factorii de cooperare indică modul în care două molecule TF își influențează ocuparea reciprocă pe un anumit element ADN cu situsuri de legare compozite (34, 38). Dacă ω > 1, TF-urile se leagă cu cooperativitate pozitivă dacă ω<1, TF-urile se leagă cu cooperativitate negativă sau, cu alte cuvinte, concurează și dacă ω = 1 legarea este independentă sau necooperativă ( 49). Folosind aceste teste, am comparat legarea lui FOXA1 la co-motive îmbogățite în regiuni DNază-HS (motive D0/DIV și C0/CON) cu elemente de control în care distanța dintre semi-siti-uri a fost modificată (D2, C1 și C-1). ). FOXA1 leagă ADN-ul DIV cu o cooperare foarte pozitivă (ω = 56,3 ± 11,9 Figura 1D-F, Figura suplimentară S1E, Tabelul suplimentar S1). Pentru ADN-ul C0 a fost măsurat un factor de cooperare profund mai scăzut (ω = 1,8 ± 1,3). Dacă distanța dintre semi-situs este perturbată, dimerizarea este împiedicată pentru ambele configurații ale elementelor ADN. Pentru a diseca în continuare dependența legării cooperative pe distanțarea pe jumătate de site, am inserat distanțiere de la 1 la 10 bp între jumătățile de situsuri ale DIV (Figura 1E și F, Figura suplimentară S1F, Tabelul suplimentar S1). Acest experiment a dezvăluit că dimerizarea cooperativă a FOXA1 pe ADN depinde strict de distanțarea compactă a semi-situtului. Adăugarea de distanțieri care separă motivele de bază FOXA1 a scăzut ω cu cel puțin un ordin de mărime și, în cazul configurației D3, a șters complet formarea de complexe dimerice. In timp ce cap de furcă DBD este suficient pentru dimerizarea cooperantă, acest mod de legare este reținut și în contextul proteinei FoxA1 de șoarece de lungime completă purificată recombinant (Figura suplimentară S1G).

Modelarea structurală sugerează mecanisme alternative pentru formarea dimerului

Pentru a înțelege baza dimerizării FOXA1 pe ADN-ul DIV, am construit o serie de modele de dimeri FOXA1 DBD. În primul rând, am folosit o structură de cristal FOXA3 DBD-ADN publicată (PDB ID 1VTN (22)) pentru a produce modele de omologie FOXA1. FOXA3 DBD se întinde pe aproximativ 25% din proteina de lungime completă și diferă cu cinci aminoacizi de FOXA1 DBD. În continuare, modelele de dimeri au fost generate prin suprapunerea a două modele binare FOXA1/ADN pe șabloane B-ADN ideale care conțin secvențe DIV (Figura suplimentară S1A-C). Pentru a menține curbura experimentală a ADN-ului, am concatenat fragmente de ADN experimentale, urmate de îndepărtarea șablonului B-ADN. În cele din urmă, modelele complexe au fost reduse la minimum energetic, permițând ajustări structurale atât ale proteinei, cât și ale componentelor ADN, conducând la modele cu ADN curbat. În special, elementul ADN al modelului 1VTN (CGTTG) diferă în mai multe poziții cheie de cap de furcă consens (TATTT) (Figura suplimentară S1B). Prin urmare, curbura ADN-ului unui complex binar cu FOXA1 poate să nu fie reprezentată corect în modelele disponibile în prezent. În plus, modificările structurale profunde ale ADN-ului ar putea însoți asamblarea complexelor dimerice.

O caracteristică conservată în cap de furcă Complexele DBD/ADN sunt un hidrogen bidentat legat de Asn165 cu Adenina A’4 (5′-T1A2T3T4T5-3′/3′-A’1T’2A'3A'4A'5-5′) (Figura suplimentară S1A). Am efectuat mai întâi suprapuneri care mențin interacțiunea Asn165 cu A’4 în modelele complexe finale. În aceste modele nu am putut observa interacțiuni intermoleculare proteină-proteină între moleculele FOXA1 juxtapuse, sugerând că formarea dimerului ar putea fi facilitată alosteric prin ADN (Figura 2A). Cu toate acestea, deoarece DIV este bogat în AT, am presupus că, în contextul unui complex dimeric, Asn165 ar putea fi indus să schimbe adeninele și să se lege de A'3 sau A’5 in schimb. Pentru a testa această posibilitate, am construit nouă modele alternative cu toate combinațiile posibile de Asn165 cu Adenine 3-5 în fiecare jumătate de locație (Figura suplimentară S1A, B). Din cele nouă modele, trei sunt simetrice, adică Asn165 leagă aceeași adenină în oricare dintre cele două jumătăți (Figura 2A-C). Din cele trei modele simetrice pentru homodimer FOXA1, modelul D0-M4 (unde Asn165 leagă A’5) prezintă o interfață de contact extinsă hidrofobă proteină-proteină formată predominant de Val229 și Ala232 (Figura 2B și Figura suplimentară S1C). De asemenea, am generat modele de structură pentru toate configurațiile de motive de control DIV cu lungimi de distanță 1-10 (Figura suplimentară S2A, B). În acest set de modele, au fost observate ciocniri severe pentru configurația D3 (Figura suplimentară S2B) în concordanță cu absența oricărei benzi de dimer în EMSA (Figura 1E). Configurațiile rămase au arătat ciocniri structurale moderate, care ar putea fi eventual atenuate prin ajustări conformaționale ale proteinei și modificarea formei ADN-ului (Figura suplimentară S2A).

Model structural al complexelor dimerice FOXA1/ADN. Modelele structurale au fost construite folosind modele de omologie FOXA1 generate folosind structurile cristaline FOXA3/ADN (PDB ID 1VTN) ca șablon. Strategia de modelare este prezentată în figura suplimentară S1A–C. Interacțiunea Asn165 cu o adenină este un mediator critic al recunoașterii ADN-ului cap de furcă DBD-uri. Pe baza alinierii cu binar cap de furcă Structurile DBD/ADN Asn165 este de așteptat să interacționeze cu A4’ în ambele 5′-T1A2T3T4T5-3′/3′-A’1T’2A'3A'4A'5-5′ DIV jumătăți site-uri (A, D0_M1). Am presupus că, în contextul unui complex homodimeric, Asn165 ar putea schimba adeninele, conducând la modele alternative în care Asn165 contactează A5’ (B, model D0_M4) sau A3’ (C, model D0_M7). Panourile din stânga arată imagini de ansamblu, iar panourile din dreapta sunt mărite în vizualizări evidențiind aminoacizii V229 și A232 expuși la molecula vecină care ar putea media formarea dimerului. ADN-ul este prezentat sub formă de tub gri, elice proteice, foi sau bucle sunt în desene animate roșu, albastru și, respectiv, galben. Suprafața moleculară este prezentată în verde transparent. Aminoacizii selectați sunt etichetați și afișați ca bile și bastoane. Secvența de ADN folosită pentru a construi modelele este prezentată și nucleotidele (sau complementul lor invers) contactate de Asn165 sunt în roșu.

Model structural al complexelor dimerice FOXA1/ADN. Modelele structurale au fost construite folosind modele de omologie FOXA1 generate folosind structurile cristaline FOXA3/ADN (PDB ID 1VTN) ca șablon. Strategia de modelare este prezentată în figura suplimentară S1A–C. Interacțiunea Asn165 cu o adenină este un mediator critic al recunoașterii ADN-ului cap de furcă DBD-uri. Pe baza alinierii cu binar cap de furcă Structurile DBD/ADN Asn165 este de așteptat să interacționeze cu A4’ în ambele 5′-T1A2T3T4T5-3′/3′-A’1T’2A'3A'4A'5-5′ DIV jumătate site-uri (A, D0_M1). Am presupus că, în contextul unui complex homodimeric, Asn165 ar putea schimba adeninele, conducând la modele alternative în care Asn165 contactează A5’ (B, model D0_M4) sau A3’ (C, model D0_M7). Panourile din stânga arată imagini de ansamblu, iar panourile din dreapta sunt mărite în vizualizări evidențiind aminoacizii V229 și A232 expuși la molecula vecină care ar putea media formarea dimerului. ADN-ul este prezentat sub formă de tub gri, elice proteice, foi sau bucle sunt în desene animate roșu, albastru și, respectiv, galben. Suprafața moleculară este prezentată în verde transparent. Aminoacizii selectați sunt etichetați și afișați ca bile și bastoane. Secvența de ADN folosită pentru a construi modelele este prezentată și nucleotidele (sau complementul lor invers) contactate de Asn165 sunt în roșu.

Modelul D0-M4 (Figura 2B) pare similar cu modelul D2 non-cooperant care a fost generat prin separarea semi-siturilor FOXA1, altfel suprapuse, ale DIV (Figura suplimentară S2A). Cu toate acestea, o suprapunere între cele 2 modele dezvăluie că foile beta ale monomerilor FOXA1 sunt mai apropiate unele de altele în modelul D2, ceea ce poate duce la o interfață de interacțiune suboptimă.Mai mult, secvența ADN diferă între cele două modele, ceea ce duce la forme alternative de ADN care pot provoca modificări ale interfeței de interacțiune proteină-proteină prezise (Figura suplimentară S2A). Astfel, modelul D0_M4 nu poate fi invalidat din cauza lipsei de cooperare pozitivă asupra elementului D2 (Figura 1D–F). Propunem că D0_M1, D0_M4 și D0_M7 reprezintă toate modele inițiale potențial valide pentru dimerizarea FOXA1 pe motivul DIV pe baza datelor disponibile în prezent. În special, doar modelul D0_M1 are citirea directă a secvenței ADN similară cu cea observată pentru secvența consens. Este necesară validarea ulterioară a modelelor cu experimente și simulare a dinamicii moleculare.

În special, s-a raportat că o mutație Ala232Val conduce la cancerul de prostată ( 50 ). Am decis să testăm dacă mutațiile la reziduul Ala232 influențează dimerizarea cooperativă asupra ADN-ului. Cu toate acestea, mutațiile asociate cu cancerul de prostată și alte 10 substituții influențează doar ușor cooperarea asupra secvenței DIV (schimbarea de <1,5 ori la ω, Figura suplimentară S2C). Ca un test mai riguros, am construit și mutanți dubli în care ambele reziduuri presupuse de interfață Val229 și Ala232 au fost mutate simultan la glutamați acizi (Val229Glu/Ala232Glu și Val229Arg/Ala232Arg). EMSA-urile au arătat că mutația dublă Val229Arg/Ala232Arg nu influențează legarea ADN-ului (Figura suplimentară S2D). Cu toate acestea, în mod surprinzător, mutațiile duble Val229Glu/Ala232Glu conduc la o creștere marcată a cooperativității, deși afinitatea pentru legarea monomerică este redusă.

În absența structurilor experimentale ale unui complex ternar FOXA1/DIV, curbura ADN-ului legat, interfața de contact proteină-ADN și baza structurală pentru dimerizare rămâne ipotetică. Mecanismul pentru formarea dimerului cooperant s-ar putea datora a două mecanisme de bază. În primul rând, interacțiunile direct proteină-proteină care ar necesita ajustări structurale majore și inclusiv comutarea interfeței de contact sau deformarea ADN-ului. În al doilea rând, mecanismul alosteric mediat de ADN ar putea facilita recunoașterea cooperantă a ADN-ului de către FOXA1. Astfel de mecanisme au fost descrise pentru un număr tot mai mare de perechi de dimeri TF și par a fi o temă comună în biologia TF (51-53).

FOXA1 se leagă puternic de loci DIV din celulele canceroase umane

FOXA1 este un regulator principal al celulelor endodermice și al tipurilor de țesut, dar este asociat și cu tumorigeneză în mai multe tipuri de cancer, inclusiv cancerul de sân, prostată și ficat (( 9), revizuit în ( 8)). În consecință, expresia FOXA1 este cea mai mare în epiteliul normal al ficatului și intestinului, precum și în liniile celulare de cancer de sân, prostată, gastrointestinal și hepatic dintr-un panou de 562 de probe analizate de consorțiul FANTOM5 (54) (Figura 3A). Pentru a studia relevanța DIV pentru a defini profilurile de legare genomică ale FOXA1, am definit apoi patru categorii de locații de legare în seturi de date ChIP-seq disponibile public (Figura 3B). Categoria „D” conține site-uri cu potriviri cu PWM-urile DIV în regiunea de vârf (1.1e + 5 cazuri în genomul uman hg38, „D”). Categoria „C” sunt site-uri dimer de control care au potriviri cu motivele în care configurația de promovare a dimerului este perturbată prin introducerea a 1-10 distanțiere (D1-D10, 5.1e + 5 loci în hg38, Figura suplimentară S3A). Categoria „C” controlează preferința pentru o anumită configurație, dar menține numărul de jumătăți de site-uri similare cu locațiile DIV. Apoi, am definit locații în care FOXA1 se leagă exclusiv ca monomer („M”). În cele din urmă, locațiile rămase sunt desemnate „N” pentru „fără motiv” pentru lipsa potrivirilor evidente cu oricare dintre cele trei tipuri de motive FOXA1 (Figura 3B). Seturile de date FOXA1 ChIP-seq din celulele MCF7, T47D și HepG2 conțin de obicei 1000-2000 de potriviri cu DIV și arată o îmbogățire pentru DIV în comparație cu controlul dimerului în ceea ce privește raportul DIV/control la nivelul genomului (Figura suplimentară S3B) . Ca proxy pentru dimerizarea cooperantă într-un context celular, am comparat semnalele ChIP-seq pe cele patru clase de situsuri de legare. Locii FOXA1 cu semnături DIV în celulele T47D, MCF7 și HepG2 prezintă intensități de citire ChIP-seq semnificativ mai puternice în comparație cu regiunile cu potriviri de motive alternative (Figura 3C, S3C suplimentar). Ca o analiză alternativă, am clasat vârfurile FOXA1 ChIP-seq în celulele MCF7, T47D și HepG2 în funcție de puterea semnalului și le-am împărțit în decile (Figura 3D). Apoi am cuantificat apariția fracțională a celor patru categorii de legare pe decil (Figura 3D). Această analiză arată că vârfurile FOXA1/DIV sunt concentrate în decilele superioare într-o măsură mai mare decât celelalte trei categorii de legare.

FOXA1 se leagă puternic de secvențele DIV în contextul cromatinei. (A) Expresia FOXA1 măsurată de consorțiul FANTOM 5 în 562 de tipuri de celule și țesuturi. Fiecare punct reprezintă o celulă sau un tip de țesut și sunt marcate probele selectate cu cea mai mare expresie FOXA1. (B) Schemă cum au fost clasificate vârfurile ChIP-seq pe baza absenței/prezenței motivelor monomerului, DIV sau dimerului de control (DIV1-10). (C) Boxplot pentru a compara scorurile ChIP-seq (ENCODE valorile semnalului narrowPeak) în cele patru categorii de vârf FOXA1 ChIP-seq definite în (B) folosind date din celulele T47D, HepG2 și MCF7. P-valorile sunt calculate folosind comparații perechi cu testul Wilcoxon rank sum nepereche (funcția R pairwise.wilcox.test) și ajustate folosind metoda Holm (***P < 0,001). (D) Vârfurile ChIP-seq au fost clasificate în funcție de valorile semnalului și împărțite în decile (decilă de sus = 1, decilă de jos = 10, afișate ca diagrame cu case) și numărările fracționale ale celor patru categorii de legare per decil sunt afișate ca diagrame de bare proporționale.

FOXA1 se leagă puternic de secvențele DIV în contextul cromatinei. (A) Expresia FOXA1 măsurată de consorțiul FANTOM 5 în 562 de tipuri de celule și țesuturi. Fiecare punct reprezintă o celulă sau un tip de țesut și sunt marcate probele selectate cu cea mai mare expresie FOXA1. (B) Schemă cum au fost clasificate vârfurile ChIP-seq pe baza absenței/prezenței motivelor monomerului, DIV sau dimerului de control (DIV1-10). (C) Boxplot pentru a compara scorurile ChIP-seq (ENCODE valorile semnalului narrowPeak) în cele patru categorii de vârf FOXA1 ChIP-seq definite în (B) folosind date din celulele T47D, HepG2 și MCF7. P-valorile sunt calculate folosind comparații perechi cu testul Wilcoxon rank sum nepereche (funcția R pairwise.wilcox.test) și ajustate folosind metoda Holm (***P < 0,001). (D) Vârfurile ChIP-seq au fost clasificate în funcție de valorile semnalului și împărțite în decile (decilă de sus = 1, decilă de jos = 10, afișate sub formă de diagrame cu case) și numărările fracționale ale celor patru categorii de legare pe decil sunt afișate ca diagrame de bare proporționale.

De asemenea, am inspectat semnalele ChIP-seq pentru factorii alternativi asociați cu cromatina GATA3, co-activatorul Histone acetiltransferaza P300 (EP300), CTCF și c-Jun (Figura suplimentară S3E). Nu am observat semnale crescute peste secvențele DIV în comparație cu alte categorii de situsuri de legare, ceea ce indică faptul că efectul este specific pentru FOXA1. Concluzionăm că FOXA1 se asociază cu DIV mai puternic decât cu situsuri dimeri monomerice sau alternative într-un context de cromatina din cauza homodimerizării foarte cooperante promovată de acest situs de legare. Apoi am efectuat analiza ontologiei genelor folosind seturi de gene legate de evenimentele de legare FOXA1/DIV în celulele T47D sau MCF7 cu semnături ale expresiei modificate după perturbări chimice sau genetice (Figura suplimentară S3E). Printre seturile de gene cele mai semnificativ îmbogățite legate de FOXA1/DIV se numără genele suprareglate în xenogrefe rezistente la terapia endocrină (55), reglate diferențiat în luminal în comparație cu liniile celulare de cancer de sân bazal sau mezenchimal (56), reglate în jos la sân. celulele canceroase epuizate de ESR1 ( 57) și alte seturi de gene asociate cu răspunsul la semnalizarea receptorilor nucleari și căile oncogene. Acest lucru sugerează că genele asociate cu locațiile FOXA1/DIV sunt sensibile la perturbarea căilor relevante pentru progresia cancerului, în special în modelele de cancer de sân.

FOXA1 homodimerizează pe motivele DIV pentru a regla amplificatorii din apropierea genelor implicate în progresia cancerului

Apoi am selectat cinci loci FOXA1/DIV asociati cu gene care răspund la studiile de perturbare care au arătat în mod reproductibil semnale puternice ChIP-seq în celulele MCF7 (Figura 4A, Figura suplimentară S3E). Acești loci sunt localizați fie în introni, fie la 50 kb în amonte de TSS-ul genelor cu o expresie puternică în celulele MCF7 și alte tipuri relevante de celule și țesuturi (Figura suplimentară S4A și B). Mai mult, s-a raportat că aceste gene joacă roluri critice în cancer sau procese celulare esențiale, inclusiv ESR1 ( 58), PVT1/MYC ( 59), ATP9A ( 60), QSOX1 ( 61) și KAT6B ( 62) (Figura suplimentară S4A). PVT1 codifică un ARN lung necodificator care rezidă în locusul 8q24 împărtășit cu oncogena C-UL MEU (63). Acest locus este puternic amplificat într-un panou de cancere maligne și un marker pentru prognostic prost (64, 65). Am efectuat EMSA utilizând secvența derivată din acești cinci loci endogeni, precum și două tipuri de mutanți (Figura 4B-D). În primul rând, am proiectat aceste loci prin introducerea distanțierilor de 3 bp între jumătățile de site-uri care amintesc de elementul D3 care este incompatibil cu legarea dimerică (Figura 1E, „Monomer”, Tabelul suplimentar S1). Mai mult, am mutat ambele jumătăți de site-uri pentru a genera elemente ADN cu consensul FOXA1 complet distrus („Fără legare”, Tabel suplimentar S1). Rezultatele arată o cooperare puternic pozitivă pentru homodimerizarea FOXA1 pe toate cele cinci secvențe DIV cu cea mai mare valoare ω pentru PVT1/MYC locus (Figura 4B–E). Introducerea distanțierului 3bp distruge legarea dimerică, dar lasă neafectată afinitatea pentru legarea monomerică (Figura 4C). Degenerarea ambelor semi-situri FOXA1 elimină aproape complet legarea FOXA1 la concentrațiile testate (Figura 4D). Pentru a testa dacă legarea cu componentele purificate este asociată cu reglarea genelor într-un context de celule și cromatinei, am proiectat două teste reporter pentru a valida activitatea de amplificare a acestor loci. În primul rând, am donat fragmente de aproximativ 500 bp care cuprind secvențele DIV legate de FOXA1 testate de EMSA în vectori Tol2. Sistemul Tol2 permite integrarea mediată de transpoză în genomul celulelor MCF7 care exprimă puternic FOXA1 (Figura suplimentară S4C). În plus, am proiectat un test de raportare a luciferazei. Acesta din urmă a fost efectuat în celulele T47D care exprimă FOXA1 endogen și în linia celulară de cancer de colon HCT116 unde FOXA1 nu este exprimat în mod normal (66) (Figura suplimentară S4C). Nivelurile de expresie ale reporterilor Tol2-GFP conduse de diferitele constructe de amplificator au fost cuantificate în celule MCF7 folosind FACS și exprimarea a fost notată luând în considerare fracția de celule GFP pozitive, precum și semnalul GFP median (Figura suplimentară S4D). Aceste niveluri de expresie arată că secvențele care conțin motive DIV prezintă o activitate intensificatoare puternică (Figura 4F, „Dimer”). Expresia reporterilor GFP în care DIV a fost mutat, astfel încât FOXA1 să se poată lega doar monomeric ("Monomer") sau cu două semi-siti-uri perturbate ("Fără legare") a arătat o activitate reporter epuizată semnificativ, sugerând că este necesară dimerizarea cooperativă pentru activarea completă a reporterului ( Figura 4F). În mod analog, activitatea reporterului luciferazei a fost redusă în celulele T47D pentru 4 din 5 secvențe atunci când legarea homoderimică a fost întreruptă (Figura 4G). În cele din urmă, activitatea reporterului luciferazei a fost puternic crescută în HCT116 lipsit de FOXA1 endogen la furnizarea exogenă de FOXA1, ceea ce indică faptul că activarea reporterului este dependentă de FOXA1 (Figura 4H). Colectiv, aceste rezultate arată că FOXA1 dimerizează în mod cooperant pe secvențe de ADN endogene și că configurația dimerică FOXA1/DIV este necesară pentru activarea eficientă a acestor secvențe de amplificator.

Legarea FOXA1/DIV reglează expresia genelor în celulele canceroase. (A) Vârfurile FOXA1 ChIP-seq în celulele MCF7 (numerele de acces sunt indicate) la cinci loci DIV în apropierea genelor cu roluri potențiale în oncogeneză (a se vedea, de asemenea, figura suplimentară S4A și B). (B) EMSA care utilizează elemente ADN marcate cu Cy5 derivate din cei cinci loci DIV endogeni. (C) EMSA în care cele cinci elemente ADN DIV au fost mutate în situsuri de legare a monomerului prin adăugarea unui distanțier de 3 perechi de baze care distruge legarea dimerică, dar lăsând intactă legarea monomerică (denumită în continuare „Monomer”). (D) EMSA în care ambele jumătăți de situsuri ale elementelor DIV au suferit mutații, eliminând legarea („Fără legare”). (E) Valoarea cooperativității homodimerului ( ⁠|$omega$|⁠ ) prezentată ca medie ± SD din n |$geq$| 3 măsurători. (F) Fluorescența totală a GFP cuantificată prin analiza FACS folosind constructe Tol2 care conțin amplificatori DIV sau cele două tipuri de situsuri DIV mutante („Monomer” sau „Fără legare”) integrate în genomul celulelor MCF7. Graficele FACS și fotografiile celulelor sunt în figura suplimentară S4D. (G) Testul dual luciferaza reporter folosind linia celulară T47D care exprimă endogen FOXA1. (H) Testul Luciferazei duale în celule HCT116 co-transfectate cu plasmide de expresie FOXA1 (bare umplute) sau controlul pcDNA3 (bare goale). Vectorul gol este reporterul luciferazei fără amplificator DIV inserat. Semnalele reporterului din (F) și (G) au fost normalizate la valorile „monomer”. Reporterii Luciferaza și Tol2 au fost construiți așa cum este subliniat în Figura suplimentară S4C. Media ± SD a trei replici biologice este prezentată în (F), (G) și (H). P-valorile au fost calculate folosind studentul cu două cozi nepereche t-Test (***P< 0,001 **P< 0,01*P< 0,05).

Legarea FOXA1/DIV reglează expresia genelor în celulele canceroase. (A) Vârfurile FOXA1 ChIP-seq în celulele MCF7 (numerele de acces sunt indicate) la cinci loci DIV în apropierea genelor cu roluri potențiale în oncogeneză (a se vedea, de asemenea, figura suplimentară S4A și B). (B) EMSA care utilizează elemente ADN marcate cu Cy5 derivate din cei cinci loci DIV endogeni. (C) EMSA în care cele cinci elemente ADN DIV au fost mutate în situsuri de legare a monomerului prin adăugarea unui distanțier de 3 perechi de baze care distruge legarea dimerică, dar lăsând intactă legarea monomerică (denumită în continuare „Monomer”). (D) EMSA în care ambele jumătăți de situsuri ale elementelor DIV au suferit mutații, eliminând legarea („Fără legare”). (E) Valoarea cooperativității homodimerului ( ⁠|$omega$|⁠ ) prezentată ca medie ± SD din n |$geq$| 3 măsurători. (F) Fluorescența totală a GFP cuantificată prin analiza FACS utilizând construcții Tol2 care conțin amplificatori DIV sau cele două tipuri de situsuri DIV mutante („Monomer” sau „Fără legare”) integrate în genomul celulelor MCF7. Graficele FACS și fotografiile celulelor sunt în figura suplimentară S4D. (G) Testul dual luciferaza reporter folosind linia celulară T47D care exprimă endogen FOXA1. (H) Testul Luciferazei duale în celule HCT116 co-transfectate cu plasmide de expresie FOXA1 (bare umplute) sau controlul pcDNA3 (bare goale). Vectorul gol este reporterul luciferazei fără amplificator DIV inserat. Semnalele reporterului din (F) și (G) au fost normalizate la valorile „monomer”. Reporterii Luciferaza și Tol2 au fost construiți așa cum este subliniat în Figura suplimentară S4C. Media ± SD a trei replici biologice este prezentată în (F), (G) și (H). P-valorile au fost calculate folosind studentul cu două cozi nepereche t-Test (***P< 0,001 **P< 0,01*P< 0,05).

Secvențele DIV mediază deschiderea cromatinei în locații prelegate de FOXA1 la inhibarea căii PI3K

Întrucât FOXA1 este desemnat ca un pionier distinctiv TF, apoi am întrebat dacă configurația FOXA1/DIV este implicată în reglarea accesibilității cromatinei. Pentru a aborda această întrebare, am devenit interesați de un studiu care a explorat modificările cromatinei în linia celulară de cancer de sân T47D ca răspuns la tratamentul cu inhibitorul de fosfatidilinozitol 3-kinazei (PI3K) BYL719 (denumit în continuare BYL) ( 67). Calea PI3K este hiperactivă în aproximativ 70% dintre tumorile mamare și, prin urmare, o țintă atractivă pentru terapiile anticancer (68). Cu toate acestea, inhibarea kinazei PI3K poate duce la un răspuns compensator puternic și la recidiva cancerului, probabil facilitată de programele de reglementare asociate cu ERα. Pentru a studia mecanismul molecular pentru acest proces, Toska și colegii au comparat profilul de legare al FOXA1 și accesibilitatea cromatinei măsurată de ATAC-seq în absența și prezența BYL ( 67 ). În mod intrigant, autorii au raportat un motiv care se îmbogățește în peisajul de legare FOXA1 după tratamentul BYL719 reprezentând o potrivire perfectă cu DIV. Cu toate acestea, autorii se referă la acest motiv drept motiv „Homeobox” din cauza adnotărilor lipsă ale DIV în bazele de date de motive comune. Prin urmare, am decis să verificăm dacă configurațiile FOXA1/DIV contribuie la remodelarea compensatorie a cromatinei ca răspuns la inhibarea căii PI3K.

Vârfurile categoriei DIV („D”) prezintă semnale ChIP-seq mai puternice decât loci cu situsuri monomerice („M”), situsuri cu configurații dimer perturbate („C”) și locuri fără element de consens FOXA1 detectabil („N”) sub ambele condiții DMSO și BYL (Figura 5A și B). Am grupat locațiile genomice în funcție de dinamica închis-deschis măsurată de ATAC-seq în absența sau prezența inhibării PI3K. Site-urile deschise permanent (PO) sunt deschise atât în ​​condiții DMSO, cât și în condiții BYL. Siturile aproape de deschise (CO) câștigă accesibilitate, iar site-urile deschise pentru a închide (OC) își pierd accesibilitatea ca răspuns la tratamentul BYL (Figura 5C). Am descoperit că majoritatea locilor aparțin categoriei OC indicând accesibilitatea pierdută la tratamentul BYL. Cu toate acestea, semnalul FOXA1 ChIP-seq este asociat predominant cu categoriile PO sau CO, dar abia detectabil în categoria OC (Figura 5C). Acest lucru sugerează că absența FOXA1 sensibilizează locațiile genomice pentru închidere, în timp ce prezența FOXA1 ar putea avea două roluri. În primul rând, FOXA1 ar putea funcționa pentru a menține starea deschisă de cromatină a situsurilor PO. În al doilea rând, site-urile închise prelegate de FOXA1 ar putea deveni deschise ca răspuns la inhibarea PI3K. Apoi am inspectat semnalele ATAC-seq peste locații prelegate de FOXA1 în condiții DMSO. Am descoperit că locații fără potriviri cu cap de furcă motivele de legare („N”) sunt în mare parte pre-deschise în condiții DMSO și arată doar o creștere marginală a semnalelor ATAC-seq după tratamentul BYL (Figura 5D și E, Figura suplimentară S5A). Cu toate acestea, în mod surprinzător, locațiile FOXA1/DIV prelegate în condiții DMSO sunt în mare parte închise, dar arată o creștere puternică a semnalului ATAC-seq după inhibarea căii PI3K (Figura 5D și E, Figura suplimentară S5A).În mod constant, o proporție mare de site-uri FOXA1/DIV legate în condiții DMSO se mapează la locații din categoria CO (Figura 5F). În timp ce site-urile FOXA1/C și FOXA1/M arată, de asemenea, o preferință pentru locațiile CO, această asociere este mai semnificativă pentru site-urile FOXA1/DIV (testul exact al lui Fisher P = 2,4e–05 (DIV versus dimer de control)). Concluzionăm că locațiile prelegate de FOXA1 în condiții DMSO sunt supuse unei tranziții de la închis la deschis la inhibarea PI3K și acest efect este cel mai profund pentru subsetul locației FOXA1/DIV. The PVT1/MYC și KAT6B loci ilustrează acest efect cu semnale ChIP-seq la fel de puternice în condiții DMSO și BYL719, dar o creștere puternică a semnalului ATAC-seq după inhibarea PI3K (Figura 5G). Apoi am testat dacă locațiile DIV din apropierea PVT1/MYC și KAT6B genele răspund la inhibarea PI3K în testul nostru de raportare a luciferazei. Secvențele cu elemente DIV intacte arată o activitate de raportare crescută ca răspuns la tratamentul BYL, în timp ce situsurile cu elemente DIV mutante nu prezintă niciun răspuns semnificativ (Figura 5H). Cu toate acestea, este puțin probabil ca construcțiile reporter pe bază de plasmide să semene exact cu configurațiile cromatinei ale locilor endogeni. Prin urmare, nu putem fi siguri că modificările observate ale activității reporterului se datorează aceleiași dinamici cromatinei închis-deschis aparente în datele ATAC-seq. Cu toate acestea, această analiză sugerează că blocarea căii PI3K duce la remodelarea cromatinei la locațiile pre-legate FOXA1/DIV care ar putea avea un impact asupra producției transcripționale.

Locațiile DIV legate de FOXA1 sunt asociate cu dinamica cromatinei. (A, B) Boxplot al scorurilor ChIP-seq (înălțimea vârfului adunării fragmentelor) din datele FOXA1 în celulele T47D comparând categoriile de vârf pentru subseturile care conțin motive DIV (D), motive de control (C), motive monomer (M) și niciun motiv FOXA1 (N) ) (vezi Figura 2B). Celulele T47D au fost expuse la DMSO (A) sau la inhibitorul căii PI3K BYL719 (B) (67). (C). Harta termică a citirilor ATAC-seq, precum și a citirilor FOXA1 ChIP-seq în condiții de tratament DMSO sau BYL719 în trei categorii de modele de accesibilitate: PO (deschis permanent în DMSO și BYL), CO (închis în DMSO, dar deschis în BYL) și OC ( deschis în DMSO dar închis în BYL). (D) Hărți termice citite ATAC-seq în condiții de tratament DMSO sau BYL719 fațetate de cele patru categorii de vârf FOXA1 ChIP-seq definite în condiția DMSO. Panourile inferioare sunt acumulari de semnale ATAC-seq. (E) Grafic în box a raportului dintre numărul de citire ATAC-seq între celulele T47D tratate cu BYL719 și celulele T47D netratate (DMSO) în cele patru categorii de situsuri de legare FOXA1. (F) Diagrame fracționale care arată proporțiile relative ale categoriilor de vârf ale FOXA1 și ale site-urilor care nu sunt legate de FOXA1 (denumită în continuare „Nelegat”) asociate cu situri PO, OC sau CO definite conform modelelor de accesibilitate măsurate prin ATAC-seq (a se vedea panoul C). (G) Browserul genomului prezintă exemple de semnale ChIP-seq și ATAC-seq la site-urile FOXA1/DIV din apropierea PVT1/MYC și KAT6B loci. Casetele negre marchează locațiile cu motiv DIV, în timp ce casetele verzi arată o locație alternativă care arată o dispariție a semnalelor ATAC-seq. (H) Graficul cu bare a semnalului Luciferaza/Renilla măsurat în celulele T47D tratate cu DMSO (roșu) sau BYL719 (albastru) utilizând elementul DIV care conține reporter de luciferază din PVT1/MYC și KAT6B loci și controale mutante „fără obligație”. Este prezentată media ± SD a 3 replici biologice. P-valorile din (H) au fost calculate folosind studentul neperecheat cu două cozi t-Test (***P< 0,001 **P< 0,01 *P< 0,05). P-valorile din (A), (B) și (E) sunt calculate folosind testul sumei rangului Wilcoxon și ajustate folosind metoda Holm ( ***P< 0,001).

Locațiile DIV legate de FOXA1 sunt asociate cu dinamica cromatinei. (A, B) Boxplot al scorurilor ChIP-seq (înălțimea vârfului adunării fragmentelor) din datele FOXA1 în celulele T47D comparând categoriile de vârf pentru subseturile care conțin motive DIV (D), motive de control (C), motive monomer (M) și niciun motiv FOXA1 (N) ) (vezi Figura 2B). Celulele T47D au fost expuse la DMSO (A) sau la inhibitorul căii PI3K BYL719 (B) (67). (C). Harta termică a citirilor ATAC-seq, precum și a citirilor FOXA1 ChIP-seq în condiții de tratament DMSO sau BYL719 în trei categorii de modele de accesibilitate: PO (deschis permanent în DMSO și BYL), CO (închis în DMSO, dar deschis în BYL) și OC ( deschis în DMSO dar închis în BYL). (D) Hărți termice citite ATAC-seq în condiții de tratament DMSO sau BYL719 fațetate de cele patru categorii de vârf FOXA1 ChIP-seq definite în condiția DMSO. Panourile inferioare sunt acumulari de semnale ATAC-seq. (E) Grafic în box a raportului dintre numărul de citire ATAC-seq între celulele T47D tratate cu BYL719 și celulele T47D netratate (DMSO) în cele patru categorii de situsuri de legare FOXA1. (F) Diagrame fracționale care arată proporțiile relative ale categoriilor de vârf ale FOXA1 și ale site-urilor care nu sunt legate de FOXA1 (denumită în continuare „Nelegat”) asociate cu situri PO, OC sau CO definite în funcție de modelele de accesibilitate măsurate prin ATAC-seq (a se vedea panoul C). (G) Browserul genomului prezintă exemple de semnale ChIP-seq și ATAC-seq la site-urile FOXA1/DIV din apropierea PVT1/MYC și KAT6B loci. Casetele negre marchează locațiile cu motiv DIV, în timp ce casetele verzi arată o locație alternativă care arată o dispariție a semnalelor ATAC-seq. (H) Graficul cu bare a semnalului Luciferaza/Renilla măsurat în celulele T47D tratate cu DMSO (roșu) sau BYL719 (albastru) utilizând elementul DIV care conține reporter de luciferază din PVT1/MYC și KAT6B loci și controale mutante „fără obligație”. Este prezentată media ± SD a 3 replici biologice. P-valorile din (H) au fost calculate folosind studentul neperecheat cu două cozi t-Test (***P< 0,001 **P< 0,01 *P< 0,05). P-valorile din (A), (B) și (E) sunt calculate utilizând testul Wilcoxon rank sum și ajustate folosind metoda Holm ( ***P< 0,001).

SNP-urile asociate bolii din motivul DIV induc formarea dimerului specific alelei și activitatea de expresie

Am presupus că homodimerizarea cooperativă FOXA1 pe secvențele DIV este necesară pentru a executa un rezultat funcțional pe un subset de loci genomici. Dacă motivul dimer este perturbat, un locus ar putea pierde capacitatea de a recruta eficient FOXA1. Sau, alternativ, FOXA1 monomeric ar putea fi incapabil să declanșeze un răspuns de reglementare în ciuda recrutării eficiente. În consecință, răspunsurile celulare aberante ar putea fi evocate contribuind la bolile umane. Pentru a testa această ipoteză, am interogat studiile de asociere la nivel de genom (GWAS) pentru variantele care afectează dimerizarea FOXA1. Am luat în considerare 25 218 SNP-uri asociate bolii disponibile din resurse publice (http://www.gwascentral.org, date publicate în ianuarie 2016) și am extras SNP-uri suplimentare în dezechilibru de legătură cu acestea (SNP-uri proxy LD) folosind Haploreg (http://archive .broadinstitute.org/mammals/haploreg/haploreg.php) cu parametru r 2 > 0,8 în populația europeană. În acest fel, am obținut un set de 606 094 SNP-uri candidate. Apoi am intersectat coordonatele SNP cu coordonatele DIV la nivelul genomului care afectează site-ul central TA (AAA TA TTT), despre care am presupus că este cel mai critic pentru homodimerizarea cooperantă a FOXA1. În acest fel, am obținut 23 de SNP-uri candidate a căror alelă minoră poate perturba homodimerizarea FOXA1 și cap de furcă-reţele transcripţionale dependente. Pentru a determina dacă FOXA1 prezintă diferențe alelice în formarea dimerilor, am efectuat EMSA pe toți cei 23 de candidați SNP cu secvențe de alele majore sau minore. Folosind această strategie, am identificat 15 SNP-uri care perturbă profund dimerizarea FOXA1 (Figura 6A, Tabelul 1, Figura suplimentară S6A). Am inspectat în continuare fiecare dintre cele 15 SNP din setul de date furnizat de consorțiul de expresie a țesuturilor genotipului (GTEx) (https://gtexportal.org/) și am constatat că șase dintre SNP-uri sau SNP-urile lor LD constituie locusul trăsăturii cantitative de expresie a GTEx (eQTL-uri). , Figura 6A, Tabelul 1). În unele cazuri, de ex. rs2097744 care este asociat cu cancerul pulmonar fără celule mici, alela minoră a perturbat complet legarea dimerică FOXA1 (Figura 6B). În alte cazuri, alelele minore au scăzut cooperativitatea dimerizării FOXA1 (Tabelul suplimentar S1). Ne-am concentrat apoi pe SNP-urile susținute de adnotări genomice în țesuturi bazate pe activitatea FOXA1 sau înrudite. cap de furcă proteinele familiei.

SNP-urile asociate bolii perturbă dimerizarea și expresia genelor. (A) Diagramă pentru selectarea SNP-urilor pentru evaluarea funcțională. (B) EMSA pentru locusul rs2097744 în care alela minoră perturbă complet dimerizarea. (C) Profiluri ChIP-seq ale mărcilor histonelor la locusul rs2941742 în diferite linii celulare. (D) EMSA comparând formarea de dimeri pentru alelele majore și minore ale rs2941742. (E) Factorul de cooperare pentru EMSA în D (media ± SD, n = 5). (F) Test de luciferază duală cu FOXA1 furnizat exogen în celule HCT116 folosind ambele alele ale rs2941742 (media ± SD, n = 5). (G) Profiluri FOXA1 ChIP-seq din mai multe linii de celule canceroase umane la locusul rs5414555835 (un ID alternativ al aceluiași locus este rs67668514). (H) EMSA care utilizează alela majoră și minoră a lui rs5414555835. I. Test de luciferază duală pentru cele două alele ale locusului rs5414555835 în celulele HCT116. Barele umplute sunt pentru FOXA1 cu lungime completă furnizată în mod exogen și barele goale pentru controalele vectoriale pcDNA3 (media ± SD, n = 3 replici biologice). P-valorile au fost calculate folosind studentul cu două cozi nepereche t-Test (**P< 0,01).

SNP-urile asociate bolii perturbă dimerizarea și expresia genelor. (A) Diagramă pentru selectarea SNP-urilor pentru evaluarea funcțională. (B) EMSA pentru locusul rs2097744 în care alela minoră perturbă complet dimerizarea. (C) Profiluri ChIP-seq ale mărcilor histonelor la locusul rs2941742 în diferite linii celulare. (D) EMSA comparând formarea de dimeri pentru alelele majore și minore ale rs2941742. (E) Factorul de cooperare pentru EMSA în D (media ± SD, n = 5). (F) Test de luciferază duală cu FOXA1 furnizat exogen în celule HCT116 folosind ambele alele ale rs2941742 (media ± SD, n = 5). (G) Profiluri FOXA1 ChIP-seq din mai multe linii de celule canceroase umane la locusul rs5414555835 (un ID alternativ al aceluiași locus este rs67668514). (H) EMSA care utilizează alela majoră și minoră a lui rs5414555835. I. Test de luciferază duală pentru cele două alele ale locusului rs5414555835 în celulele HCT116. Barele umplute sunt pentru FOXA1 cu lungime completă furnizată în mod exogen și barele goale pentru controalele vectoriale pcDNA3 (media ± SD, n = 3 replici biologice). P-valorile au fost calculate folosind studentul cu două cozi nepereche t-Test (**P< 0,01).

ID SNP. Locație (hg38) . Gene . Asocierea bolii. Adnotare . Luciferaza . GTEx .
. . . . . Maior . Minor . eQTL.
rs2858870 chr6:32604474 HLA-DRB1 Scleroza nodulară limfom Hodgkin Semne de histonă promotor, semne de histonă amplificatoare și marker DNază al celulelor limfoblastoide, celulelor sanguine și musculare N
rs2097744 chr7:118382988 LSM8, ANKRD7 Răspunsul la chimioterapia pe bază de platină în cancerul pulmonar fără celule mici ++ ++ Y
rs767441 chr15:48613619 FBN1 Cancer mamar Semne de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale celulelor adipocite, musculare și pulmonare N
rs2104047 chr14:68287700 RAD51B Ciroza biliară primară Semne de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale celulelor sanguine, celulelor musculare, timusului și celulelor stem hematopoietice ++ ++ N
rs2941742 chr6:151691853 ESR1 Densitatea minerală osoasă (șold) Urme de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale celulelor osteoblastice, celulelor musculare, celulelor sanguine și ale celulelor hepatice ++ + N
rs541455835 (rs67668514 *) chr17:46099939 KANSL1, MAPT boala Parkinson Semne de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale celulelor creierului, celulelor hepatice și ale celulelor sanguine ++ +++ Y
rs281038 chr5:156653467 SGCD Trăsături antropometrice Amplificarea semnelor de histonă ale celulelor primare ale melanocitelor prepuțului + Y (rs157350)
rs6990531 chr8:80483511 ZBTB10 Tulburari de alimentatie Semne de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale creierului, mușchilor și celulelor sanguine + ++ N
rs7697634 chr4:17965123 LCORL Înălţime Marca de histonă promotoare a ficatului și marca de histonă amplificatoare a insulelor pancreatice ++ + Y
rs7957274 chr12:21197462 SLCO1B1 măsurarea metaboliților din sânge Semne de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale ESC și ale celulelor sanguine + ++ N
rs11716984 chr3:121643560 HCLS1 test neuropsihologic Semne de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale ESC, iPSC și celulelor sanguine ++ Y
rs62288111 chr3:190946175 SNAR-I, GMNC Boala Alzheimer Marca de histonă promotoare a țesutului hepatic adult și marca de histonă amplificatoare a celulelor cultivate ectoderm CD56+ derivate de hESC + ++ N
rs34466261 chr7:104835293 LHFPL3 Obezitatea Marca de histonă de intensificare a celulelor ESC HUES48 + N
rs2149943 chr10:107811551 SORCS1 boli prionice Marca de histonă de amplificare a celulelor ES-UCSF4 și a insulelor pancreatice ++ + N
rs7007731 chr8:76783496 ZFHX4 varsta la menarha Amplificator marca histonică a celulelor mezenchimale ++ Y (rs4735738)
ID SNP. Locație (hg38) . Gene . Asocierea bolii. Adnotare . Luciferaza . GTEx .
. . . . . Maior . Minor . eQTL.
rs2858870 chr6:32604474 HLA-DRB1 Scleroza nodulară limfom Hodgkin Semne de histonă promotor, semne de histonă amplificatoare și marker DNază al celulelor limfoblastoide, celulelor sanguine și musculare N
rs2097744 chr7:118382988 LSM8, ANKRD7 Răspunsul la chimioterapia pe bază de platină în cancerul pulmonar fără celule mici ++ ++ Y
rs767441 chr15:48613619 FBN1 Cancer mamar Semne de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale celulelor adipocite, musculare și pulmonare N
rs2104047 chr14:68287700 RAD51B Ciroza biliară primară Semne de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale celulelor sanguine, celulelor musculare, timusului și celulelor stem hematopoietice ++ ++ N
rs2941742 chr6:151691853 ESR1 Densitatea minerală osoasă (șold) Semne de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale celulelor osteoblastice, celulelor musculare, celulelor sanguine și ale celulelor hepatice ++ + N
rs541455835 (rs67668514 *) chr17:46099939 KANSL1, MAPT boala Parkinson Semne de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale celulelor creierului, celulelor hepatice și ale celulelor sanguine ++ +++ Y
rs281038 chr5:156653467 SGCD Trăsături antropometrice Amplificarea semnelor de histonă ale celulelor primare ale melanocitelor prepuțului + Y (rs157350)
rs6990531 chr8:80483511 ZBTB10 Tulburari de alimentatie Semne de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale creierului, mușchilor și celulelor sanguine + ++ N
rs7697634 chr4:17965123 LCORL Înălţime Marca de histonă promotoare a ficatului și marca de histonă amplificatoare a insulelor pancreatice ++ + Y
rs7957274 chr12:21197462 SLCO1B1 măsurarea metaboliților din sânge Semne de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale ESC și ale celulelor sanguine + ++ N
rs11716984 chr3:121643560 HCLS1 test neuropsihologic Semne de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale ESC, iPSC și celulelor sanguine ++ Y
rs62288111 chr3:190946175 SNAR-I, GMNC Boala Alzheimer Marca de histonă promotoare a țesutului hepatic adult și marca de histonă amplificatoare a celulelor cultivate ectoderm CD56+ derivate de hESC + ++ N
rs34466261 chr7:104835293 LHFPL3 Obezitatea Marca de histonă de amplificare a celulelor ESC HUES48 + N
rs2149943 chr10:107811551 SORCS1 boli prionice Marca de histonă de amplificare a celulelor ES-UCSF4 și a insulelor pancreatice ++ + N
rs7007731 chr8:76783496 ZFHX4 varsta la menarha Amplificator marca histonică a celulelor mezenchimale ++ Y (rs4735738)

15 SNP-uri care arată diferențe alelice în legarea homodimerică a FOXA1 la site-urile cu motive DIV. „+” indică nivelul de expresie a luciferazei crescut în comparație cu vectorul gol și „–” că a scăzut. denotă o alternativă utilizată anterior

ID SNP. Locație (hg38) . Gene . Asocierea bolii. Adnotare . Luciferaza . GTEx .
. . . . . Maior . Minor . eQTL.
rs2858870 chr6:32604474 HLA-DRB1 Scleroza nodulară limfom Hodgkin Semne de histonă promotor, semne de histonă amplificatoare și marker DNază al celulelor limfoblastoide, ale celulelor sanguine și ale celulelor musculare N
rs2097744 chr7:118382988 LSM8, ANKRD7 Răspunsul la chimioterapia pe bază de platină în cancerul pulmonar fără celule mici ++ ++ Y
rs767441 chr15:48613619 FBN1 Cancer mamar Semne de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale celulelor adipocite, musculare și pulmonare N
rs2104047 chr14:68287700 RAD51B Ciroza biliară primară Semne de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale celulelor sanguine, celulelor musculare, timusului și celulelor stem hematopoietice ++ ++ N
rs2941742 chr6:151691853 ESR1 Densitatea minerală osoasă (șold) Urme de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale celulelor osteoblastice, celulelor musculare, celulelor sanguine și ale celulelor hepatice ++ + N
rs541455835 (rs67668514 *) chr17:46099939 KANSL1, MAPT boala Parkinson Semne de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale celulelor creierului, celulelor hepatice și ale celulelor sanguine ++ +++ Y
rs281038 chr5:156653467 SGCD Trăsături antropometrice Amplificarea semnelor de histonă ale celulelor primare ale melanocitelor prepuțului + Y (rs157350)
rs6990531 chr8:80483511 ZBTB10 Tulburari de alimentatie Semne de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale creierului, mușchilor și celulelor sanguine + ++ N
rs7697634 chr4:17965123 LCORL Înălţime Marca de histonă promotoare a ficatului și marca de histonă amplificatoare a insulelor pancreatice ++ + Y
rs7957274 chr12:21197462 SLCO1B1 măsurarea metaboliților din sânge Semne de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale ESC și ale celulelor sanguine + ++ N
rs11716984 chr3:121643560 HCLS1 test neuropsihologic Semne de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale ESC, iPSC și celulelor sanguine ++ Y
rs62288111 chr3:190946175 SNAR-I, GMNC Boala Alzheimer Marca de histonă promotoare a țesutului hepatic adult și marca de histonă amplificatoare a celulelor cultivate ectoderm CD56+ derivate de hESC + ++ N
rs34466261 chr7:104835293 LHFPL3 Obezitatea Marca de histonă de intensificare a celulelor ESC HUES48 + N
rs2149943 chr10:107811551 SORCS1 boli prionice Marca de histonă de amplificare a celulelor ES-UCSF4 și a insulelor pancreatice ++ + N
rs7007731 chr8:76783496 ZFHX4 varsta la menarha Amplificator marca histonică a celulelor mezenchimale ++ Y (rs4735738)
ID SNP. Locație (hg38) . Gene . Asocierea bolii. Adnotare . Luciferaza . GTEx.
. . . . . Maior . Minor . eQTL.
rs2858870 chr6:32604474 HLA-DRB1 Scleroza nodulară limfom Hodgkin Semne de histonă promotor, semne de histonă amplificatoare și marker DNază al celulelor limfoblastoide, ale celulelor sanguine și ale celulelor musculare N
rs2097744 chr7:118382988 LSM8, ANKRD7 Răspunsul la chimioterapia pe bază de platină în cancerul pulmonar fără celule mici ++ ++ Y
rs767441 chr15:48613619 FBN1 Cancer mamar Semne de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale celulelor adipocite, musculare și pulmonare N
rs2104047 chr14:68287700 RAD51B Ciroza biliară primară Semne de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale celulelor sanguine, celulelor musculare, timusului și celulelor stem hematopoietice ++ ++ N
rs2941742 chr6:151691853 ESR1 Densitatea minerală osoasă (șold) Urme de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale celulelor osteoblastice, celulelor musculare, celulelor sanguine și ale celulelor hepatice ++ + N
rs541455835 (rs67668514 *) chr17:46099939 KANSL1, MAPT boala Parkinson Semne de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale celulelor creierului, celulelor hepatice și ale celulelor sanguine ++ +++ Y
rs281038 chr5:156653467 SGCD Trăsături antropometrice Amplificarea semnelor de histonă ale celulelor primare ale melanocitelor prepuțului + Y (rs157350)
rs6990531 chr8:80483511 ZBTB10 Tulburari de alimentatie Semne de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale creierului, mușchilor și celulelor sanguine + ++ N
rs7697634 chr4:17965123 LCORL Înălţime Marca de histonă promotoare a ficatului și marca de histonă amplificatoare a insulelor pancreatice ++ + Y
rs7957274 chr12:21197462 SLCO1B1 măsurarea metaboliților din sânge Semne de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale ESC și ale celulelor sanguine + ++ N
rs11716984 chr3:121643560 HCLS1 test neuropsihologic Semne de histonă promotoare și semne de histonă amplificatoare ale ESC, iPSC și celulelor sanguine ++ Y
rs62288111 chr3:190946175 SNAR-I, GMNC Boala Alzheimer Marca de histonă promotoare a țesutului hepatic adult și marca de histonă amplificatoare a celulelor cultivate ectoderm CD56+ derivate de hESC + ++ N
rs34466261 chr7:104835293 LHFPL3 Obezitatea Marca de histonă de intensificare a celulelor ESC HUES48 + N
rs2149943 chr10:107811551 SORCS1 boli prionice Marca de histonă de amplificare a celulelor ES-UCSF4 și a insulelor pancreatice ++ + N
rs7007731 chr8:76783496 ZFHX4 varsta la menarha Amplificator marca histonică a celulelor mezenchimale ++ Y (rs4735738)

15 SNP-uri care arată diferențe alelice în legarea homodimerică a FOXA1 la site-urile cu motive DIV. „+” indică nivelul de expresie a luciferazei crescut în comparație cu vectorul gol și „–” că a scăzut. denotă o alternativă utilizată anterior

Am devenit deosebit de interesați de SNP rs2941742 situat într-o regiune a intronului ESR1 genă (Figura 6C). Acest SNP se mapează la o regiune cu marca de amplificator H3K27ac și marca de promotor H3K4me3 în osteoblaste, precum și semnele H3K27ac în celulele musculare și ale măduvei osoase (Figura 6C). SNP rs2941742 este în LD cu rs2941740 (r 2 = 0,98 în populația europeană) legat de densitatea minerală osoasă aberantă (DMO) - o trăsătură folosită în clinică pentru a diagnostica osteoporoza și estimarea riscului de fractură ( 69). Interesant, ESR1 este o genă relevantă pentru metabolismul osos, deoarece osteoporoza afectează în principal femeile aflate în postmenopauză cu niveluri scăzute ale ligandului său de activare estrogen ( 70 ). EMSA-urile au arătat că alela minoră a redus cooperativitatea homodimerului FOXA1 la locusul rs2941742 de 20 de ori, în timp ce legarea monomerică nu este afectată (Figura 6D și E). Mai mult decât atât, testele luciferazei au evidențiat o activitate de raportare redusă pentru minor în comparație cu alela majoră care depinde de adăugarea exogenă FOXA1 (Figura 6F). Prin urmare, este de imaginat că perturbarea dimerilor FOXA1 sau a celor înrudite cap de furcă TF-urile de pe locusul rs2941742 se modifică ESR1 reglare și contribuie la etiologia osteoporozei.

rs5414555835 (adnotat și cu ID rs67668514) se mapează la un locus legat de FOXA1 în diferite linii de celule canceroase (Figura 6G) și afișează semne active de histonă în celulele hepatice și cerebrale (Tabelul 1). Acest SNP este în LD cu rs17577094 la r 2 = 0,97 în populația europeană și hărți la chr17q21.31/HARTĂ locus (71) raportat a fi puternic asociat cu boala Parkinson (PD) (72). HARTĂ codifică proteina Tau a cărei dereglare și pliere aberantă este o cauză majoră a progresiei bolii. Interesant, rs541455835 este un eQTL GTEx asociat cu modificări specifice alelelor în HARTĂ expresie în diferite țesuturi (Figura suplimentară S6B). Mai mult, rs541455835 arată o diferență puternică în legarea și expresia genei reporter într-o manieră specifică alelei și dependentă de FOXA1 (Figura 6H și I). În special, FOXA1 și FOXA2 sunt critice pentru funcția neuronilor dopaminergici adulți ( 73). De exemplu, livrarea genică a FOXA2 într-un model de șoarece pentru neuronii dopaminergici ai creierului mediu protejat cu PD și a atenuat deficitele motorii ( 74). Prin urmare, modularea dimerizării FOXA1/2 pe HARTĂ locus-ul ar putea împiedica rolurile neuroprotective ale FOXA1/2 și să contribuie la PD. În general, am observat diferențe semnificative ale expresiei reporterului între secvențele de alele majore și minore pentru 10 dintre cele 15 SNP-uri testate (Figura suplimentară S6C), cinci dintre acestea fiind, de asemenea, eQTL.


MATERIALE ȘI METODE

Reactivi și anticorpi

EGF recombinant uman a fost achiziționat de la Boehringer-Mannheim Co. (Indianapolis, IN). Anticorpul anti-EGFR de iepure, anticorpul monoclonal de șoarece anti-Cbl (mAb), anticorpul anti-hemaglutinină de iepure, anticorpul anti-myc de iepure și traductorul anti-semnal și activatorul de transcripție de iepure (STAT) 5 au fost toate achiziționate de la Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). mAb anti-EGFR de șoarece (clona LA1) a fost achiziționat de la Upstate Biotechnology Inc. (Charlottesville, VA), mAb anti-EGFR de șoarece (clona EGFR.1) de la Neo Markers, imunoglobulină G de capră antișoarece (IgG) conjugată cu peroxidază de hrean (HRP). ) de la Zymed Laboratories Inc. (San Francisco, CA), IgG anti-iepure de capră conjugată cu HRP de la Chemicon International Inc. (Temecula, CA), mAb anti-fosfotirozină de șoarece (6D12) de la MBL Co (Nagoya, Japonia) și mAb anti-Flag de șoarece (M2) de la Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Protein kinaza activată de iepure anti-mitogen (MAPK) și anticorpul fosfo-MAPK au fost achiziționate de la New England Biolabs Inc. (Beverly, MA).

Construcția plasmidelor

O plasmidă care codifică un glutation SProteina de fuziune a transferazei (GST) care conține domeniul asemănător EGF al proHB-EGF, corespunzător aminoacizilor 106-149 ai proHB-EGF uman, a fost construită prin inserarea secvențelor de ADNc corespunzătoare ale proHB-EGF în EcoRI/Bamsitusurile HI ale plasmidei pGEX-3X (Pharmacia). Fragmentul de ADN inserat care codifică proHB-EGF a fost preparat prin reacția în lanț a polimerazei folosind plasmida pRTHG-1 (Mitamura et al., 1995) ca șablon. Proteina de fuziune GST rezultată, denumită HB1, cuprinde întregul domeniu asemănător EGF. Apoi, HB2, o proteină de fuziune GST care conține un domeniu mutant asemănător EGF al proHB-EGF, a fost produsă: Secvența de codificare a cDNA proHB-EGF a fost mutată de la 379 CGGAAA la CTTTCA și de la 388 AAG la GAC. Aceste substituții au dus la modificări ale aminoacizilor de la 110 Arg-111 Lys la Leu-Ser și 113 Lys la Asp. ADNc al mutantului proHB-EGF rezultat, corespunzător aminoacizilor 106-149 și care conține substituțiile de mai sus, a fost inserat înEcoRI/Bamsitusurile HI ale plasmidei pGEX-3X. Au fost construiți mutanți EGFR trunchiați: pRc/CMV-HA a fost construit prin inserarea unui fragment de ADN care codifică epitopul etichetei HA înXbaI site-ul pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA). Eliminarea EGFR a fost generată prin reacția în lanț a polimerazei folosind pTJNEO-EGFR (Gotoh et al., 1992) ca șablon, iar produsele sintetizate au fost introduse între HindIII şiXbaI site-uri de pRc/CMV-HA. Secvența fiecărui mutant EGFR a fost confirmată prin analiza secvenței.

Purificarea proteinei de fuziune GST

Proteinele de fuziune GST au fost purificate cu glutation Sepharose 4B (Pharmacia, Piscataway, NJ) conform instrucțiunilor producătorului. GST-HB1 și GST-HB2, eluate din glutation Sepharose, au fost dializate împotriva soluției saline tamponate cu HEPES (20 mM HEPES, 150 mM NaCI, pH 7,2) pentru utilizare în următoarele experimente. Concentrațiile de proteine ​​au fost determinate prin metoda Bradford folosind BSA ca standard.

Cultură celulară și transfecție

Celulele Ba/F3 au fost cultivate în mediu RPMI 1640 care conține 10% ser fetal de vițel (FCS) și 5% mediu condiționat de celule WEHI-3 ca sursă de interleukină 3 (IL-3). Transformanții stabili ai celulelor Ba/F3 care exprimă EGFR sau EGFR-EpoR au fost obținuți prin selecție în mediu care conține G418 așa cum s-a descris anterior (Iwamoto et al., 1999). Celulele COS-7 au fost menținute în DMEM cu 10% FCS. Celulele de ovar de hamster chinezesc (CHO) au fost cultivate în mediu Ham's F12 cu 10% FCS. Transfecția a fost efectuată prin electroporare (Gene Pulser, Bio-Rad, Richmond, CA) conform instrucțiunilor producătorului.

Tratament cu liganzi EGF

Înainte de testele de reticulare și coimunoprecipitare, celulele indicate au fost incubate cu 100 nM de EGF sau forme recombinate de HB-EGF timp de 3 minute, spălate cu PBS și apoi utilizate pentru analize ulterioare.

Reticulare chimică

Reticulare chimică a fost efectuată așa cum s-a descris anterior, cu modificări minore (Iwamoto et al., 1994). Pe scurt, celulele au fost spălate cu PBS (137 mM NaCI, 0,67 mM KCI, 8 mM Na2HPO4, 1,4 mM KH2PO4) de trei ori și incubat timp de 30 de minute la 4°C cu 1 mM ditiobis-(sulfosuccinimdylpropionat) (DTSSP) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) în PBS, urmată de spălare de trei ori cu soluție salină tamponată Tris (TBS) ( 20 mM Tris-HCI, 100 mM NaCI, pH 7,5) înainte de utilizare în următoarele studii.

Imunoprecipitarea și imunoblotting

Celulele au fost lizate cu 1% Triton X-100 în tampon de liză (0,15 M NaCI, 2 mM EDTA, 1 mM fluorură de fenilmetilsulfonil, 1 mM NaVO4, 50 mM Tris pH 7,5) și apoi centrifugat timp de 20 de minute la 15.000 × g. Supernatanții au fost curățați cu Sepharose 4B timp de 1 oră și apoi incubați cu anticorp primar timp de 2 ore, urmat de adăugarea de anticorp secundar conjugat cu Sepharose 4B. Granulele de Sepharose au fost spălate de trei ori cu tampon de liză și o dată cu apă deionizată și apoi au fost fierte timp de 5 minute în tampon de probă SDS-PAGE cu sau fără ditiotreitol 50 mM. Probele au fost rulate pe SDS-PAGE și electrotransferate pe o membrană Immobilon. Membrana a fost blocată cu lapte degresat 3% în TBS (20 mM Tris, 0,1 M NaCI, pH 7,5) la 37°C timp de 1 oră, apoi incubată cu anticorp primar în TBS care conține 1% lapte degresat la temperatura camerei timp de 1 oră. Apoi, membrana a fost spălată de patru ori cu TTBS (TBS care conține 0,05% Tween 20), incubată cu anticorp secundar conjugat cu HRP și, în final, analizată cu un kit ECL-Western blotting (Amersham International plc, Buckinghamshire, Anglia).

Test de sinteză ADN

Celulele au fost însămânțate în plăci cu 24 de godeuri la o densitate de 5 × 104 celule/godeu cu sau fără fiecare ligand EGF în mediu proaspăt RPMI 1640 care conține 10% ser, apoi cultivate la 37°C timp de 24 de ore și incubate cu [3H ]timidină (37 kBq/ml) timp de 4 ore. Celulele au fost recoltate și radioactivitatea încorporată în ADN a fost determinată așa cum s-a descris anterior (Iwamotoet al., 1999). Viteza de sinteză a ADN-ului a fost exprimată ca procent din media valorii maxime (40.000 cpm).

Prepararea fragmentului Fab

Anti-EGFR mAb (EGFR.1), 1 mg/ml, a fost incubat cu papaină (0,1 mg/ml) în PBS la 37°C timp de 18 ore, moment în care s-a adăugat iodoacetamidă (30 mM) pentru a opri reacția. Amestecul a fost dializat în PBS la 4°C timp de 12 ore şi apoi purificat cu anticorp IgG Fc de capră antişoarece conjugat cu Sepharose 4B. Mărimea fragmentului Fab a fost verificată prin SDS-PAGE, iar concentrația Fab a fost determinată prin măsurarea absorbanței la 280 nm.


Care sunt beneficiile tehnologiei hot-start?

  • Previne extinderea legarii primerilor la secvențele șablon cu omologie scăzută (amorsare greșită)
  • Previne extinderea primerilor care se leagă unul de altul (formarea primer-dimer) în timpul instalării reacției
  • Crește sensibilitatea și randamentul fragmentelor țintă dorite
  • Permite configurarea PCR pe platforme de manipulare automată a lichidelor de mare capacitate, deoarece reacțiile sunt stabile la temperatura camerei fără a compromite specificitatea

Dimer

A dimer este o moleculă compusă din două subunități legate între ele. Este un caz special al unui polimer. Printre cele mai frecvente dimers sunt anumite tipuri de zaharoză, de exemplu, este a dimer a unei molecule de glucoză și a unei molecule de fructoză.

Grund dimer
Salt la: navigare, căutare
Un primer dimer (PD) este un potențial produs secundar în PCR, o metodă biotehnologică comună. După cum sugerează și numele, un PD constă din molecule de primer care s-au atașat (hibridizat) unele de altele din cauza șirurilor de baze complementare din primeri.

Dimercaprol
Dimercaprolul este un compus sintetic produs pentru tratarea lewisitei (armă chimică pe bază de arsenic) și a otrăvirii cu metale grele. Dimercaprolul în sine este un medicament toxic, dar se pot utiliza doze terapeutice mici.

ic /die-MARE-ick/ adj. În chimie, compus din două părți.
sulfat de dimetil (DMS) /die-METH-əl/ Un lichid uleios incolor cu aromă de ceapă. Utilizat în mod obișnuit ca reactiv pentru metilarea aminelor, fenolilor și tiolilor.

Sinteza transdimerului
Un proces care permite introducerea nucleotidelor în fața unei pirimidine

. Deoarece acest proces nu se bazează pe împerecherea de baze complementare, pot fi inserate perechi de baze greșite, rezultând o mutație.

captopropanol, un antidot pentru otrăvirea cu arsenit care reacționează cu acidul lipoic redus.
Reveniți la pagina de căutare
Dacă cunoașteți termeni care au fost omise din acest glosar pe care credeți că ar fi util să îi includeți, vă rugăm să trimiteți detalii la Biroul editorial de la GenScript.

Activarea activează secțiunea tirozin-kinazei a receptorilor, fiecare dintre care apoi adaugă fosfat din ATP la coada de tirozină a celeilalte polipeptide.
Proteinele receptorului complet activate activează o varietate de proteine ​​releu specifice care se leagă de molecule specifice de tirozină fosforilate.

model.[35] Acest model a presupus că o singură moleculă de PrPSc se leagă de o singură moleculă de PrPC și catalizează conversia acesteia în PrPSc.

s
Din fericire, majoritatea celulelor sunt capabile să repare ADN-ul deteriorat. Acest lucru poate fi realizat în două moduri: enzimele de reparare numite fotoliază pot rupe legătura covalentă, folosind lumina ca sursă de energie pentru scindarea legăturii.

- O formă de deteriorare a ADN-ului care rezultă din radiații. Timinele adiacente de pe aceeași catenă de ADN formează o legătură care are ca rezultat un aduct voluminos care poate împiedica replicarea ADN-ului.

și, în funcție de identitatea partenerului său, va activa un set diferit de gene.

cu o altă moleculă de etilenă, apoi legăturile duble de carbon din acea moleculă de etilenă se rup și găsesc o altă moleculă de etilenă cu care să interacționeze și să formeze un trimer, sau o moleculă de trei unități, și așa mai departe până când ajungi cu un polimer foarte lung.

Două dintre unitățile monomerice formează o bobină spiralată

Repararea exciziei nucleotidelor este deosebit de importantă în corectarea timinei

, două nucleotide de timină adiacente una cu cealaltă pe o catenă sunt legate covalent una de alta, mai degrabă decât bazele lor complementare.

Studiile cinetice au indicat că EI acționează ca a

, pentru a hidroliza PEP în piruvat și fosfat anorganic, deși nu la fel de eficient ca EI de lungime completă.

Proteine ​​cu fermoar leucină O familie de proteine ​​care leagă ADN-ul care necesită a

ize în virtutea unei regiuni alfa elicoidale care conține leucină la fiecare a șaptea poziție. Pentru că 3.

domeniul de izare și o legare de ADN N-terminal
domeniu.
Zinc-finger - un motiv conservat de legare a ADN-ului compus din domenii proteice pliate.

conţine o tubulină alfa şi o beta). Microtubulii joacă un rol în diviziunea celulară, sunt componente ale cililor și flagelilor și formează, de asemenea, centrioli.
Citoscheletul și mișcarea celulelor - Diversitatea imaginii: microtubuli tubulin .

Cisteina poate reacționa cu ea însăși pentru a forma o substanță oxidată

Motiv structural comun la unele

domeniul de izare și domeniul N-terminal de legare la ADN. (Figura 10-43)
leucemie
Cancerul globulelor albe și precursorii lor.

Motivul structural cunoscut sub numele de fermoar-leucină constă dintr-o regiune de repetare a leucinei, care formează o spirală alfa cu o regiune hidrofobă responsabilă pentru

de subunităţi de 34 kD. Leagă actina cu Kd de aproximativ 25M.
Recuperate de la ""
Cereri de publicitate.

Proteina care formează microtubuli, polipeptidele de 55 kd ale α-tubulinei (alfa-) și β-tubulinei (beta-) formează o a

, care este subunitatea de bază a microtubulilor. Un al treilea tip de tubulin γ-tubulină (gamma-) este situat la centrozom. Citoscheletul 2 Microtubuli
factor de necroză tumorală
(factor de necroză tumorală, TNF).

Mutație dominantă negativă: O mutație dominantă (heterozigotă) pe o alele care blochează activitatea proteinei de tip sălbatic încă codificată de alela normală (adesea prin

ising with it) provocând un fenotip de pierdere a funcției. Fenotipul nu se distinge de cel al mutației dominante homozigote.

repararea prin excizie Mijloace prin care celulele sunt capabile să repare anumite tipuri de daune (

pirimidinele izate) în ADN-ul lor.
excitație Mișcarea electronilor cauzată de lumina care lovește molecula de clorofilă.

[L. carbo, cărbune + hidro, apă]
Un zahăr (monozaharid) sau unul din el

s (dizaharide) sau polimeri (polizaharide).
ciclul carbonului .

AP-1 este de fapt un complex între proteina c-fos și proteina c-jun, sau uneori este doar c-jun

s. Secvența consens al situsului AP-1 este (C/G)TGACT(C/A)A. Cunoscut și ca element de răspuns TPA (TRE). [TPA este un ester de forbol, tetradecanoil acetat de forbol, care este un promotor chimic al tumorii].

Microtubulii sunt mici cilindri goli (25 nm în diametru și de la 200 nm-25 µm în lungime). Acești microtubuli sunt formați dintr-o tubulină proteică globulară. Asamblarea aduce împreună cele două tipuri de tubulină (alfa și beta).

s, care se aranjează pe rânduri.

de către enzimele reparatoare, de exemplu, radiația ultravioletă poate provoca daune, deoarece face ca două timine învecinate din secvența ADN să se unească una cu cealaltă în loc să se unească cu adeninele vizavi de ele și apoi când enzimele de reparare le elimină pe cele două unite. timine sau timină


DISCUŢIE

În acest studiu, demonstrăm că FOXA1 poate forma un homodimer dependent de ADN în prezența unui element ADN palindromic cu semi-siti-uri suprapuse. Spre deosebire de alte TF-uri, cum ar fi SOX9, care formează dimeri pe elemente compozite distanțate flexibil ( 39), dimerizarea FOXA1 se bazează pe o distanță precisă de jumătate de loc. Interesant, motivul DIV a fost de asemenea detectat, dar nu a fost validat, folosind metil-SELEX cu FOXA1 de lungime completă (33) și SELEX de mare capacitate (32) pentru membrii subfamiliei FOXC. În plus, am observat că într-o structură cristalină recent raportată a FOXO1 legat de ADN un aranjament de elice de ADN stivuite cristalografic asemănătoare configurației DIV (Figura suplimentară S7) (75). Cu toate acestea, autorii nu au testat formarea de dimeri cooperanți pe un astfel de element. În cele din urmă, studiile de secvențiere ChIP-exonuclează au indicat prezența diferitelor forme de compozit cap de furcă elemente. În primul rând, au fost raportate două site-uri cu cap de furcă grupate (numite mesas) care seamănă cu un element CON distanțat larg (Figura 1A) (31). În al doilea rând, a fost observată o semnătură DIV în datele ChIP-exo ale receptorului de glucocorticoizi (GR) care arată semnături de legare cooperativă și implică roluri ale DIV pentru recrutarea GR la cromatină (30).În mod colectiv, motivul DIV ar putea fi utilizat pe scară largă cap de furcă secvență de recunoaștere relevantă pentru TF dincolo de FOXA1. În consecință, SNP-urile GWAS care modifică dimeri raportate aici ar putea provoca consecințele lor fenotipice prin perturbarea programelor de reglementare ale oricărui cap de furcă proteină. SNP-urile rs2941742 și rs541455835 sunt cei mai interesanți candidați pentru un cap de furcă mecanismul bolii asociat. Ele se localizează la amplificatorul distal al ESR1 și HARTĂ gene, care sunt legate de osteoporoză sau, respectiv, boala Parkinson. Alela de risc de osteoporoză rs2941742[G] duce la o scădere de aproape 100 de ori a cooperării homodimerului FOXA1 și provoacă o expresie deprimată a genei reporter. În timp ce FOXA1, din cunoștințele noastre, nu a fost implicat în osteoporoză, grupul FOXO joacă un rol important în metabolismul osos prin reglarea echilibrului redox, a sintezei proteinelor și a diferențierii în descendența osteoblastelor (revizuit în (76)). În mod similar, alelele de risc rs541455835 promovează modularea expresiei genelor prin perturbarea homodimerizării FOXA1. Mai multe studii au descoperit că SNP-urile GWAS originale legate de SNP-urile care modifică dimerul (rs2941740 pentru rs2941742 rs17577094 pentru rs67668514) au fost asociate cu eQTL-uri ( 77, 78). Important, rs17577094 nu afectează numai HARTĂ expresia genelor în creier, dar și în alte țesuturi, inclusiv sânul, unde locusul rs67668514 prezintă semnale puternice FOXA1 ChIP-seq. De asemenea, am descoperit că rs767441[C], care este unul dintre SNP-urile asociate riscului de cancer de sân raportate de Cowper-Sallari et al (26), a distrus legarea dimerică fără a modifica afinitatea pentru legarea monomerică. Studiile de editare a genomului oferă mijloacele de a testa dacă perturbă cap de furcă Dimerizarea DBD pe loci asociați bolii influențează progresia bolii. În mod colectiv, identificarea SNP-urilor asociate bolii în regiunile genomice de reglementare care reduc dimerizarea FOXA1 și perturbă expresia genei reporter coroborează ipoteza noastră că dimerizarea FOXA1 este critică pentru funcția sa de reglare și contribuie la progresia bolii.

Deși am arătat că configurațiile FOXA1/DIV sunt legate de gene foarte exprimate, aceste evenimente de legare nu par să acționeze ca un simplu amplificator transcripțional. În consecință, efectele alelelor minore ale SNP-urilor studiate sunt diverse. Testele reporterului au arătat că prezența alelelor minore ar putea duce la niveluri de expresie crescute, reduse sau neschimbate în raport cu alelele majore (Figura 6E, F și I). De asemenea, atunci când expresia eQTL-urilor este comparată între țesuturi, alela minoră poate fi asociată cu niveluri de expresie crescute într-un țesut, dar cu niveluri de expresie reduse în altul (Figura suplimentară S6B). Acest lucru implică faptul că rezultatele de reglementare ale complexelor FOXA1/DIV sunt dependente de secvența generală, precum și de contextul celular. De exemplu, dacă un complex FOXA1/DIV recrutează co-activatori sau represori ar putea fi influențat de secvențele periferice și schimbarea de la o celulă la alta. Asocierea secvențelor DIV cu dinamica deschis-închis a cromatinei sugerează un rol al complexului FOXA1/DIV în remodelarea cromatinei. O întrebare importantă este dacă consecința reglatoare a dimerilor FOXA1 pe motivele DIV este diferită de alte configurații, cum ar fi monomerii, heterodimerii sau homodimerii pe secvențele CON. În mod clar, am identificat potențiatori care se bazează pe dimerii FOXA1/DIV pentru activitatea lor. O posibilitate intrigantă este că motivul DIV nu numai că afectează puterea și dinamica legării, dar are și efecte calitative. Un posibil mecanism este acela că numai atunci când este legat de secvențele DIV, FOXA1 ar recruta un set de co-factori care, la rândul lor, pot declanșa transactivarea, bucla cromatinei sau setarea mărcilor epigenetice într-o manieră dependentă de tipul celulei. Prin contrast, configurațiile alternative FOXA1 induse de alte motive ADN ar putea duce la procese nucleare disparate. Un astfel de mecanism ar putea explica activitățile specifice contextului ale TF-urilor master, cum ar fi FOXA1, permițându-le să regleze diferite seturi de gene într-o multitudine de celule și în diferite stadii de dezvoltare. În mod colectiv, homodimeric FOXA1 contribuie în mod critic la peisajul său de legare genomică și la activitatea sa de reglare, probabil prin influențarea dinamicii cromatinei și prin modularea interatomului său.



Comentarii:

  1. Lazaro

    Această condiționalitate, nici mai mult, nici mai puțin

  2. Clifland

    Scuză, m -am gândit și am eliminat ideea

  3. Cinwell

    ce fraza emotionanta :)

  4. Melvin

    În opinia mea, greșești. Pot dovedi asta. Scrie -mi în pm.

  5. Boulboul

    Lasă-l pe scrib să meargă la cartea de recorduri

  6. Murry

    Ce frază magnifică

  7. Kameron

    Sunt capabil să vă sfătuiesc cu privire la această problemă. Împreună putem veni cu un răspuns corect.



Scrie un mesaj