Informație

De ce este utilizată în mod obișnuit beta actina ca control în Western blot?

De ce este utilizată în mod obișnuit beta actina ca control în Western blot?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Este vorba despre întrebarea western blot. Lucrarea: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1931312813001145. În experimentul Western blot din această lucrare, ei folosesc beta actina ca control. Și, de asemenea, am văzut și alte lucrări de cercetare care folosesc beta actina ca control. Deci, de ce se folosește beta actina, nu altă genă? este pentru că se exprimă în toate tipurile diferite de celule?


β-actina aparține unei clase de gene numite gene menajere. Proteinele lor îndeplinesc în mod obișnuit funcții care sunt necesare pentru toate tipurile de celule (de exemplu, β-actina face parte din microfilamentele citoscheletului) și sunt presupus * să nu fie afectat de condiţiile experimentale. În Western blotting, acestea sunt executate ca un „control de încărcare” pentru a arăta că s-au încărcat cantități foarte similare de proteine ​​pe fiecare bandă. Acest lucru este absolut esențial în unele sisteme experimentale în care este posibil să nu fie posibil să colectați întotdeauna exact același număr de celule pentru fiecare probă, cum ar fi atunci când lucrați cu celule primare, probe de țesut sau sisteme în care este posibil să modificați sinteza proteinelor, dimensiunea celulei. /număr sau apoptoză.

Există multe controale de încărcare diferite din care puteți alege, iar unele pot fi dictate de tipul de celulă/țesut pe care îl examinați - de exemplu, atunci când lucrați cu celule stem, poate doriți să arătați că condițiile experimentale nu au indus diferențiere în celule, astfel încât un marker de pluripotență precum Oct-4A sau Sox2 poate fi ales. În alte cazuri, este posibil să examinați lizate fracționate (un preparat membranar, doar nucleele, mitocondriile, doar fracția solubilă etc.) și, prin urmare, puteți alege Na/K ATPaza, Histone H3, COX IV sau respectiv GAPDH.

Alegerea controlului de încărcare poate fi, de asemenea, influențată de mărimea proteinei (proteinelor) pe care le analizați, deoarece investigatorii fie îndepărtează Western blots și le reproșează cu controlul de încărcare, fie rulează două specii diferite și detectează cu diferite culori. anticorpi secundari la efectuarea westernurilor fluorescente. În ambele cazuri, doriți ca controlul de încărcare să aibă o dimensiune diferită față de obiectivele inițiale.

În cele din urmă, toate acestea presupun că cercetătorul a încercat deja să încarce cantități egale de proteine ​​totale pe bandă utilizând oricare dintre o varietate de metode pentru cuantificarea concentrației de proteine. Acestea includ testele de tip Bradford, Lowry și BCA, care pot fi sau nu compatibile cu detergentul, colorarea membranei după transfer cu coloranți precum Ponceau S, SYPRO Ruby sau cerneala de India sau colorarea gelului cu Coomassie sau alt tip Western Western. pete compatibile.

*În realitate, unii oameni de știință devin din ce în ce mai conștienți de faptul că multe experimente de fapt do afectează o serie de gene „de întreținere”, dar atunci când majoritatea văd variații, de exemplu, Western blot sau qPCR, ei aleg adesea un control de încărcare diferit de utilizat.


Controlul beta-actinei oferă asigurarea că efectul pe care îl vedeți în exprimarea proteinelor nu se datorează modificării generale a sintezei proteinelor.

De exemplu, dacă studiezi o anumită boală, aceasta ar putea cauza modificarea metabolismului, pierderea în greutate, pierderea capacității de a sintetiza diferite proteine ​​sau de a absorbi aminoacizi din dietă. Trebuie să controlezi asta și ceva la fel de universal precum actina este o opțiune.


Controalele de încărcare sunt utilizate în mod obișnuit în tehnicile de electroforeză pe gel, cum ar fi western blotting, pentru a verifica dacă liniile de gel au fost încărcate uniform cu material de probă și sunt de obicei utilizate pentru a standardiza rezultatele acestor studii. Deoarece proteinele din controalele de încărcare sunt exprimate abundent, ele permit, de asemenea, anchetatorilor să determine dacă există un transfer uniform pe întregul gel. Un control de încărcare este absolut necesar atunci când western blot sunt pregătite pentru publicare.

Origine: Celula intreaga / citoplasmatic
Greutate moleculară (kD): 43
Beta actina este una dintre cele șase izoforme ale actinei. Actina este o proteină globulară, de aproximativ 42 kDa, care se găsește în toate celulele eucariote (cu excepția spermei de nematod), unde poate fi prezentă la concentrații de peste 100 microM. Este, de asemenea, una dintre cele mai bine conservate proteine, diferă cu nu mai mult de 20% în specii la fel de diverse precum algele și oamenii. Este subunitatea monomerică a microfilamentelor, una dintre cele trei componente majore ale citoscheletului, și a filamentelor subțiri, care fac parte din aparatul contractil din celulele musculare. Astfel, actina participă la multe funcții celulare importante, inclusiv contracția musculară, motilitatea celulară, diviziunea celulară și citokineza, mișcarea veziculelor și organelelor, semnalizarea celulară și stabilirea și menținerea joncțiunilor celulare și a formei celulei. Acest control al încărcării nu este potrivit pentru mostrele de mușchi scheletici. Schimbările în condițiile de creștere celulară și interacțiunile cu componentele matricei extracelulare pot altera sinteza proteinei actinei (Farmer și colab., 1983).


Ce sunt genele menajului?

Genele menajere sunt numite așa deoarece exprimă proteine ​​ale căror funcții sunt pentru menținerea funcțiilor de bază ale celulelor. Se crede că acestea sunt exprimate constitutiv cu puține modificări ale modelului de expresie.

Genele comune utilizate pentru a normaliza Western blot includ: gliceraldehidă 3-fosfat dehidrogenază (GADPH), beta-actină, tubulină sau proteina de șoc termic 90 (HSP90).

Se pare că ar trebui să fie un control bun, dar există câteva motive majore pentru care genele de menaj vă pot da probleme.


Care sunt cele mai utilizate controale de încărcare pentru Western Blotting?

Anticorpii de control al încărcării sunt unii dintre cei mai utilizați anticorpi în cercetare. Anticorpii împotriva mai multor ținte diferite sunt utilizați în mod obișnuit și nu este întotdeauna evident care ar trebui să alegeți. Oferim un ghid pentru unele dintre cele mai frecvent utilizate tipuri de anticorpi de control al încărcării.

De ce am nevoie de un control de încărcare pentru Western blot?

  • Controalele de încărcare sunt esențiale pentru Western Blots demne de publicare. Ele vă permit să verificați dacă încărcarea proteinelor este aceeași pe gel, nivelul de expresie al controlului de încărcare nu ar trebui să varieze între diferitele benzi de probă.
  • De exemplu, ele pot fi folosite pentru a verifica dacă a existat un transfer uniform de la gel la membrană pe întregul gel.
  • Acest lucru ajută la protejarea împotriva a ceea ce este cunoscut sub numele de „efectul de margine”, adică atunci când se utilizează un număr mare de benzi, proteinele din benzile exterioare se transferă pe membrană într-o poziție apropiată de cadru. Acest lucru poate duce la pete mai intense la margine decât în ​​mijlocul gelului. Controalele de încărcare pot arăta dacă acest lucru a avut loc și permite luarea în considerare a acestei variații.
  • Odată ce ați stabilit că nu există diferențe mari în nivelurile de proteine, controalele de încărcare pot fi utilizate normaliza mici variații ale nivelurilor. Ele pot fi utilizate pentru a cuantifica cantitățile de proteine ​​din fiecare bandă și pentru a normaliza nivelurile de expresie ale proteinei dvs. de interes pentru controlul de încărcare

Ce să cauți într-un control de încărcare?

Ce face un control bun de încărcare vă întrebați? Ar trebui să căutați proteine ​​care prezintă un nivel ridicat de expresie constitutivă în tipul de celulă pe care îl examinați, deoarece aceasta înseamnă că va avea niveluri constante de expresie ridicate. Din acest motiv, genele „de menaj” sunt frecvent alese ca controale de încărcare. În al doilea rând, proteina dumneavoastră de control al încărcării ar trebui să aibă o greutate moleculară diferită de proteina de interes, astfel încât benzile sunt distincte și nivelurile de expresie ale proteinei dumneavoastră sunt cuantificabile.

Așa că, pentru a vă ajuta, ne-am gândit să descriem cele mai bune nouă comenzi de încărcare și să vă oferim link-uri către căutările acestor comenzi de încărcare aici pe CiteAb, pentru a ne asigura că o găsiți pe cea mai bună.

Proteine ​​celulare întregi și citoplasmatice

Potrivit pentru – extracte de celule întregi și citoplasmatice

Nu este potrivit pentru – mostre de mușchi scheletici

Scurtă descriere – Actina vine în trei forme principale diferite. Alfa-actina este o componentă majoră a aparatului contractil din mușchiul scheletic. Actinele beta și gama sunt prezente în majoritatea tipurilor de celule, unde sunt responsabile pentru traficul celular, motilitatea și structura.

Actina se găsește în toate celulele eucariote, cu excepția spermei nematode. Gameții lor masculini nu pot înota, ci mai degrabă fac mișcări amibiene pentru a se deplasa către ou. În mod neobișnuit, ei nu folosesc actină pentru aceasta, care este cea mai comună proteină folosită pentru a face mișcări amebiane în celule, ei folosesc proteina MSP.

Potrivit pentru – extracte de celule întregi și citoplasmatice

Scurtă descriere – Servește la descompunerea moleculelor de glucoză și carbon, acționând ca un catalizator în timpul celei de-a șasea etape a glicolizei. Se găsește în majoritatea tipurilor de țesuturi și celule, deși expresia poate diferi între țesuturi.

Hipnoxia, diabetul și unele tipuri de cancer pot crește expresia GAPDH.

Potrivit pentru – extracte de celule întregi și citoplasmatice

Greutate moleculară – 50 – 55kD

Scurtă descriere – Componenta majoră a microtubulilor, tubulina este exprimată în mod înalt și în mod constant între specii. Microtubulii sunt implicați în menținerea formei celulelor și a poziționării organelelor. Ele sunt, de asemenea, importante în diviziunea celulară, inclusiv în formarea fusurilor mitotice.

Medicamentele antimicrobiene și antimitotice pot afecta expresia tubulinei.

Proteinele mitocondriale

Potrivit pentru – proteine ​​mitocondriale

Scurtă descriere – Proteina 1 a canalului selectiv de anioni dependentă de tensiune este, de asemenea, denumită porină 31 HL/HM sau porină plasmalimală. Exprimate în țesuturi și conservate între specii, VDAC1 sunt proteine ​​​​beta baril care traversează membrana celulară, acționând ca un por prin care moleculele pot difuza.

Potrivit pentru – proteine ​​mitocondriale

Scurtă descriere – Anticorpul COX IV (numit „Cox 4”) este reactiv cu proteina COX IV, exprimată în general la un nivel ridicat constant, acest anticorp face un control eficient al încărcării mitocondriilor. Cu toate acestea, rețineți că multe proteine ​​rulează la aceeași greutate moleculară ca COX IV, VDAC1 reprezintă o bună alternativă de control al încărcării mitocondriale pentru proteinele de această dimensiune.

Proteinele învelișului nuclear

Potrivit pentru – Proteinele anvelopei nucleare

Scurtă descriere – Familia de proteine ​​​​lamine alcătuiește lamina nucleară - o matrice bidimensională de proteine ​​găsită lângă membrana nucleară interioară. Foarte conservate între specii, proteinele lamină sunt considerate a fi implicate în stabilitatea nucleară, structura cromatinei și expresia genelor. Acest control al încărcării nu este potrivit pentru experimentele în care învelișul nuclear a fost îndepărtat.

Potrivit pentru – proteine ​​nucleare

Scurtă descriere – Proteina de legare TATA (TBP) este un factor de transcripție care se leagă în mod specific la cutia TATA, o secvență de ADN găsită în regiunea promotoare a genelor arheale și eucariote. Ajută la poziționarea ARN polimerazei II peste locul de transcripție la începutul genei, dar se găsește doar în 10-20% dintre promotorii umani care au cutii TATA, așa că probabil nu este singura proteină implicată în poziționarea ARN polimerazei II.

Potrivit pentru – proteine ​​nucleare

Scurtă descriere – O histonă de bază implicată în structura nucleozomală a cromatinei la eucariote, Histone H2B are un domeniu globular principal și o coadă lungă N-terminală.

Potrivit pentru – proteine ​​nucleare

Scurtă descriere – O proteină foarte conservată, PCNA ajută la creșterea procesivității sintezei catenei principale în timpul replicării ADN-ului. PCNA este rapid degradat atunci când sunt activate căile de deteriorare a ADN-ului.

Deci, asta este tot de la noi –, vă rugăm să lăsați un comentariu dacă există comenzi de încărcare pe care le-ați recomanda cu căldură.


REZULTATE

Validarea PCR competitivă

Titrarea fiecărei gene concurente de întreținere față de alicote constante de ADNc al celulelor fluide BAL în experimentele de schimbare a raportului a arătat că, în fiecare caz, rapoartele au urmat linia prezisă pentru rapoarte de ieșire mai mari de aproximativ 0,1 (fig 1). În mod similar, titrarea în serie a cARN-ului pAW109 concurent IL-2 împotriva ARN-ului PBMC stimulat de PHA, urmată de RT-PCR ulterioară, a produs rapoarte de ieșire care s-au schimbat proporțional cu rapoartele de intrare. Astfel, produsele GAPDH, β-actina și IL-2 PCR au concurat în mod egal cu șabloanele concurente respective, permițând calcularea copiilor de intrare ale ARNm.

Test de eficiență egală de amplificare a PCR competitivă prin titrarea concurentului. (A) PAGINA RT-PCR competitivă IL-2 a seriei de raporturi de intrare în schimbare cu cantitatea crescândă de concurent de la stânga la dreapta. (B)–(D) Rapoartele nativ/competitor de ieșire ale fiecărei serii sunt reprezentate în raport cu rapoartele de intrare în raport cu unul sau două rapoarte de ieșire cele mai apropiate de 1. Datele reale se află aproape de linia de predicție unde rapoartele de ieșire sunt egale cu rapoartele de intrare. Linia de predicție este indicată printr-o linie întreruptă cu o pantă de 1. (B) RT-PCR IL-2 duplicat au fost efectuate timp de 35 și 40 de cicluri. Titrarile de β-actină (C) și GAPDH (D) au fost replicate (obiecte deschise și închise) la 40 de cicluri.

Expresia genei GAPDH și β-actină

Nivelurile de GAPDH și ARNm de β-actină au fost corelate semnificativ în ambele țesuturi de biopsie (r 2 = 0,48, n = 85, p = 0,0001) și celule fluide BAL (r 2 = 0,51, n = 97, p = 0,0001 fig. 2A și B). Coeficienții de corelație indică faptul că doar jumătate din variabilitatea unuia este explicată de celălalt, sugerând că la rezoluția acestei metodologii nivelurile de ARNm de GAPDH și β-actină nu sunt echivalente. În plus, expresia genei GAPDH a fost mai variabilă în probele de biopsie și a fost de aproximativ cinci ori mai mică în celulele fluide BAL decât expresia β-actinei.

Corelații Pearson între expresia genei GAPDH și β-actină în ARN din celulele fluide BAL (A) și țesutul de biopsie (B).

Comparații transversale ale expresiei genelor

Expresia genică a β-actinei și a GAPDH a fost comparată în ceea ce privește starea atopică, starea astmatică și utilizarea ICS. Expresia genei GAPDH în probele de biopsie de la subiecți astmatici care nu utilizează ICS (media celor mai mici pătrate (SE) 8,1 (1,3) × 10 5 copii ARNm/μg ARN) a fost semnificativ mai mică decât în ​​specimenele de biopsie de la martorii normale (1,1 (0,1) × 10 7 copii ARNm/μg ARN, diferență mediană 1,0 × 107, interval de încredere 95% (IC) 0,68 până la 1,4 × 107, p=0,0001) și de la subiecți astmatici care utilizează ICS (1,2 (0,2) × 107 copii ARNm/μg ARN , diferența mediană 1,1 × 10 7 , 95% CI 0,71 până la 1,5 × 10 7 , p= 0,0001, fig 3A). Subiecții astmatici ca grup, indiferent dacă au luat sau nu ICS, au fost semnificativ diferiți de martori (7,1 (1,9) × 106 copii mARN/μg ARN, diferență mediană 3,9 × 106, IC 95% 1,9 până la 5,9 × 106, p= 0,0003). Nivelurile celulelor BAL de β-actină și ARNm GAPDH au arătat diferențe similare între grupuri ca și nivelurile de ARNm GAPDH din biopsie, cu valorile p corespunzătoare (fig 3B și D). Aceste diferențe în expresia genelor sunt în contrast cu profilul tipurilor de celule din lichidul BAL, care nu diferă semnificativ între grupurile de pacienți (tabelul 2).

Profilurile principalelor tipuri de celule din probele de celule fluide BAL*

Comparații transversale ale expresiei genei GAPDH și β-actină. Expresia genei GAPDH în (A) țesutul de biopsie și (B) celulele fluide BAL. Nivelurile de ARNm de β-actină în (C) țesutul de biopsie și (D) celulele fluide BAL. Nivelurile de ARNm din țesutul de biopsie au fost corectate pentru contaminarea cu secvențe pseudogene. Micile diferențe dintre numărul de puncte de date din figuri și numărul de probe din tabelul 1 se datorează procentului mic de reacții eșuate așteptate. Reacțiile eșuate nu au fost repetate pentru a reduce potențialul de părtinire sistematică.

Expresia ARNm a β-actinei în țesutul biopsiei a fost diferită prin aceea că astmaticii care luau ICS erau similari cu cei care nu erau pe ICS (p=0,26, fig. 3C). Cu toate acestea, în comun cu celelalte comparații, controalele normale (1,5 (0,1) × 107 copii ARNm/μg ARN) au avut niveluri mai mari de ARNm de β-actină decât subiecții astmatici care nu au luat ICS (8,1 (1,4) × 106 copii ARNm/μg ARN, diferență mediană 6,9 × 106, 95% CI 3,4 până la 10 × 106, p=0,001) și niveluri mai mari decât toți astmaticii (9,3 (1,5) × 106 copii mARN/μg ARN, diferență mediană 5,7 × 106, 95% CI 1,4 până la 10 × 106, p=0,013).

Efectul utilizării genelor menajere ca numitori

Pentru a demonstra efectul utilizării β-actinei și GAPDH ca numitori ai expresiei ARNm pentru genele de interes, PCR competitivă IL-2 a fost efectuată pe ARN-ul celulei BAL utilizând aceeași reacție cADN ca și pentru β-actină și GAPDH. Nivelurile de ARNm de IL-2 în celulele BAL nu au fost diferite între controalele normale (4,6 (0,9) × 104 copii/μg ARN), astmaticii care nu utilizează ICS (4,8 (1,2) × 104 copii/μg ARN) și astmaticii care au luat ICS (3,0 (0,7) × 104 copii/μg ARN fig. 4). Cu toate acestea, atunci când nivelurile de ARNm de IL-2 au fost exprimate ca raport cu β-actină, au existat diferențe semnificative, astmaticii care nu folosesc ICS având un raport mai mare (1,2 (0,4) × 10 –3) decât martorii normali (6,2 (1,8) × 10 –4, diferență mediană 9,24 × 10 –4, IC 95% 0,95 până la 21,0 × 10 –4, p=0,03) și astmatici care utilizează ICS (4,5 (0,9) × 10 –4, diferență mediană 1,1 × 10 –3, 95 % CI 0,3 până la 2,1 × 10 –3, p=0,003). Astfel, diferențele aparente în raporturile IL-2/p-actină sunt confundate de diferențele dintre nivelurile de ARNm de p-actină între grupuri (fig. 4).

Efectul utilizării β-actinei ca numitor al nivelurilor de ARNm al celulelor fluide IL-2 BAL. Pentru a compara nivelurile de ARNm de IL-2 și p-actină și rapoartele acestora, mediile celor mai mici pătrate ale grupurilor de subiecte sunt prezentate ca procente ale mediei celor mai mici pătrate de control normal respectiv. Barele de eroare sunt date ca procentaj SE. *S-au observat diferențe semnificative pentru β-actină (ca în fig. 3D), iar raporturile IL-2/β-actină la subiecții astmatici care nu folosesc corticosteroizi inhalatori (ICS) sunt semnificativ diferite de martorii normali (p=0,03) și de subiecții astmatici care utilizează ICS (p=0,003).


Două benzi pentru actină? - (22.02.2008)

As vrea sa stiu daca este normal sa ai doua benzi pentru actina. Am încercat cu 2 anticorpi. Am testat în culturi primare de astrocite și probe de canal deferent de șobolan și am primit doar o bandă cu un anticorp (care nu este al meu), dar cu anticorpul meu am primit două benzi pentru astrocite și una pentru canalul deferent de șobolan. Cele două benzi sunt atât de asemănătoare ca formă și intensitate și atât de apropiate ca greutate moleculară, încât par a fi două izoforme ale proteinei, dar nu am văzut niciodată asta în lucrări. Nu pot fi date probe pentru că eu testasem aceleași probe cu cei doi anticorpi și rezultatele au fost cele descrise. Și nu pare să fie o bandă nespecifică, pentru că atunci când diluez primarul, ambele benzi dispar. Este cineva care ma poate ajuta?
Mulțumesc.

Ambii anticorpi recunosc aceeași izoformă de actină? În mod normal, folosesc beta actină ca control de încărcare pentru western blot.

Ei bine, în ambele fișe de date se spune că anticorpii recunosc o gamă largă de izoforme, dar nu specifică care izoforme. De fapt, ambii sunt anticorpi policlonali, dar petele prezente în fișele de date arată doar o bandă pentru ambii. Eram convins că acest gen de tehnică nu permitea distingerea izoformelor (folosesc un gel de poliacrilamidă 12%) și ar fi necesar să rulez o PAGINA 2D (IEF+SDS-Page).

Ei bine, în ambele fișe de date se spune că anticorpii recunosc o gamă largă de izoforme, dar nu specifică care izoforme. De fapt, ambii sunt anticorpi policlonali, dar petele prezente în fișele de date arată doar o bandă pentru ambii. Eram convins că acest gen de tehnică nu permitea distingerea izoformelor (folosesc un gel de poliacrilamidă 12%) și ar fi necesar să rulez o PAGINA 2D (IEF+SDS-Page).

Anticorpii policlonali pot fi notori pentru legarea la proteinele neînrudite. Dacă există un anticorp monoclonal pe care îl puteți pune pe mâna, ar trebui să vă ajute. Am un iepure policlonal anti HIF-1a care se leagă de Igg, precum și de markerul de scară pre-pătat de 50 kda al pescarului. Deci, indiferent de ceea ce fac, primesc benzi nespecifice în locuri în care știu că nu ar trebui să existe urme de HIF-1a și, mai mult, acest anticorp policlonal de iepure are o afinitate mare pentru unele igg și BSA. Deci, dacă blochez membrana cu BSA în loc de lapte, primesc o petă neagră, deoarece primarul se lipește de tot.


Western blot sunt „semi” cantitative? - (29.11.2011)

Ce înseamnă cantitativul „SEMI”? că nu cuantifică complet proteinele?

Cu software-urile pentru a analiza intensitățile și volumele benzilor, ar fi pe deplin cantitativ?

Cât de obișnuit este folosirea westernurilor pentru a cuantifica expresia proteinelor?

Înseamnă că aveți nevoie de o curbă standard cu cantități cunoscute pentru a vă compara necunoscutele cu ceva. De aceea este semicantitativ. În metodele cantitative măsurați sau cuantificați o cantitate direct, de ex. timpul de cântărire sau măsurare. Niciun software nu te poate ajuta. Este ceea ce este.
Este destul de obișnuit să folosești western pentru a cuantifica expresia proteinelor, atâta timp cât ești conștient de deficiențele.

BioMiha on Tue Nov 29 18:37:25 2011 a spus:

Ați avea întotdeauna nevoie de o „curbă standard” pentru analiza WB? Sau puteți folosi suficient control adecvat - raportul de proteine ​​din menaj și controlul interiorizat? Software-ul pe care îl folosesc măsoară volumul/intensitatea benzii.

Hola, răspunsurile de mai sus sunt să cunoașteți concentrația de proteine ​​​​în funcție de intensitatea benzii și, probabil, ar fi mai bine să aveți o curbă standard, dar în alte cazuri, ca rata de fosforilare a proteinelor, care îmi imaginez că este domeniul dvs., prin alte întrebări din partea dvs. forum, aici comparăm intensitatea benzii proteice fosforilate cu banda defosforiată și văzând astfel rata de inhibare a oricărei molecule, pentru mai multă acuratețe ai putea să raportezi asta la banda de actină ca control al încărcării, dar pentru mine nu este necesar. , dacă cantitatea de proteine ​​încărcate este similară

Puteți încerca, dar veți constata că rezultatele sunt foarte variabile. Trebuie să puteți încărca aceeași cantitate de proteine ​​totale în fiecare bandă, să le transferați pe toate în mod uniform și apoi să obțineți expuneri frumoase care nu sunt supra sau sub expuse în mod constant pentru fiecare membrană pe care o rulați. Am descoperit că este aproape imposibil să obțin rezultate exact aceleași (sau chiar similare) pentru aceleași lizate rulate în același timp pe geluri diferite, transferate în același timp în același aparat de blot și testate în aceleași soluții. cu toate condițiile identice.

bob1 on Tue Dec 6 03:11:06 2011 a spus:

Ce zici de folosirea unei gene de menaj ca control? De exemplu. actină, tubulină, GAPDH.

De asemenea, mi s-a spus să rulez benzi de control care sunt comune tuturor membranelor (de exemplu, folosiți un control pozitiv) pentru a controla orice diferență de manipulare între geluri.

Cealaltă întrebare a mea este: atunci când rulați mai multe camere de transfer, care sunt setările de care trebuie să aveți grijă (adică curent constant sau tensiune constantă?)?

Încearcă și vezi - experiența mea personală (10 ani) este că nu funcționează între geluri, indiferent cât de bun ai fi la western, chiar și cu menajere, decât dacă poți reduce variațiile în transferuri, expuneri, pași de anticorpi, spălări. , etc.

bob1 pe vineri, 9 decembrie 02:42:38 2011 a spus:

Mulțumesc pentru sfat, bob1! 10ish ani care fac western blot te face un profesionist!

Deci, nu ați folosi westernurile pentru a cuantifica proteinele, ci doar le-ați folosi ca indicator calitativ dacă expresia proteinei este reglată în sus sau în jos pe baza intensității benzii? Deci, să spunem că dacă am n = 10, aș rula n = 1 ca un „blot reprezentativ”? sau rulați toate n=10?

Da, calitativ așa l-aș numi. Cu siguranță funcționează pentru tendințele generale, dar nu veți obține concentrații absolute din asta, sunt prea multe variabile cu care să lucrați. Presupun că ar putea funcționa dacă ați putea adăuga cantități cunoscute ale unei anumite proteine ​​pe gel și ați compara, la fel cum ați face pentru qPCR.

bob1 pe vineri, 9 decembrie 23:29:15 2011 a spus:

Ceva de genul unei curbe standard cu BSA.

Singura metodă de cuantificare a expresiei proteinei la care mă pot gândi este ELISA. Acest lucru va fi cu siguranță complet cantitativ. Biologii celulari ezită să folosească citometria în flux, deoarece starea celulelor este oarecum diferită atunci când sunt analizate (în suspensie). Imunocolorarea este de asemenea calitativă (cu excepția cazului în care aveți un software bun pentru a număra celulele colorate față de celulele necolorate). Cu toate acestea, dacă ambele celule sunt colorate, nu credeți că puteți spune intensitatea colorării (supra/sub expresie) dintre ele.


Concentrația de antigen

Rezoluția SDS-PAGE este limitată la 50-100 de benzi. Dacă concentrația relativă a antigenului de interes este prea scăzută (mai puțin de 0,2% din proteina totală), poate fi dificil de detectat (de exemplu, sinaptobrevin/VAMP comigrează cu histonele în omogenate celulare care interferează cu detectarea acestuia). Îmbunătățirea semnalului poate duce apoi la apariția benzilor artificiale. Ar trebui luată în considerare îmbogățirea antigenului prin fracționare sau prin imunoprecipitare.

Pe de altă parte, prea multă abundență de antigen sau prea mult anticorp primar poate produce un semnal prea puternic.


Colorarea actinei și tubulinei – de la WB la Live Cell Imaging

Fig. 1: Imagini de imunofluorescență ale celulelor Swiss 3T3 de șoarece colorate cu anticorp anti-actină (027AAN01).

Actina și tubulina, ca structuri majore ale citoscheletului, sunt componente cruciale ale unei multitudini de procese din biologia celulară. Ambele sunt foarte implicate în stabilizarea formei celulei și în special în mișcările celulare (de exemplu, migrarea celulelor) și mișcările intracelulare și mecanismele de transport.

Astfel, vizualizarea actinei și tubulinei în celulele fixe sau vii și detectarea lor în probe biologice (de exemplu, în Western Blots) aparține configurațiilor experimentale de bază din biologia celulară.

O gamă largă de instrumente este disponibilă pentru toate tipurile de niveluri experimentale, în această postare vom arunca o privire la unele dintre acestea pe care le puteți folosi de la Western Blot la Live Cell Imaging.

Detectarea actinei și tubulinei cu anticorpi

Fig. 2: Western blot de actină purificată și extracte celulare testate cu anticorp anti-actină (027AAN01).

Anticorpii pot fi utilizați în diverse metode, cum ar fi Western Blots, ELISA și imunocitochimie. Rezultate bune în diferite metode pot fi obținute doar cu câțiva anticorpi.

Anti pan Actin a fost testat temeinic în aceste aplicații și a adus rezultate strălucitoare (vezi Fig. 1 și 2).

Fig. 3: Imagine de imunofluorescență a celulei în metafază de Arabidopsis thaliana colorată cu anticorp policlonal Anti-Tubulină (027ATN02).

Fig. 4: Western blot de extracte celulare testate cu anticorp policlonal anti-tubulină (027ATN02)

În plus, aici puteți căuta o selecție de alți anticorpi anti actină.

Tubulina anti-alfa/beta a fost testată pozitiv în aceleași aplicații și poate fi utilizată suplimentar pentru experimente de imunoprecipitare. Rezultatele sunt prezentate în Fig. 3 și Fig. 4.

Iată o prezentare completă a unei game de anticorpi anti Tubulin.

Colorarea cu actină a celulelor fixe

Fig. 5: Fibroblaste elvețiene 3T3 colorate cu ActiStain 488 (verde), Dapi (albastru) și Anti Vinuclin (portocaliu).

În celulele fixe, actina poate fi colorată cu anticorpi (vezi mai sus), dar adesea se folosesc faloidine fluorescente. Faloidina aparține grupului de falotoxine produse de ciuperci Amanita phalloides (ciuperca cu cap de moarte). Toxicitatea naturală a Faloidinei se datorează efectului său stabilizator asupra actinei F din celule. Pe baza afinității sale pentru actina F și cuplată la un colorant fluorescent, poate fi utilizat pentru a vizualiza actina F.

Cytoskeleton Inc. oferă un set de colorante pe bază de faloidină (Acti-Stains) cuplate cu un număr de fluorofori diferiți compatibile cu seturi de filtre populare, cum ar fi FITC, TRITC și Cy5. Petele sunt excepțional de luminoase și stabile și sunt într-adevăr oferite la prețuri foarte economice în comparație cu alte pete pe bază de faloidină cuplate cu fluorofori de stabilitate similară. Rezultatele colorării celulelor Swiss 3T3 cu ActiStain 488 sunt prezentate în Fig. 5.

Imagistica cu celule vii a actinei și tubulinei

Fig. 6: Imagine de microscopie 3D-SIM a microtubulilor din corpul neuronal al cortexului primar al șobolanului marcat cu SiR-tubulină.

În cele din urmă, aș dori să introduc instrumente noi pentru a colora actina și tubulina în celulele vii, fără a fi nevoie să le transfectez cu vectori care transportă informații pentru actină/tubuline marcate fluorescent sau proteine ​​de legare. Spirochrome a lansat recent pete fluorescente unice pentru monitorizarea cu ușurință a ambelor componente majore ale citoscheletului în celulele vii. Aceste pete fluorescente (SiR-Actin și SiR-Tubulin) sunt compuși permeabili celulari care colorează F-actina (și, respectiv, microtubulii, vezi Fig. 6 și Fig. 7).

Fig. 7: Imagine de microscopie 3D-SIM a fibrelor de stres de actină în fibroblastele dermice primare umane marcate cu SiR-actină.

Pentru a afla mai multe despre aceste pete interesante, aruncați o privire la postarea mea recentă 2 noi pete de imagistică cu celule vii de actină și tubulină – fără transfecție!

Vă interesează să colorați actină și/sau tubulină? Luați legătura lăsând întrebările sau comentariile dvs. mai jos!


Contribuții autorilor’

LWT a proiectat și efectuat experimente, a analizat date și a co-scris manuscrisul. JS și CE au proiectat și realizat experimente, au analizat date. ASHC și CF au efectuat experimente de metabolomică. TSB și GS au asistat la analiza imagistică NAD/NADH. MA a furnizat conceptul pentru studiu, a proiectat experimente, a analizat datele, a co-scris manuscrisul și a obținut finanțare. Toți autorii au revizuit și editat manuscrisul. Toți autorii au citit și au aprobat manuscrisul final.


Priveste filmarea: De ce ne amortesc mainile si picioarele? Dr Ana Stemate (Iunie 2022).


Comentarii:

  1. Lia

    Și înțelegi?

  2. Michio

    Această idee strălucitoare este necesară doar apropo

  3. Branden

    Deci, vei deschide subiectul până la sfârșit?

  4. Ardel

    Felicitări, cuvinte... ce altă idee

  5. Dridan

    Scuzați, că vă întrerup, dar nu puteți picta puțin mai detaliat.

  6. Madelhari

    Ne pare rău să vă întrerup, dar vă puteți descrie, vă rog, într -un pic mai detaliat.

  7. Donato

    Confirm. Toate cele de mai sus sunt adevărate.

  8. Yahto

    Of course you're right. There's something about that, and that's a great idea. Sunt gata să vă susțin.

  9. Naaman

    Destul de ciudat, dar nu este clar



Scrie un mesaj