Informație

7.14A: Introducerea ADN-ului străin în celule - Biologie

7.14A: Introducerea ADN-ului străin în celule - Biologie



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Metodele utilizate pentru a introduce ADN-ul în celule sunt variate (de exemplu, transformare, transducție, transfecție și electroporare).

OBIECTIVE DE INVATARE

Descrieți metodele de introducere a ADN-ului străin în celule

Puncte cheie

  • Când microorganismele sunt capabile să preia și să reproducă ADN-ul din mediul lor local, procesul se numește transformare.
  • În cultura de celule de mamifere, procesul analog de introducere a ADN-ului în celule este denumit în mod obișnuit transfecție.
  • Electroporația utilizează impulsuri electrice de înaltă tensiune pentru a transloca ADN-ul prin membrana celulară (și peretele celular, dacă este prezent).

Termeni cheie

  • transformare: Alterarea unei celule bacteriene cauzată de transferul de ADN de la alta, mai ales dacă este patogenă.
  • microorganisme: Un microorganism sau microb este un organism microscopic care cuprinde fie o singură celulă (unicelulară), grupuri de celule, fie organisme multicelulare relativ complexe.

Amestecul de ADN, manipulat anterior in vitro, este mutat înapoi într-o celulă vie, denumită organism gazdă. Metodele folosite pentru a introduce ADN-ul în celule sunt variate, iar numele aplicat acestui pas în procesul de clonare moleculară va depinde adesea de metoda experimentală aleasă (de exemplu, transformare, transducție, transfecție, electroporare).

Atunci când microorganismele sunt capabile să preia și să reproducă ADN-ul din mediul lor local, procesul este numit transformare, iar celulele care sunt într-o stare fiziologică astfel încât să poată prelua ADN-ul, se spune că sunt competente. În cultura de celule de mamifere, procesul analog de introducere a ADN-ului în celule este denumit în mod obișnuit transfecție. Atât transformarea, cât și transfecția necesită de obicei pregătirea celulelor printr-un regim special de creștere și un proces de tratament chimic care va varia în funcție de speciile și tipurile de celule specifice care sunt utilizate.

Electroporația utilizează impulsuri electrice de înaltă tensiune pentru a transloca ADN-ul prin membrana celulară (și peretele celular, dacă este prezent). În schimb, transducția implică ambalarea ADN-ului în particule derivate din virus și utilizarea acestor particule asemănătoare virusului pentru a introduce ADN-ul încapsulat în celulă printr-un proces asemănător infecției virale. Deși electroporația și transducția sunt metode foarte specializate, acestea pot fi cele mai eficiente metode de a muta ADN-ul în celule.

Indiferent de metoda utilizată, introducerea ADN-ului recombinant în organismul gazdă ales este de obicei un proces cu eficiență scăzută; adică doar o mică parte din celule va prelua de fapt ADN. Oamenii de știință experimentali se ocupă de această problemă printr-o etapă de selecție genetică artificială, în care celulele care nu au preluat ADN-ul sunt ucise selectiv și numai acele celule care pot replica activ ADN-ul care conține gena marker selectabilă codificată de vector sunt capabile să supraviețuiască.

Când celulele bacteriene sunt utilizate ca organisme gazdă, markerul selectabil este de obicei o genă care conferă rezistență la un antibiotic care altfel ar ucide celulele, de obicei ampicilină. Celulele care adăpostesc vectorul vor supraviețui atunci când sunt expuse la antibiotic, în timp ce cele care nu au reușit să preia secvențele vectorului vor muri. Când sunt utilizate celule de mamifere (de exemplu, celule umane sau de șoarece), se utilizează o strategie similară, cu excepția faptului că gena marker (în acest caz codificată de obicei ca parte a casetei kanMX) conferă rezistență la antibioticul Geneticin.


Intrebare: O transformare este: a. Fuzionarea a două celule bacteriene b. Introducerea ADN-ului plasmid în celulele de mamifere c. Introducerea ADN-ului străin într-o celulă bacteriană d. Introducerea unei celule bacteriene într-o celulă de mamifer 2 După crearea unui vector recombinant, vom __________________ în laboratorul acestei săptămâni. A. Lucrați cu el fără

După crearea unui vector recombinant, vom __________________ în laboratorul din această săptămână.

Lucrați cu el fără nicio transformare

Transformă-l în celule de mamifere

Transformă-l în celule de drojdie

Transformă-l în celule bacteriene

3. Scopul unei transformări este:

Introduceți noi locuri de restricție în ADN-ul bacterian

Pentru a crea multe celule bacteriene

Pentru a crea multe copii ale unui vector recombinant

4. Cei mai importanți factori pentru a detecta care dintre bacteriile transformate au preluat vectorul recombinant care conține gena dvs. de interes sunt:

Utilizați mai multe site-uri de clonare

5. În timpul transformării, șocul termic este efectuat pentru:

Pentru a degrada ADN-ul plasmidic

Pentru a degrada ADN-ul bacterian

Pentru a slăbi peretele celular bacterian și a-l face permeabil

6. După incubarea celulelor competente, le punem sub șoc termic la ce temperatură?


Transducția virală

Transducția este inserția de ADN străin într-o celulă prin intermediul unui virus (vezi referința 1 și 2). Virușii sunt formați dintr-un înveliș proteic care adăpostește ADN-ul în interior. Virușii se pot lega de celulele vii și le pot injecta ADN-ul. Sau, virusurile pot împinge în gazdă ca o veziculă legată de membrană, înainte de a-și elibera ADN-ul în interiorul gazdei. Utilizarea tehnologiei ADN recombinant poate introduce ADN străin în celulele gazdă care sunt apoi infectate intenționat cu viruși. Când virusul produce mai mult din el însuși în celula gazdă, el împachetează, de asemenea, copii ale ADN-ului străin în noile viruși. Când acești noi viruși ies din celula gazdă, acum sunt purtători ai ADN-ului străin și pot fi utilizați pentru a introduce acest ADN în alte celule gazdă.


Procesul de transducție bacteriană

Virușii nu se pot reproduce singuri. În schimb, ei trebuie să folosească biologia celulară reproductivă mai avansată a bacteriilor pentru a-și face copii. Pentru a face acest lucru, bacteriofagii deturnează celulele gazdă.

Când un bacteriofag întâlnește o celulă bacteriană, se leagă de celulă și injectează ADN-ul fagului prin membrana plasmatică în celulă. Acolo, ea preia controlul asupra comportamentului reproductiv al celulei. În loc să-și reproducă propriul material genetic, bacteria începe să se reproducă nou particule de fagi – componente ale celulelor virusului.

Genele bacteriene sunt degradate de fagi în timpul acestui proces. Ce a mai rămas din bacterie este o mașină de replicare a virusului.

Virusul folosește celula bacteriană pentru a sintetiza schelele proteice de care are nevoie pentru componentele sale. Uneori, împachetează accidental ADN-ul bacterian rătăcit în unii dintre fagi, împreună cu ADN-ul viral replicat.

Odată ce totul este gata, virusul lize celula bacteriană. Celula bacteriană se deschide, eliberând fagii pentru a se lega și a infecta alte celule bacteriene. Odată legați, unii dintre fagi vor injecta materialul genetic bacterian pe care îl poartă în locul ADN-ului viral în noua bacterie.

Deoarece unii dintre fagi poartă doar bucăți de ADN bacterian, ei nu pot infecta sau lize noua celulă primitoare. Dacă ADN-ul bacterian donator se potrivește în noul cromozom bacterian, celula va exprima genele ca și cum ar fi fost întotdeauna acolo.


Proba 4 Laboratorul 6a Transformare

Introducere:
Genele sunt transferate între bacterii prin conjugare, transducție sau transformare. Conjugarea are loc atunci când materialul genetic este transferat de la o bacterie la alta de alt tip de împerechere. Transducția necesită prezența unui virus pentru a acționa ca un vector sau un purtător pentru a transfera bucăți mici de ADN de la o bacterie la alta. Transformarea implică transferul de informații genetice într-o celulă prin preluarea directă a ADN-ului. Acest laborator folosește transformarea pentru a insera o anumită genă într-o plasmidă, astfel încât celula să preia acele caracteristici pentru care codifică gena.

Plasmidele sunt mici inele de ADN care transportă informații genetice. Ei pot transfera gene, cum ar fi genele pentru rezistența la antibiotice, care pot apărea în mod natural în interiorul lor, sau plasmidele pot acționa ca purtători sau vectori pentru introducerea ADN-ului străin de la alte bacterii, plasmide sau chiar eucariote în celulele bacteriene primitoare. Endonucleazele de restricție pot fi utilizate pentru a tăia și a introduce bucăți de ADN străin în vectorii plasmidii. Dacă acești vectori plasmidici poartă și gene pentru rezistența la antibiotice, celulele transformate care conțin plasmide care poartă ADN-ul străin de interes în plus față de gena de rezistență la antibiotice pot fi selectate cu ușurință din alte celule care nu poartă gena pentru rezistența la antibiotice. De obicei sunt extracromozomiale. Aceasta înseamnă că ele există separat de cromozom. Unele plasmide se replic numai atunci când se replic cromozomul bacterian și, de obicei, există doar ca copii unice în interiorul celulei bacteriene, dar încă altele se reproduc de la sine, în mod autonom. Pot exista oriunde de la zece la două sute de copii într-o singură celulă bacteriană. Există plasmide specifice numite plasmide R care poartă gene de rezistență la antibiotice, cum ar fi ampicilină, kanamicina sau tetraciclină.

Bacteria Escherichia coli, sau E. coli, este un organism ideal pentru manipularea geneticienilor moleculari și a fost utilizată pe scară largă în cercetarea ADN-ului recombinant. Este un locuitor comun al colonului uman și poate fi cultivat cu ușurință în cultură în suspensie într-un mediu nutritiv, cum ar fi bulionul Luria, sau într-o cutie Petri de bulion Luria amestecat cu agar sau agar nutritiv. Singurul cromozom circular al E. coli conține aproximativ cinci milioane de perechi de baze ADN, doar o șase sutimi din cantitatea haploidă de ADN dintr-o celulă umană. De asemenea, celula E. coli poate conține plasmide mici, discutate mai devreme. Plasmidele sunt rupte cu clorură de calciu, iar gena dorită este introdusă și bacteriile pot fi crescute pe nutrient sau cu un antibiotic pentru a vedea dacă gena a transformat bacteriile astfel încât acestea să fie rezistente la antibiotice.

Materiale:
Materialele necesare în acest laborator au fost două plăci de agar Luria, două plăci de agar Luria cu ampicilină, două tuburi de 15 ml, o ansă de inoculare, un distribuitor bacterian, câteva micropipete sterile, clorură de calciu, bulion Luria, soluție pAMP, un arzător Bunsen, plită, gheață și o baie de apă.

Metode:
Marcați unul dintre tuburile sterile de 15 ml “+” și celălalt “-“, tubul plus având evident plasmida adăugată în timp ce celălalt tub nu primește niciuna. Folosind o micropipetă sterilă, adăugați 250 microlitri de 0,05 M CaCl2 rece ca gheață în fiecare tub. Transferați o colonie mare de 3 mm de E. coli de pe placa de pornire în fiecare dintre tuburi folosind o ansă de inoculare sterilă. Încercați să introduceți aceeași cantitate de bacterii în fiecare tub. Aveți grijă să nu transferați agar. Loviți puternic bucla de peretele tubului pentru a disloca masa celulară. Se amestecă suspensia prin extragerea în mod repetat și golirea unei micropipete sterile cu suspensia. Adăugați zece microlitri de soluție pAMP direct în suspensia celulară din tubul etichetat cu semnul plus. Se amestecă atingând tubul. Această soluție conține plasmida rezistentă la antibiotice. Păstrați ambele tuburi în gheață timp de aproximativ 15 minute. În timp ce tuburile sunt pe gheață, obțineți două plăci cu agar LB și două plăci cu agar LB/Amp. Etichetați fiecare placă pe partea inferioară după cum urmează: o placă cu agar LB “LB+” și cealaltă “LB-.” Etichetați o placă LB/Amp “LB/Amp+” și cealaltă placă “LB-.” Un scurt puls de căldură facilitează intrarea ADN-ului străin în celulele E. coli. Celulele de șoc termic în ambele tuburi + și – prin ținerea într-o baie de apă de 42 de grade Celsius timp de nouăzeci de secunde. Este esențial ca celulele să primească un șoc puternic și distinct, așa că luați tuburile direct de la gheață la baia de apă. Readuceți imediat tuburile la gheață după nouăzeci de secunde. Utilizați o micropipetă sterilă pentru a adăuga 250 de microlitri de bulion Luria în fiecare tub. Se amestecă atingând tubul. Orice celule transformate sunt acum rezistente la ampicilină deoarece conțin gena. Puneți 100 de microlitri de celule + pe placa LB+ și pe placa LB-, celelalte celule trebuie plasate. Răspândiți imediat celulele folosind o tijă de împrăștiere sterilă. Acest lucru poate fi realizat prin trecerea tijei prin arzătorul Bunsen și lăsând-o să se răcească atingând-o de agar-ul pe partea vasului departe de bacterii. Răspândiți celulele și treceți din nou tija prin foc pentru a steriliza tija. Lăsați plăcile să se stabilească timp de câteva minute, apoi lipiți plăcile împreună și incubați invers peste noapte.


Cuprins

Electroporarea se realizează cu electroporatoare, aparate special construite care creează un câmp electrostatic într-o soluție celulară. Suspensia celulară este pipetată într-o cuvă de sticlă sau plastic care are doi electrozi de aluminiu pe părțile laterale. Pentru electroporarea bacteriană, se utilizează de obicei o suspensie de aproximativ 50 de microlitri. Înainte de electroporare, această suspensie de bacterii este amestecată cu plasmida care urmează să fie transformată. Amestecul este pipetat în cuvă, tensiunea și capacitatea sunt setate, iar cuva este introdusă în electroporator. Procesul necesită contact direct între electrozi și suspensie. Imediat după electroporare, la bacterii se adaugă un mililitru de mediu lichid (în cuvă sau într-un tub Eppendorf), iar tubul este incubat la temperatura optimă a bacteriilor timp de o oră sau mai mult pentru a permite recuperarea celulelor și exprimarea celulelor. plasmidă, urmată de cultură bacteriană pe plăci de agar.

Succesul electroporării depinde în mare măsură de puritatea soluției de plasmide, în special de conținutul de sare. Soluțiile cu concentrații mari de sare pot provoca o descărcare electrică (cunoscută sub numele de arc), care deseori reduce viabilitatea bacteriilor. Pentru o investigație suplimentară detaliată a procesului, ar trebui să se acorde mai multă atenție impedanței de ieșire a dispozitivului porator și impedanței de intrare a suspensiei de celule (de exemplu, conținutul de sare).

Deoarece membrana celulară nu este capabilă să treacă curentul (cu excepția canalelor ionice), ea acționează ca un condensator electric. Supunerea membranelor la un câmp electric de înaltă tensiune are ca rezultat defalcarea lor temporară, rezultând pori suficient de mari pentru a permite macromoleculelor (cum ar fi ADN-ul) să intre sau să iasă din celulă. [13]

În plus, electroporația poate fi utilizată pentru a crește permeabilitatea celulelor în timpul injecțiilor și intervențiilor chirurgicale in uter. În special, electroporarea permite o transfecție mai eficientă a ADN-ului, ARN-ului, ARNsh și tuturor acizilor nucleici în celulele șoarecilor și șobolanilor. Succesul electroporării in vivo depinde în mare măsură de tensiune, repetare, impulsuri și durată. Dezvoltarea sistemelor nervoase centrale este cea mai eficientă pentru electroporarea in vivo datorită vizibilității ventriculilor pentru injecțiile cu acizi nucleici, precum și permeabilității crescute a celulelor în diviziune. Electroporarea embrionilor injectați în uter se realizează prin peretele uterului, adesea cu electrozi de tip forceps pentru a limita deteriorarea embrionului. [14]

Electrotransferul genelor in vivo a fost descris pentru prima dată în 1991 [15] și astăzi există multe studii preclinice despre electrotransferul genelor. Metoda este utilizată pentru a furniza o mare varietate de gene terapeutice pentru tratamentul potențial al mai multor boli, cum ar fi: tulburări ale sistemului imunitar, tumori, tulburări metabolice, boli monogenetice, boli cardiovasculare, analgezie... [16] [17] [18]

În ceea ce privește electroporația ireversibilă, primul tratament de succes al tumorilor cutanate maligne implantate la șoareci a fost finalizat în 2007 de un grup de oameni de știință care a realizat ablația completă a tumorii la 12 din 13 șoareci. Ei au realizat acest lucru trimițând 80 de impulsuri de 100 de microsecunde la 0,3 Hz cu o magnitudine a câmpului electric de 2500 V/cm pentru a trata tumorile cutanate. [19] În prezent, o serie de companii, inclusiv AngioDynamics, Inc. și VoltMed, Inc., continuă să dezvolte și să implementeze tehnologii ireversibile bazate pe electroporație în mediile clinice.

Primul grup care a analizat electroporația pentru aplicații medicale a fost condus de Lluis M Mir la Institutul Gustave Roussy. În acest caz, ei au analizat utilizarea electroporării reversibile în combinație cu macromoleculele impermeabile. Prima cercetare care analizează modul în care pulsurile de nanosecundă ar putea fi utilizate pe celulele umane a fost realizată de cercetătorii de la Eastern Virginia Medical School și de la Old Dominion University și a fost publicată în 2003. [20]

Prima aplicație medicală a electroporării a fost folosită pentru introducerea medicamentelor anticancer slab permeante în nodulii tumorali. [21] Curând, de asemenea, electrotransferul genelor a devenit de interes deosebit datorită costului său scăzut, ușurinței de realizare și siguranței. Și anume, vectorii virali pot avea limitări serioase în ceea ce privește imunogenitatea și patogenitatea atunci când sunt utilizați pentru transferul ADN. [22]

Un voltaj mai mare de electroporare a fost găsit la porci pentru a distruge ireversibil celulele țintă într-un interval îngust, lăsând celulele învecinate neafectate și, astfel, reprezintă un nou tratament promițător pentru cancer, boli de inimă și alte stări de boală care necesită îndepărtarea țesutului. [23] Electroporația ireversibilă (IRE) s-a dovedit de atunci eficace în tratarea cancerului uman, chirurgii de la Johns Hopkins și alte instituții utilizând acum tehnologia pentru a trata cancerul pancreatic, considerat anterior a fi inrezecabil. [24]

De asemenea, a fost raportat primul studiu clinic de fază I de electrotransfer genic la pacienții cu melanom metastatic. [25] [26] A fost efectuată livrarea mediată de electroporație a unei gene care codifică plasmidă pentru interleukina-12 (pIL-12) și au fost monitorizate siguranța, tolerabilitatea și efectul terapeutic. Studiul a concluzionat că electrotransferul genelor cu pIL-12 este sigur și bine tolerat. În plus, răspunsul parțial sau complet a fost observat și în metastazele netratate la distanță, sugerând efectul sistemic al tratamentului. Pe baza acestor rezultate, ei intenționează deja să treacă la studiul clinic de fază II. În prezent, există mai multe studii clinice în curs de desfășurare privind electrotransferul genelor [27], unde siguranța, tolerabilitatea și eficacitatea imunizării cu vaccinul ADN, care este administrat prin impulsuri electrice sunt monitorizate.

Deși metoda nu este sistemică, ci strict locală, este totuși cea mai eficientă strategie non-virală pentru livrarea genelor.

N-TIRE Edit

O tehnică recentă numită electroporare non-termică ireversibilă (N-TIRE) s-a dovedit a fi de succes în tratarea multor tipuri diferite de tumori și a altor țesuturi nedorite. Această procedură se realizează folosind electrozi mici (aproximativ 1 mm în diametru), plasați fie în interiorul, fie în jurul țesutului țintă pentru a aplica explozii scurte și repetitive de electricitate la o tensiune și o frecvență predeterminate. Aceste explozii de electricitate cresc potențialul transmembranar de repaus (TMP), astfel încât nanoporii se formează în membrana plasmatică. Atunci când electricitatea aplicată țesutului este peste pragul câmpului electric al țesutului țintă, celulele devin permanent permeabile de la formarea nanoporilor. Ca urmare, celulele nu sunt capabile să repare daunele și mor din cauza unei pierderi a homeostaziei. [28] N-TIRE este unic pentru alte tehnici de ablație a tumorii prin faptul că nu creează daune termice țesutului din jurul său.

Electroporație reversibilă Edit

În contrast, electroporația reversibilă are loc atunci când electricitatea aplicată cu electrozii este sub pragul câmpului electric al țesutului țintă. Deoarece electricitatea aplicată este sub pragul celulelor, aceasta permite celulelor să-și repare stratul dublu fosfolipidic și să continue cu funcțiile celulare normale. Electroporația reversibilă se face de obicei cu tratamente care implică introducerea în celulă a unui medicament sau a unei gene (sau a unei alte molecule care nu este în mod normal permeabilă la membrana celulară). Nu toate țesuturile au același prag de câmp electric, prin urmare, trebuie făcute calcule atente înainte de un tratament pentru a asigura siguranța și eficacitatea. [29]

Un avantaj major al utilizării N-TIRE este că, atunci când este făcut corect, conform calculelor atente, afectează doar țesutul țintă. Proteinele, matricea extracelulară și structurile critice, cum ar fi vasele de sânge și nervii, sunt toate neafectate și lăsate sănătoase de acest tratament. Acest lucru permite o recuperare mai rapidă și facilitează o înlocuire mai rapidă a celulelor tumorale moarte cu celule sănătoase. [30]

Înainte de a efectua procedura, oamenii de știință trebuie să calculeze cu atenție exact ceea ce trebuie făcut și să trateze fiecare pacient individual, de la caz la caz. Pentru a face acest lucru, tehnologia imagistică, cum ar fi scanările CT și RMN-urile sunt utilizate în mod obișnuit pentru a crea o imagine 3D a tumorii. Din aceste informații, ei pot aproxima volumul tumorii și pot decide cel mai bun curs de acțiune, inclusiv locul de inserare a electrozilor, unghiul în care sunt inserați, tensiunea necesară și multe altele, folosind tehnologia software. Adesea, un aparat CT va fi folosit pentru a ajuta la plasarea electrozilor în timpul procedurii, în special atunci când electrozii sunt utilizați pentru a trata tumorile din creier. [31]

Întreaga procedură este foarte rapidă, durând de obicei aproximativ cinci minute. Rata de succes a acestor proceduri este mare [32] și este foarte promițătoare pentru viitorul tratament la om. Un dezavantaj al folosirii N-TIRE este că electricitatea furnizată de electrozi poate stimula celulele musculare să se contracte, ceea ce ar putea avea consecințe letale în funcție de situație. Prin urmare, atunci când se efectuează procedura, trebuie utilizat un agent paralitic. Agenții paralitici care au fost utilizați în astfel de cercetări au succes [ citare necesară ] cu toate acestea, există întotdeauna un anumit risc, deși ușor, atunci când utilizați anestezice.

H-FIRE Edit

A fost dezvoltată o tehnică mai recentă numită electroporație ireversibilă de înaltă frecvență (H-FIRE). Această tehnică folosește electrozi pentru a aplica explozii bipolare de electricitate la o frecvență înaltă, spre deosebire de exploziile unipolare de electricitate la o frecvență joasă. Acest tip de procedură are același succes în ablația tumorii ca și N-TIRE. Cu toate acestea, are un avantaj distinct, H-FIRE nu provoacă contracția musculară la pacient și, prin urmare, nu este nevoie de un agent paralitic. [33] În plus, s-a demonstrat că H-FIRE produce ablații mai predictibile datorită diferenței mai mici în proprietățile electrice ale țesuturilor la frecvențe mai mari. [34]

Livrarea medicamentelor și a genelor Edit

Electroporația poate fi, de asemenea, utilizată pentru a ajuta la livrarea medicamentelor sau a genelor în celulă prin aplicarea de impulsuri electrice scurte și intense care permeabilizează temporar membrana celulară, permițând astfel transportul moleculelor care altfel nu ar fi transportate printr-o membrană celulară. Această procedură este denumită electrochimioterapie atunci când moleculele care urmează să fie transportate sunt agenți chimioterapeutici sau electrotransfer de genă când molecula de transportat este ADN. Oamenii de știință de la Karolinska Institutet și de la Universitatea din Oxford folosesc electroporarea exozomilor pentru a furniza siARN, oligonucleotide antisens, agenți chimioterapeutici și proteine ​​în mod specific neuronilor după ce le injectează sistemic (în sânge). Deoarece acești exozomi sunt capabili să traverseze bariera hematoencefalică, acest protocol ar putea rezolva problema livrării proaste a medicamentelor către sistemul nervos central și ar putea trata boala Alzheimer, boala Parkinson și cancerul cerebral, printre alte afecțiuni. [35]

Transformarea bacteriană este, în general, cel mai simplu mod de a produce cantități mari dintr-o anumită proteină necesară în scopuri biotehnologice sau în medicină. Deoarece electrotransferul genelor este o tehnică foarte simplă, rapidă și foarte eficientă, a devenit mai întâi un înlocuitor foarte convenabil pentru alte proceduri de transformare. [36]

Cercetări recente au arătat că undele de șoc ar putea fi utilizate pentru pre-tratarea membranei celulare înainte de electroporare. [37] [38] Această strategie sinergică a demonstrat că reduce necesarul de tensiune externă și creează pori mai mari. De asemenea, aplicarea undelor de șoc permite obiectivului să țintească locul dorit al membranei. Această procedură permite controlul dimensiunii porilor.

Electroporația permite introducerea celulară a moleculelor mari înalt încărcate, cum ar fi ADN-ul, care nu ar difuza niciodată pasiv prin miezul dublu strat hidrofob. [2] Acest fenomen indică faptul că mecanismul este crearea de găuri umplute cu apă la scară nm în membrană. [39] Electroporii au fost fotografiați optic în modele cu două straturi lipidice, cum ar fi bistraturile de interfață cu picături [40] și veziculele unilamelare gigantice, [41] în timp ce adăugarea de proteine ​​​​citoscheletice, cum ar fi rețelele de actină, la veziculele unilamelare gigantice pare să prevină formarea electroporilor vizibili. [42] Au apărut, de asemenea, dovezi experimentale pentru rețelele de actină în reglarea permeabilității membranei celulare. [43] Deși electroporația și defalcarea dielectrică rezultă ambele din aplicarea unui câmp electric, mecanismele implicate sunt fundamental diferite. În defalcarea dielectrică, materialul de barieră este ionizat, creând o cale conductivă. Modificarea materialului este astfel de natură chimică. În schimb, în ​​timpul electroporării, moleculele de lipide nu sunt modificate chimic, ci pur și simplu își schimbă poziția, deschizând un por care acționează ca cale conductivă prin stratul dublu, deoarece este umplut cu apă.

Electroporația este un fenomen dinamic care depinde de tensiunea transmembranară locală în fiecare punct al membranei celulare. Este în general acceptat că pentru o anumită durată și formă a impulsului, există un prag specific de tensiune transmembranară pentru manifestarea fenomenului de electroporație (de la 0,5 V la 1 V). Aceasta conduce la definirea unui prag de mărime a câmpului electric pentru electroporație (Eth). Adică numai celulele din zonele în care E≧Eth sunt electroporate. Dacă un al doilea prag (Eir) este atins sau depășit, electroporarea va compromite viabilitatea celulelor, adică, electroporație ireversibilă (IRE). [44]

Electroporarea este un proces în mai multe etape, cu mai multe faze distincte. [45] În primul rând, trebuie aplicat un impuls electric scurt. Parametrii tipici ar fi 300–400 mV pentru < 1 ms peste membrană (rețineți: tensiunile utilizate în experimentele cu celule sunt de obicei mult mai mari, deoarece sunt aplicate pe distanțe mari la soluția în vrac, astfel încât câmpul rezultat peste membrana reală este doar o mică parte din părtinirea aplicată). La aplicarea acestui potențial membrana se încarcă ca un condensator prin migrarea ionilor din soluția înconjurătoare. Odată ce câmpul critic este atins, există o rearanjare rapidă localizată în morfologia lipidelor. Se crede că structura rezultată este un „pre-por”, deoarece nu este conductivă electric, dar duce rapid la crearea unui por conductor. [46] Dovezile pentru existența unor astfel de pre-pori provin în principal din „pâlpâirea” porilor, ceea ce sugerează o tranziție între stările conductive și izolatoare. [47] S-a sugerat că acești pre-pori sunt mici (

3 Å) defecte hidrofobe. Dacă această teorie este corectă, atunci trecerea la o stare conductivă ar putea fi explicată printr-o rearanjare la marginea porilor, în care capetele lipidice se pliază pentru a crea o interfață hidrofilă. În cele din urmă, acești pori conductori se pot vindeca, reetanșând stratul dublu sau se pot extinde, în cele din urmă rupându-l. Soarta rezultată depinde de dacă dimensiunea critică a defectului a fost depășită [48] care, la rândul său, depinde de câmpul aplicat, de solicitarea mecanică locală și de energia marginii dublu strat.

Electroporarea genelor Edit

Aplicarea pulsurilor electrice cu putere suficientă la celulă determină o creștere a diferenței de potențial transmembranar, ceea ce provoacă destabilizarea membranei. Permeabilitatea membranei celulare este crescută și în caz contrar moleculele nepermeante intră în celulă. [49] [50] Deși mecanismele electrotransferului genelor nu sunt încă pe deplin înțelese, s-a demonstrat că introducerea ADN-ului are loc doar în partea membranei care se confruntă cu catod și că sunt necesare mai multe etape pentru transfecția cu succes: migrarea electroforetică a ADN-ul către celulă, inserarea ADN-ului în membrană, translocarea prin membrană, migrarea ADN-ului către nucleu, transferul ADN-ului peste învelișul nuclear și în final expresia genei. [51] Există o serie de factori care pot influența eficiența electrotransferului genelor, cum ar fi: temperatura, parametrii impulsurilor electrice, concentrația ADN-ului, tamponul de electroporare utilizat, dimensiunea celulelor și capacitatea celulelor de a exprima genele transfectate. [52] În electrotransferul genelor in vivo, și difuzarea ADN-ului prin matricea extracelulară, proprietățile țesutului și conductivitatea țesutului general sunt cruciale. [53]

În anii 1960, se știa că prin aplicarea unui câmp electric extern, se poate crea un potențial mare de membrană la cei doi poli ai unei celule. În anii 1970, s-a descoperit că atunci când un potențial de membrană atingea un nivel critic, membrana se descompune și își putea reveni. [54] Până în anii 1980, această deschidere a fost folosită pentru a introduce diverse materiale/molecule în celule. [55]


Ar putea vaccinurile ARNm să modifice permanent ADN-ul? Știința recentă sugerează că ar putea

9 aprilie 2021 (Children's Health Defense) &mdash În ultimul an, ar fi aproape imposibil pentru americani să nu observe decizia mass-media de a transforma vaccinurile în narațiunea COVID dominantă, grăbindu-se să facă acest lucru chiar înainte de a avea loc orice deces cauzat de coronavirus.

Acoperirea înclinată a mass-media a oferit un stimulent deosebit de fructuos al relațiilor publice pentru vaccinurile cu ARN mesager (ARNm) și decenii de fabricație, dar niciodată aprobate pentru uz uman, contribuind la apropierea tehnologiei experimentale de linia de sosire reglementară.

În circumstanțe obișnuite, organismul produce (&ldquottranscrie) ARNm din ADN-ul din nucleul unei celule. ARNm-ul călătorește apoi din nucleu în citoplasmă, unde oferă instrucțiuni despre proteinele care trebuie făcute.

Prin comparație, vaccinurile ARNm își trimit sarcina utilă de ARNm sintetizată chimic (la pachet cu instrucțiunile de fabricare a proteinelor cu vârf) direct în citoplasmă.

Potrivit Centrelor pentru Controlul și Prevenirea Bolilor (CDC) și a majorității oamenilor de știință din vaccinul ARNm, banii se opresc acolo, iar vaccinurile cu ARNm „nu afectează și nu interacționează cu ADN-ul nostru în niciun fel”, spune CDC. CDC afirmă în primul rând că ARNm nu poate intra în nucleul celulei (unde se află ADN-ul) și, în al doilea rând, că celula în stil Mission-Impossible scapă de ARNm imediat după ce a terminat de folosit instrucțiunile.&rdquo

Un preprint din decembrie despre SARS-CoV-2, realizat de oamenii de știință de la Harvard și Massachusetts Institute of Technology (MIT), a produs descoperiri despre coronavirusul sălbatic care ridică întrebări despre modul în care funcționează ARN viral.

Oamenii de știință au efectuat analiza pentru că au fost „nedușiți de faptul că există un număr respectabil de persoane care sunt testate pozitiv pentru COVID-19 prin PCR mult după ce infecția a dispărut”.

Descoperirile lor cheie au fost următoarele: ARN-urile SARS-CoV-2 „pot fi transcrise invers în celulele umane”, „aceste secvențe de ADN pot fi integrate în genomul celulei și ulterior pot fi transcrise” (un fenomen numit „integrare retro-retro”) și sunt celulare și viabile. căi pentru a explica cum se întâmplă acest lucru.

Potrivit Ph.D. biochimist și biolog molecular Dr. Doug Corrigan, aceste descoperiri importante (care sunt contrare „dogma biologică actuală”) aparțin categoriei „Lucruri de care eram absolut și fără echivoc siguri că nu s-ar putea întâmpla” care s-au întâmplat de fapt.&rdquo

The findings of the Harvard and MIT researchers also put the CDC&rsquos assumptions about mRNA vaccines on shakier ground, according to Corrigan. In fact, a month before the Harvard-MIT preprint appeared, Corrigan had already written a blog outlining possible mechanisms and pathways whereby mRNA vaccines could produce the identical phenomenon.

In a second blog post, written after the preprint came out, Corrigan emphasized that the Harvard-MIT findings about coronavirus RNA have major implications for mRNA vaccines &mdash a fact he describes as &ldquothe big elephant in the room.&rdquo While not claiming that vaccine RNA will necessarily behave in the same way as coronavirus RNA &mdash that is, permanently altering genomic DNA &mdash Corrigan believes that the possibility exists and deserves close scrutiny.

In Corrigan&rsquos view, the preprint&rsquos contribution is that it &ldquovalidates that this is at least plausible, and most likely probable.&rdquo

Transcriere inversă

As the phrase &ldquoreverse transcription&rdquo implies, the DNA-to-mRNA pathway is not always a one-way street. Enzymes called reverse transcriptases can also convert RNA into DNA, allowing the latter to be integrated into the DNA in the cell nucleus.

Nor is reverse transcription uncommon. Geneticists report that &ldquoOver 40% of mammalian genomes comprise the products of reverse transcription.&rdquo

The preliminary evidence cited by the Harvard-MIT researchers indicates that endogenous reverse transcriptase enzymes may facilitate reverse transcription of coronavirus RNAs and trigger their integration into the human genome.

The authors suggest that while the clinical consequences require further study, detrimental effects are a distinct possibility and &mdash depending on the integrated viral fragments&rsquo &ldquoinsertion sites in the human genome&rdquo and an individual&rsquos underlying health status &mdash could include &ldquoa more severe immune response &hellip such as a &lsquocytokine storm&rsquo or auto-immune reactions.&rdquo

In 2012, a study suggested that viral genome integration could &ldquolead to drastic consequences for the host cell, including gene disruption, insertional mutagenesis and cell death.&rdquo

Corrigan makes a point of saying that the pathways hypothesized to facilitate retro-integration of viral &mdash or vaccine &mdash RNA into DNA &ldquoare not unknown to people who understand molecular biology at a deeper level.&rdquo

Even so, the preprint&rsquos discussion of reverse transcription and genome integration elicited a maelstrom of negative comments from readers unwilling to rethink biological dogma, some of whom even advocated for retraction (though preprints are, by definition, unpublished) on the grounds that &ldquoconspiracy theorists &hellip will take this paper to &lsquoproof&rsquo that mRNA vaccines can in fact alter your genetic code.&rdquo

More thoughtful readers agreed with Corrigan that the paper raises important questions. For example, one reader stated that confirmatory evidence is lacking &ldquoto show that the spike protein only is expressed for a short amount of time (say 1-3 days) after vaccination,&rdquo adding, &ldquoWe think that this is the case, but there is no evidence for that.&rdquo

In fact, just how long the vaccines&rsquo synthetic mRNA &mdash and thus the instructions for cells to keep manufacturing spike protein &mdash persist inside the cells is an open question.

Ordinarily, RNA is a &ldquonotoriously fragile&rdquo and unstable molecule. According to scientists, &ldquothis fragility is true of the mRNA of any living thing, whether it belongs to a plant, bacteria, virus or human.&rdquo

But the synthetic mRNA in the COVID vaccines is a different story. In fact, the step that ultimately allowed scientists and vaccine manufacturers to resolve their decades-long mRNA vaccine impasse was when they figured out how to chemically modify mRNA to increase its stability and longevity &mdash in other words, produce RNA &ldquothat hangs around in the cell much longer than viral RNA, or even RNA that our cell normally produces for normal protein production.&rdquo

It is anyone&rsquos guess what the synthetic mRNA is doing while it is &ldquohanging around,&rdquo but Corrigan speculates that its enhanced longevity raises the probability of it &ldquobeing converted over into DNA.&rdquo

Moreover, because the vaccine mRNA is also engineered to be more efficient at being translated into protein, &ldquonegative effects could be more frequent and more pronounced with the vaccine when compared to the natural virus.&rdquo

Dollar signs

Corrigan acknowledges that some people may dismiss his warnings, saying &ldquoIf the virus is able to accomplish this, then why should I care if the vaccine does the same thing?&rdquo

He has a ready and compelling response:

&ldquo[T]here&rsquos a big difference between the scenario where people randomly, and unwittingly, have their genetics monkeyed with because they were exposed to the coronavirus, and the scenario where we willfully vaccinate billions of people while telling them this isn&rsquot happening.&rdquo

Unfortunately, the prevailing attitude seems to be that the &ldquorace to get the public vaccinated&rdquo justifies taking these extra risks.

In mid-November, after the Jerusalem Post told readers that &ldquowhen the world begins inoculating itself with these completely new and revolutionary vaccines, it will know virtually nothing about their long-term effects,&rdquo an Israeli hospital director argued that it&rsquos not worth waiting two more years to ferret out mRNA vaccines&rsquo &ldquounique and unknown risks&rdquo or potential long-term effects.

In the U.S., enthusiasm for mRNA technology is similarly unfettered. Just a few days after the CDC released updated data showing that more than 2,200 deaths of individuals who had received either the Pfizer or Moderna mRNA vaccines had been reported as of Mar. 26 , The Atlantic praised the technology, suggesting that the &ldquoingenious&rdquo synthetic mRNA technology behind Pfizer&rsquos and Moderna&rsquos COVID vaccines represented a &ldquobreakthrough&rdquo that could &ldquochange the world.&rdquo

Rather than dismiss the prospect of retro-integration of foreign DNA as a &ldquoconspiracy theory,&rdquo scientists should be conducting studies with the mRNA-vaccinated to assess actual risks.

For example, Corrigan believes that while in vitro data in human cell lines (one of the data sources examined by the Harvard-MIT researchers) offer &ldquoair tight&rdquo results, there is still a need to conclusively demonstrate real-life genomic alteration through &ldquoPCR, DNA sequencing or Southern Blot &hellip on purified genomic DNA of COVID-19 patients&rdquo &mdash and vaccinated individuals.

Yet instead of addressing these research gaps, companies are salivating over the potential to use human-edited mRNA to &ldquocommandeer our cellular machinery&rdquo and &ldquomake just about any protein under the sun.&rdquo

A March 10 press release pronouncing mRNA vaccines the clear winners of the COVID-19 vaccine race noted that all major pharmaceutical companies are now &ldquotesting out the [mRNA] technology by entering into license agreements and/or collaboration with well-established RNA companies.&rdquo

In old Disney cartoons, viewers often witnessed Donald Duck&rsquos rich uncle, Scrooge McDuck&rsquos, &ldquobulging eyes [turn] into oversized Vegas slot machine dollar signs&rdquo when contemplating opportunities to increase his already immense wealth.

Judging by pharmaceutical company executives&rsquo willingness to overlook mRNA vaccines&rsquo long-term &mdash and possibly multigenerational &mdash risks, they must be similarly entranced by dollar-sign visions of a never-ending pipeline of &ldquoplug and play&rdquo mRNA products.

LifeSiteNews has produced an extensive COVID-19 vaccines resources page. View it here.

© April 8, 2021 Children&rsquos Health Defense, Inc. This work is reproduced and distributed with the permission of Children&rsquos Health Defense, Inc. Want to learn more from Children&rsquos Health Defense? Inscrie-te for free news and updates from Robert F. Kennedy, Jr. and the Children&rsquos Health Defense. Ta donation will help to support us in our efforts.


Laboratory-designed plasmids contain a small number of genes that help transformation . Acestea includ:

  • Un originea replicării . This is the specific sequence of nucleotides where DNA replication begins.
  • A multiple cloning site. This site contains recognition sites for specific restriction enzymes. These restriction enzymes can be used to ‘cut’ the plasmid so foreign DNA can be ‘pasted’ in by ligation .
  • A resistance gene . This gene codes for a protein the bacteria need in order to survive in a particular growth medium , for example, when a specific antibiotic is present.

Cloning DNA into a vector, step by step

To introduce foreign DNA into a circular vector, scientists carry out a three-step process:

Scientists first remove their gene of interest from the DNA sequences on either side of it. They can use restriction enzymes to do the cutting. These enzymes, which came originally from bacteria, cut DNA at specific sites in the sequence. If there’s not enough DNA for successful cutting or no suitable restriction enzyme recognition sites around the gene, scientists first use polymerase chain reaction (PCR) to make many more copies. By designing their PCR primers carefully, they can introduce new restriction sites on either side of the copied DNA sequence.

Opening up the vector

Next, scientists make a cut in the circular DNA sequence of the vector. They use the same restriction enzymes as they used to cut out the gene in step 1. This turns the vector into a linear molecule and makes it ready to accept the new piece of DNA.

Sticking the vector and the gene together

The final step in cloning is to incorporate the DNA of interest into the vector. Scientists mix the gene and the opened vector together with a bacterial enzyme called DNA ligase . The ligase sticks DNA ends together to form a single circular molecule that includes both the vector and the gene.

Find out more in these articles:


Human Aborted Fetal Cell DNA in Vaccines.

Take a look at the vaccine excipient and media summary compiled by the CDC (this is where you will find the ingredients and other biological and chemical materials used in the production of vaccines).

Much of what is listed in the table is not self-explanatory and requires additional research and investigation. Ultimately, these terms relate to chemical substances, antibiotics, and human or animal cells and serums (a fraction of sânge) used to manufacture each vaccine. While they are not labeled as “ingredients”, residual amounts of the excipients and media end up in the vaccines your child receives at the doctor’s office, and are therefore also unintended ingredients and/or known contaminants.

An “excipient” is an additive which helps to stabilize and/or enhance the therapeutic activity of active ingredients in a drug or vaccine. “Media” refers to growth mediums or cell cultures, which is a mixture of ingredients, in which vaccine antigens are grown.

Aborted fetal cells.

When you read “cell culture materials” in the image above, this is where cells from aborted fetuses/unborn children factor into the manufacturing process of vaccines. Where’s the dovezi for this?

“There are two particular fetal cell lines that have been heavily used in vaccine development. They are named according to the laboratory facilities where they were developed. One cell line is known as WI-38, developed at the Wistar Institute in Philadelphia, PA. The other is MRC-5, developed for the Medical Research Council in England.”

– Right to Life, Life Notes: Vaccines, Abortion, & Fetal Tissue.

Take a look at this informative article by ProCon.org which provides descriptions of some of the vaccine excipients and media. Then go to the MMR vaccine. Under the heading titled, “Gross Mediums and Process Ingredients”, you’ll find “WI-38 human diploid lung fibroblasts”.

From the link, this is the description of “WI-38”:

“Winstar Institute 38, human diploid lung fibroblasts derived from the lung tissues of a female fetus aborted because the family felt they had too many children in 1964 in the United States.”

The WI-38 fetus was aborted at three months (or about 14 weeks) gestation. These cells are even available for purchase, here.

Now let’s go to the Pentacel vaccine (DTaP, Polio, Hib). Here, alongside aluminum phosphate, formaldehyde, polysorbate 80, and more, you’ll find “MRC-5 cells“. Here’s the description:

“Medical Research Council 5, human diploid cells (cells containing two sets of chromosomes) derived from the normal lung tissues of a 14-week-old male fetus aborted for “psychiatric reasons” in 1966 in the United Kingdom, Eagle’s Basal Medium in Earle’s balanced salt solution with bovine serum.”

Not just two abortions.

At this point, defenders of vaccines will state that these cell lines were taken from just two fetuses, which were aborted many years ago.

Unfortunately, there is evidence that over 80 fetuses were aborted for the research and development of the rubella vaccine alone:

“The rubella virus clinically named RA273 (R=Rubella, A=Abortus, 27=27th fetus, 3=3rd tissue explant) was then cultivated on the WI-38 aborted fetal cell line. A later research paper by Stanley Plotkin would reveal that 40 more babies were aborted after RA273 was successfully isolated, with virus strains taken from 34 of them.[13A] This means a total of over 80 separate, elective abortions recorded were involved in the research and final production of the present day rubella vaccine: 21 from the original WI-1 through WI-26 fetal cell lines that failed, plus WI-38 itself, plus 67 from the attempts to isolate the rubella virus.”

New cell lines.

Due to the fact that WI-38 and MRC-5 cannot be used indefinitely, new cell lines are being developed. This means that new elective abortions are currently taking place for the continued production of more and more vaccines.

From the study linked above, published in 2015:

“We obtained 9 fetuses through rigorous screening based on carefully specified inclusion criteria… Walvax-2 was derived from a fetal lung tissue, similar to WI-38 and MRC-5, and was obtained from a 3-month old female fetus aborted because of the presence of a uterine scar from a previous caesarean birth by a 27-year old healthy woman.”

“The tissues from the freshly aborted fetuses were immediately sent to the laboratory for the preparation of the cells.”

Residual DNA fragments in vaccines.

Apart from any moral conflict one might have over the use of aborted fetuses for vaccine production, we need to remember that DNA from the aborted fetuses actually ends up în vaccines as a contaminant.

“The issue of concern is that many common vaccines were developed using cell lines that originally were cells taken from electively aborted babies. The vaccines themselves do not contain fetal cells, but there are significant “residual” biological components from the fetal cells that have been assimilated into the vaccine, including cell proteins and measurable portions of fetal DNA.”

Independent research has found that vaccines manufactured in human fetal cell lines contain “unacceptably high levels of fetal DNA fragment contaminants”. These fragments, while in trace amounts, are still biologically active once injected into the body of another individual via vaccine. Vaccines elicit systemic immune activation and inflammatory responses, which increases the likelihood of foreign DNA uptake into the host’s genome. And in fact, it has been found that fetal cell DNA can spontaneously integrate into the genome of the vaccinated person.

In addition to this, a disturbing correlation has been found between the use of aborted fetal cell produced vaccines and sudden increase in the rate of autistic spectrum disorder.

“In 1979, coincident with the first autism disorder change point, vaccine manufacturing changes introduced human fetal DNA fragments and retroviral contaminants into childhood vaccines (Victoria et al., 2010). While we do not know the causal mechanism behind these new vaccine contaminants and autistic disorder, human fetal DNA fragments are inducers of autoimmune reactions, while both DNA fragments and retroviruses are known to potentiate genomic insertions and mutations (Yolkenetal.,2000 Kurth1998 USFood and Drug Administration 2011).”

What we know.

For a more comprehensive list, visit Cogforlife.org.

Human babies have been and are still being sacrificed for use in the research and development of vaccines. DNA from these aborted fetuses is present în vaccines, and independent scientific research has found that there is the potential for insertional mutagenesis to occur within the vaccinated person. Unfortunately, vaccine manufacturers do not test their products for mutagenic potential. The long term adverse effects of using aborted fetal cells for vaccine production are virtually unknown, yet millions of these vaccines are administered every day.

Screen shot of the Pentacel vaccine package insert.

*The ultrasound image used for this article is the image of my daughter at 14-weeks gestation.